СПОСОБ ИЗУЧЕНИЯ ХРОНИЧЕСКОГО СЕПТИЧЕСКОГО ПРОЦЕССА НА ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ Российский патент 1999 года по МПК G09B23/28 

Изобретение относится к медицине, а именно к хирургии, может быть использовано для изучения длительных вялотекущих воспалительных заболеваний.

Известны различные способы создания септических состояний в эксперименте. Недостатками этих способов являются, во-первых, кратковременность эксперимента, во-вторых, невозможность управлять экспериментом, регулировать степень интоксикации бактериальной инвазии.

Введением каловой взвеси в брюшную полость в сочетании с перфорацией червеобразного отростка вызывали перитонеальный сепсис. Однако существенными недостатками этого метода являются необходимость полостной операции, использование крупных животных (собак), непредсказуемость эксперимента (1).

Хроническое воспаление вызывают введением в подкожную клетчатку стерильных инородных тел; через 1-2 дня в полость сформировавшегося абсцесса дополнительно вводят до 200-400 мил микробных тел золотистого стафилококка, при этом генерализация процесса и сепсиса не происходит. Замена флоры на грамотрицательную в 70% способна вызвать сепсис (2). Однако недостатком метода остается использование собак и при развитии сепсиса - 100% летальность.

Известен так же способ регулирующий степень заражения и интоксикации у мелких лабораторных животных (крыс), при котором вводят полный адъювант Фрейда в качестве сенсибилизирующего средства, с последующим введением в брюшную полость различного количества разрешающих доз золотистого стафилококка (3). Этот способ принят за прототип. Однако описанный способ вызывает реакцию двух типов: 1) септический шок, что приводит к летальному исходу; 2) простой воспалительной реакции без септических проявлений. Отсутствие получения длительного прогнозируемого, без гибели животных, сепсиса ограничивает его применения.

Применяемые способы бактериального заражения животных рассчитаны на создание модели сепсиса удобной для изучения. Экспериментальные исследования сепсиса позволили выявить факт преимущественного поражения кровеносной и лимфатической системы (4). В лимфатических узлах наблюдается подавление бласттрансформации, агрегация и деформация лимфоцитов, лимфостаз (5). Уменьшается удельная плотность микроциркуляторного русла (6). Бактерии выявляются в плазме, нейтрофилах, макрофагах (7). Такой механизм поражения крови и лимфы характерен для всех моделей сепсиса. Из этого следует, что наиболее значимым способом изучения сепсиса является изучение поражающего действия микроорганизмов на кровь и лимфу.

Задачей изобретения является создание эффективного и атравматического способа изучения проявления длительного сепсиса.

Задача решается тем, что в способе создания модели хрониосепсиса производят сенсибилизацию, а затем заражение мелкого лабораторного животного (крысы) золотистым стафилококком, подкожно, с последующим ежедневным массажем места инъекции и исследованием крови, лимфы и лимфоузлов.

Введением подкожно Альфа-токсина, производного золотистого стафилококка, достигается сенсибилизация животного (крысы), которая позволяет, во-первых, усилить токсическое действие микробной культуры, во-вторых, упростить способ - ограничить место введения подкожной клетчаткой, т.е. создание микробного резервуара - длительного источника инфекции. Механическое повреждение тканей микроциркуляторного русла нарушает гистиогематологический барьер и создает условия для проникновения бактерий из микробного резервуара в кровяное и лимфатическое русло. Последующий компрессионный массаж микробного резервуара дает возможность реализовывать вышеизложенные предпосылки в эффект насыщения крови и лимфы бактериями. Применение специальной методики получения гомогенизата клеточной массы позволяет создать бактериологическое обогащение биологической жидкости и после инкубации в термостате на питательной среде получить и идентифицировать рост культуры микроорганизма. При этом все лабораторные животные по окончании опытов оставались живыми. Таким образом, предложенный способ создания экспериментального хрониосепсиса имеет ряд преимуществ перед другими экспериментальными моделями.

Способ осуществляют следующим образом.

Животных вводят в наркоз с помощью тиопентал-натрия, в расчете 0,013 мг/г веса, посредством введения его внутриплеврально. Животных фиксируют на специальном пластиковом столе, в положении на животе. На спине выбривают шерсть. Кожу тщательно обрабатывают спиртом, соблюдая правила асептики и антисептики (8), и подкожно вводят 0,05 мкл альфа-токсина. Через 24 часа вводят подкожно культуру золотистого стафилококка - 60 миллиардов микробных тел (в то же место, что и альфа-токсин). Массаж проводят компрессионный, пневматический, с помощью манжеты - аппарата для измерения кровяного давления у детей. Давление в манжете создают в пределах 110-130 мм рт. ст. Экспозиция давления - 1 мин. Пауза релаксации - 30 сек. Время массажа - 10 мин. Забор крови в количестве 3 мл, с тщательным соблюдением асептики и антисептики производят из хвостовой вены. Лимфоузлы брыжеечные и парааортальные забирают в результате оперативного вмешательства, путем чревосечения.

Способ прошел экспериментальное испытания на кафедре оперативной хирургии Ивановского государственного медицинского института на 25 крысах линии Вистар, самцы, весом до 180 гр, возрастом 6-10 мес. При проведении эксперимента использовался альфа-токсин серии 128/9 Института микробиологии и эпидемиологии им. Гамалея, в дозе 0,05 мкл. Золотистый стафилококк - использовали штамм 13407, выделенный от больного сепсисом. Для развития сепсиса у грызунов требуется инокуляция в организм нескольких миллиардов микробных тел. Используемый штамм золотистого стафилококка высевают на кровяной агар и инкубируют в термостате при температуре 37^oС в течение 24 часов. В дальнейшем производят смыв культуры и измеряют количество микробных тел на фотоэлектрокалориметре, при длине световой волны 750 нм, сопоставляя полученные величины со стандартами мутности. Разведением культуры физиологическим раствором добиваются содержания в 1 мл взвеси 60 миллиардов микробных тел.

После создания модели сепсиса, через 24 часа у всех крыс производился забор крови, у 5 крыс дополнительно брыжеечных и парааортальных лимфоузлов. Через 48 часов у всех крыс производился только забор крови. Через 72 часа у всех крыс производился забор крови, у 5 крыс дополнительно - брыжеечных и парааортальных лимфоузлов. Через 96 часов у всех крыс производился только забор крови. Через 120 часов у всех крыс производился забор крови, у 5 крыс дополнительно - брыжеечных и парааортальных лимфоузлов. Из полученных брыжеечных и парааортальных лимфоузлов готовились препараты и исследовались с помощью световых микроскопов (МБИ-15 и Люмам И-З), для проведения иммуногистохимических исследований лимфоузлы анализировали в комбинированном электронном микроскопе СЭМ + ТЭМ типа Hitashi TS-300. Для документации данных производили фотосъемку препаратов. Для бактериологического обогащения кровь брали из хвостовой вены (3 мл), центрифугировали со скоростью 1500 об/мин. Клеточную массу центрифугата разрушали путем цитолиза (гемолиза). К центрифугату добавляли теплой (37 гр.ц.) бидистилированной воды (соотношение центрифугата и воды 1:1) и далее помещали в контейнер магнитной мешалки. В контейнер помещались никелированные шарики диаметром 1 мм, с помощью которых при движении происходит разрушение клеточных мембран и происходит эффект гомогенизации. Полученный гомогенизат засевали на питательные среды.

Изучение гемокультуры производили после бактериологического обогащения и высева ее на питательную среду. Рост был обнаружен через 72 часа и был в 14% от доли посевов; через 96 часов рост был в 33,8% случаев; через 120 часов - в 57% случаев.

Гистологические препараты форменных элементов крови в трансмиссионной СЭМ показали, что только мононуклеарные фагоциты (моноциты и макрофаги) содержали специфические включения черного цвета, т.е. прокрашенные осмиевой кислотой специфической колесообразной формы. При рассматривании объектов локализация последних наблюдалась в цитоплазме клеток в окружении лизосом или среди пластин комплекса Гольджи. Отдельные колониеобразные фрагменты так же были отмечены в пределах гранулярной эндоплазматической сети и митохондриальных комплексов.

Развитие герментативных центров лимфатических узлов вызывается антигенной стимуляцией, которая отсутствует у интактных животных. Популяции клеток лимфоидного ряда герментативных центров чрезвычайно активны митотически в условиях воспалительного процесса, в частности при сепсисе. Моноклональные антитела PCNA реагируют с циклином лимфоидных клеток, что свидетельствует о том, что данные клетки находятся не в Go-фазе, т.е. проявляют пролиферативную активность.

Пролиферативная активность клеток лимфоидного ряда в структуре компартмета лимфатического узла:
исходные данные - 5,6 + 0,11;
через 24 часа - 9,7 + 0,07;
через 48 часов - 12,14 + 0,03;
через 72 часа - 7,23 + 0,05;
через 96 часов - 3,4 + 0,01;
через 120 часов - 1,8 + 0,03.

При исследованиях в СЭМ нативных препаратов лимфатических узлов в просвете синусов обнаружены: - через 24 часа конгломераты клеточного детрита, окруженные лимфоцитами и макрофагами, обилие малых активных лимфоцитов, обилие лимфобластов; - через 96 часов в отдельных макрофагах обнаружены включения по конфигурации, напоминающие колонии золотистого стафилококка, в отдельных случаях полные дегенеративные изменения их клеточной структуры.

Таким образом, предлагаемый способ имеет следующие преимущества по сравнению с известными:
- в отличие от введения подкожно адъюванта Фрейда, а затем разрешающей дозы золотистого стафилококка предлагаемый способ позволяет выявить генерализацию бактериального фактора при 100% выживаемости экспериментальных животных - белых крыс;
- способ позволяет изучать динамику сепсиса, изменения внутренних органов при длительных септических состояниях;
- создание вышеописанной модели сепсиса менее травматичен, чем способы заражения животных через брюшную полость.

Способ предполагает внедрение его в научные исследовательские лаборатории по изучению экспериментального сепсиса.

Источники информации
1. Щербакова Э.Г., и др. Венозное кровообращение и лимфообразование. Тезисы докладов 3 Всесоюзного симпозиума. -Таллин: 1985, с.223 и 224.

2. Щербакова Э.Г. и др. Лимфатические аспекты антибиотикотерапии. Клиническая лимфология, сборник научных трудов. -М.: 1986, с. 31-38.

3. Минасян Л.А. Лимфатические методы в комплексном лечения перитонита. Дисс.док. мед. наук. -Ереван: 1991, с. 279.

4. Покровский В.И., Гордиенко С.П., Литвиненко В.И. Иммунология инфекционного процесса. -М.: 1994, c. 305.

5. Магомедов М.М. Лимфотромбоз, тромболимфангит диагностика и лечение. Дисс. док., мед.наук. -М.; 1995.

6. Никоненко Б.В, Адамбеков Д.А. Модели и подходы для изучения иммунитета при инфекциях. В кн.: Иммунология инфекционного процесса. -М.; 1994, с. 29-39. Белоцкий С.М., Суслов А.П., Литвинов В.И. Факторы естественной резистентности при инфекциях. В кн: Иммунология инфекционного процесса. -М.: 1994, с. 72-89. Zwilling B.S., Vespa К., Massie H. Regulation of 1-A expression of mirin peritoneal macrophages differences linked to the BCG gene // J Immunol - 1987 vol 138, p. 1372-1376.

7. Фонтален Л. Н., Иммунологическая толерантность при инфекциях. В кн: Иммунология инфекционного процесса. -М.; 1994. с. 29-39.

8. Шалимов С.А., Радзиховский А.П., Кейсевич Л.В. Руководство по экспериментальной хирургии. -М.: Медицина, 1 989, 272 с.

Изобретение относится к области экспериментальной медицины и может быть использовано для изучения вялотекущих воспалительных заболеваний. Предварительно вводят подкожно альфа-токсин. Затем осуществляют подкожное введение золотистого стафилококка. Производят генерализацию инфекционного агента посредством ежедневного массажа места инъекции. Проводят морфологический и гистохимический анализ крови, лимфы и лимфоузлов. Способ позволяет выявить генерализацию бактериального фактора при 100%-ной выживаемости экспериментальных животных и проводить длительное изучение динамического процесса сепсиса.

Способ изучения хронического септического процесса на лабораторных животных, включающий подкожное введение золотистого стафилококка после предварительного подкожного введения альфа-токсина с последующей генерализацией инфекционного агента посредством ежедневного массажа места инъекции, а затем проведение морфологического и гистохимического анализа крови, лифмы и лимфоузлов.