СПОСОБ КОРРЕКЦИИ ЭНДОТЕЛИАЛЬНОЙ ДИСФУНКЦИИ АЗИТРОМИЦИНОМ ПРИ МОДЕЛИРОВАНИИ ХРОНИЧЕСКОГО ГРАМПОЛОЖИТЕЛЬНОГО СЕПСИСА Российский патент 2010 года по МПК G09B23/28 A61K31/7048 A61P43/00 

Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной кардиофармакологии.

Наиболее близким к заявленному решению является «Способ коррекции эндотелиальной дисфункции мидекамицином при L-NAME-индуцированном дефиците оксида азота» - патент на изобретение №2353370.

Основным недостатком данного способа является одностороннее рассмотрение патогенетического звена развития и коррекции эндотелиальной дисфункции (ЭД), при котором учитывалась лишь одна сторона механизма развития ЭД - дефицит оксида азота, вызванной неселективным блокатором NO-синтазы: N-нитро-b-аргинин метиловым эфиром (L-NAME). Оксид азота (NO) - ведущий гуморальный эндотелиальный модулятор дилатации, релаксирующий сосуды, который вырабатывается, эндотелиоцитами. Дефицит NO приводит к развитию эндотелиальной дисфункции, выражающейся в аномальной сосудистой реактивности. Точкой приложения терапевтического воздействия при ЭД в данном исследовании является восстановление дефицита оксида азота через ингибирование деградации NO.

Другими же точками приложения терапии ЭД являются восстановление равновесия провоспалительных и противовоспалительных медиаторов; прооксидантных и антиоксидантных механизмов, обеспечивающими в норме оптимальное течение всех эндотелийзависимых процессов.

Для устранения этого недостатка моделировали эндотелиальную дисфункцию на фоне развития хронического грамположительного сепсиса и использовали макролидный антибиотик азитромицин в концентрации 30 мг/кг для коррекции возникших функциональных нарушений.

Механизм эндотелиальных поражений при хрониосепсисе комплексный: наличие микробных клеток в кровотоке приводит к активации свертывания крови, системы комплемента, клеток крови, в первую очередь макрофагов и нейтрофилов, что сопровождается синтезом и выделением широкого спектра биологически активных веществ. Суммарный эффект этих процессов выражается в активации нейтрофилов и тромбоцитов, повышении их адгезивных свойств, дегрануляции и выделении кислородных радикалов, протеаз. Активация макрофагов сопровождается также выделением биологически активных соединений посредством стимуляции транскрипционного ядерного фактора каппа В (NF-kB). Это ведет к повышению выработки цитокинов, фактора активации тромбоцитов, колониестимулирующих факторов, метаболитов цикла арахидоновых кислот, тромбоксанов, простагландинов, лейкотриенов, активации Т-лимфоцитов с выделением из них интерлейкина-2, гамма-интерферона, колониестимулирующих факторов. В микроциркуляторном русле резко возрастает активность фактора Виллебранда как агента адгезии и агрегации

лейкоцитов. Нарушается функция свертывающей системы крови, включая нарушение выделения тромбомодулина и повреждение эндотелиальных рецепторов протеина-С, нарушение сигнальной связи между активирующим протеиназу рецептором-1 и другими механизмами. Стимулируется миграция в стенку сосуда моноцитов и Т-лимфоцитов. Известно, что воспалительная реакция сопровождается образованием провоспалительных цитокинов, стимулирующих генерирование свободных радикалов кислорода (СРК), вызывающих повреждение эндотелия. СРК (особенно супероксид-анион - O²) обладают способностью тормозить экспрессию и снижать активность eNOS, а также связывать и инактивировать NO, уменьшать его содержание в клетке. Сдвиг физиологического равновесия между NO и O² в сторону последнего нередко ведет к образованию высокотоксичного пероксинитрита (ONOO-), вызывающего повреждение мембран и ДНК эндотелиальной клетки, мутации, апоптоз. Указанные факторы вызывают нарушения регуляции или прямые повреждения эндотелия.

Таким образом, учитывая вышесказанное, вполне обоснованным является применение при состояниях, связанных с дефицитом NO, препаратов с противовоспалительными и антиоксидантными свойствами.

Исключительно актуальным является вопрос о плейотропных эффектах азитромицина - его антиоксидантном действии и его влиянии на иммунную систему, проявляющемся в диапазоне обычных доз. Макролидные антибиотики обладают рядом ценных фармакологических эффектов, направленных на модуляцию медиаторов воспаления, синтезируемых макрофагами, нейтрофилами и другими клетками.

Так, азитромицин накапливается в высоких концентрациях в нейтрофилах и переносится ими в инфекционный очаг, где под действием ряда медиаторов воспаления, антигенов и других стимулов происходит выход антибиотика из клеток, что приводит к созданию повышенных концентраций препарата в очаге инфекции. Антибиотик также накапливается в фибробластах, секретирующих и связывающих фибронектин, который, как известно, облегчает адгезию микроорганизмов на эпителиальных клетках. В случае выделения азитромицина фибробластами адгезия снижается, что является дополнительным фактором антимикробного эффекта препарата. Помимо антимикробного воздействия азитромицин подавляет образование форм активированного кислорода в нейтрофилах, адгезированных на эндотелии сосудов при воспалении, и таким образом уменьшает повреждение сосудов, вызванное активированными лейкоцитами. Макролиды подавляют синтез интерлейкина-1, 6, 8 макрофагоподобными клетками. Антибиотики снижают экспрессию адгезинов комплекса МАС-1 на мембранах нейтрофилов, снижают цитокинзависимую индукцию гистидиндекарбоксилазы, что приводит к снижению уровня гистамина и, соответственно, уменьшению воспалительной реакции. Макролиды снижают в клетках уровень информационных РНК для интерлейкина 1-β, интерлейкина-8. Азитромицин ослабляет повреждающее действие физиологически активных фосфолипидов: фактора активации тромбоцитов (ФАТ), лизо-ФАТ и лизофосфатидилхолина на эпителий, что дает возможность сделать вывод о протективном действии азалидов при бактериальных инфекциях, опосредованных активными формами кислорода, которые образуются в фагоцитирующих клетках, активированных фосфолипидами (Никитин А.В. Антибиотики как регуляторы механизмов воспалительных реакций организма при инфекционном процессе // Антибиотики и химиотерапия, 1998, N9, стр.2-4, Карпов О.И. Макролиды: новая парадигма: фармакодинамика/иммуномодуляция. Клин. фармакол. и тер., 2005; 14 (5): 20-23).

Азитромицин уже на раннем этапе способен подавлять продукцию интерлейкина-8 и фактора некроза опухоли α, поддерживающих воспаление и подавляющих синтез NO, что позволяет его использовать для эндотелиопротекции.

Задачей изобретения является способ коррекции эндотелиальной дисфункции при моделировании хронического грамположительного сепсиса, включающий использование макролидного антибиотика азитромицина в дозе 30 мг/кг.

Задача достигается тем, что на фоне моделирования эндотелиальной дисфункции в эксперименте, достигающейся предварительной сенсибилизацией мелкого лабораторного животного (крысы линии Wistar весом 200-300 г), путем введения 0,1 мл стафилококкового анатоксина подкожно с последующим введением через 24 часа взвеси золотистого стафилококка подкожно - в дозе 60 миллиардов микробных тел /1 мл и последующей генерализацией инфекционного агента посредством ежедневного массажа места инъекции, проводится ее коррекция внутрижелудочным введением обладающего антиоксидантным и противовоспалительным действием макролида азитромицина (субстанция азитромицина моногидрата, серия 0001/2 (Chem-East LTD) в дозе 30 мг/кг в сутки, который приводит к активизации коррекции эндотелиальной дисфункции при экспериментальном хроническом грамположительном септическом процессе.

СПОСОБ ОСУЩЕСТВЛЯЕТСЯ СЛЕДУЮЩИМ ОБРАЗОМ

Опыты проводят на крысах самцах линии Wistar массой 200-300 г. Соблюдая правила асептики и антисептики, подкожно вводят 0,1 мл стафилококкового анатоксина (анатоксин стафилококковый очищенный адсорбированный производства Научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи, Москва). Через 24 часа вводят подкожно культуру золотистого стафилококка (штамм 603) - 60 миллиардов микробных тел / 1 мл (в то же место, что и анатоксин). Ежедневный массаж проводят компрессионный, пневматический, с помощью манжеты - аппарата для измерения кровяного давления у детей (Тонометр «ВК-2005пед», «Доктор Тон», Китай). Давление в манжете создают в пределах 110-130 мм рт.ст. Экспозиция давления - 1 мин. Пауза релаксации - 30 сек. Время массажа - 10 мин.

На второй день и далее ежедневно, после заражения животного азитромицин в исследуемой группе вводят однократно внутрижелудочно в дозе 30 мг/кг. Через 6 суток от начала эксперимента под наркозом (этаминал-натрия 40 мг/кг) вводят катетер в левую сонную артерию для регистрации показателей артериального давления (АД), болюсное введение фармакологических агентов осуществляют в правую бедренную вену. Показатели гемодинамики: систолическое артериальное давление (САД), диастолическое артериальное давление (ДАД) и частоту сердечных сокращений (ЧСС) измеряют непрерывно посредством датчика и компьютерной программы «Biopac». Функциональные пробы: эндотелий зависимая вазодилатация (ЭЗВ) - внутривенное введение ацетилхолина (АХ) в дозе 40 мкг/кг, эндотелий независимая вазодилатация (ЭНЗВ) - внутривенное введение нитропруссида натрия (НП) в дозе 30 мкг/кг. Забор крови в количестве 5 мл, с тщательным соблюдением асептики и антисептики производят из правого желудочка на 6-е сутки с последующим определением количества фактора некроза опухоли (ФНО-α) (методом ИФА) и бактериологическим посевом крови. Для подтверждения диагноза «сепсис», вызванного именно Staphylococcus aureus 603, взятая кровь засевалась в стерильный сахарный бульон в соотношении 1 мл крови к 10 мл сахарного бульона, после чего материал инкубировался 24 часа при температуре 37°С. На следующий день проводился посев на мясопептонный агар штриховым методом с целью получения изолированных колоний (24 часа, 37°С), после чего культура идентифицировалась как исходная (Staphylococcus aureus 603) с помощью определения факторов патогенности и фаготипа. Кроме того, 0,1 мл крови засевали штриховым методом на стандартную чашку Петри с МПА, инкубировали 24 часа, t=37°C, после чего подсчитывали количество колониеобразующих единиц стафилококка в 0,1 мл крови.

При статистической обработке данных рассчитывали среднее значение, величину стандартного отклонения. Различия считали достоверными при ρ<0,05.

ПРИМЕР КОНКРЕТНОГО ВЫПОЛНЕНИЯ.

Оценку состояния реактивности сосудистой стенки осуществляли после проведения функциональных сосудистых проб, используя расчетный показатель - коэффициент эндотелиальной дисфункции (КЭД) по методике, разработанной в нашей лаборатории П №23 01015.

Мы рассчитывали специальный показатель, характеризующий степень эндотелиальной дисфункции, являющийся отношением площади треугольника над трендом реакции восстановления АД в ответ на введение НП к площади треугольника над трендом реакции восстановления АД в ответ на введение АХ у каждого животного интактной группы и крыс после моделирования хрониосепсиса и получили разницу данного показателя в 2 раза - соответственно 1,1 у интактных и 2,1 на 6-е сутки у инфицированных животных.

Таким образом, для оценки влияния АХ и НП при ЭЗВ и ЭНЗВ нами использовано это отношение как показатель коррекции эндотелиальной дисфункции. В группе, где на фоне хронического септического процесса вводился азитромицин в дозе 30 мг/кг, это отношение соответствовало значению 1,3±0,1 (таблица 1).

Уровень в плазме важнейшего регулятора воспалительных и иммунных процессов - провоспалительного цитокина ФНО-α в интактной группе составлял 16,7±0,5 пг/мл. Моделирование хрониосепсиса вызывало закономерное повышение ФНО-α до 75,0±3,5 пг/мл. Введение азитромицина приводило к значительному снижению уровня данного цитокина и составило 35,7±4,0 пг/мл, также наблюдалось снижение количества колониеобразующих единиц с 137±0,2 до 55,8±0,7 при бакпосеве.

Таким образом, полученные результаты позволяют констатировать активизацию коррекции эндотелиальной дисфункции азитромицином в дозе 30 мг/кг.

Изобретение относится к экспериментальной медицине, в частности к экспериментальной кардиофармакологии, и может быть использовано для коррекции эндотелиальной дисфункции. Для этого в эксперименте на крысах моделируют дисфункцию путем предварительной сенсибилизацией животного стафилококковым анатоксином в дозе 0,1 мл подкожно. Затем через 24 часа вводят в то же место, что и анатоксин, взвесь золотистого стафилококка подкожно в дозе 60 миллиардов микробных тел в 1 мл. Далее, для последующей генерализации инфекционного агента, проводят ежедневный массаж места инъекции. На фоне этого вводят макролидный препарат азитромицин внутрижелудочно в дозе 30 мг/кг/сутки. Способ обеспечивает активизацию коррекции эндотелиальной дисфункции. 1 табл.

Способ коррекции эндотелиальной дисфункции, отличающийся тем, что в эксперименте на крысах моделируют дисфункцию путем предварительной сенсибилизацией животного стафилококковым анатоксином в дозе 0,1 мл подкожно с последующим введением через 24 ч в то же место, что и анатоксин, взвеси золотистого стафилококка подкожно в дозе 60 млрд микробных тел в 1 мл, и последующей генерализацией инфекционного агента посредством ежедневного массажа места инъекции, и на фоне этого вводят макролидный препарат азитромицин внутрижелудочно в дозе 30 мг/кг/сутки.