СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ ВЛИЯНИЯ МЕДИЦИНСКОЙ ПИЯВКИ НА СТИМУЛЯЦИЮ РОСТА НЕРВНЫХ ВОЛОКОН В КУЛЬТУРЕ ТКАНИ Российский патент 2000 года по МПК G09B23/28 

Изобретение относится к биологии, экспериментальной медицине, гирудологии, гирудотерапии, практической медицине.

За последние два десятилетия с помощью культуры нервной ткани показано существование нейротрофических факторов (НТФ), которые являются низкомолекулярными пептидами, обладающими высокой специфичностью в отношении нейронов центральной и периферической нервной системы.

Добавление НТФ в наномолярных концентрациях к питательной среде в культуре ткани вызывает выраженный биологический эффект. В настоящее время НТФ делят на: 1. нейронотрофические - поддерживающие выживание и дальнейший рост нейронов [1] ; 2. нейрит-стимулирующие - способствующие росту отростков нейронов [1]; 3. ингибирующие [2].

У НТФ с нейронотрофическими и нейрит-стимулирующими свойствами часто наблюдается перекрытие этих свойств. Видимо, все нейрит-стимулирующие факторы являются в какой-то степени нейронотрофическими, так как первично выживание нейронов, а затем рост их отростков.

В основном НТФ выделяют из тканей организма, являющихся тканями-мишенями для данного типа нейронов. Наиболее изученный НТФ - фактор роста нервов (ФРН) - можно получить из подчелюстных желез, а также многих паренхиматозных органов, таких как сердце, матка, плацента, различные железы [1]. Все эти органы и ткани иннервируются симпатическими ганглиями, нейроны которых являются зависимыми от ФРН.

Мы предположили, что выраженное влияние гирудотерапии на стимуляцию роста или восстановление нейронов связано с наличием неизвестных ранее НТФ в подчелюстных железах медицинской пиявки, наличием их в секрете, который вводится млекопитающему или человеку в процессе акта сосания пиявки [3, 4].

В качестве прототипа предлагаемого изобретения использовали способ моделирования кустиковидного тканевого рецептора в культуре ткани по А.С. СССР N 1695367 (приоритет от 09.11.88 г. [5].

Способ реализуется следующим образом. Чувствительный ганглий эмбриона курицы выращивается в культуре ткани 3 - 4 суток на коллагеновой подложке с добавлением нейрит-стимулирующего белка в дозе 2•10^-9 - 4•10^-9 г/мл.

Преимущество способа состоит в том, что с его помощью удается повысить воспроизводимость модели кустиковидного тканевого рецептора, который является наиболее распространенным рецептором в организме человека и животных.

В отличие от способа-прототипа вместо нейрит-стимулирующего белка в культуральную среду спинно-мозговых гаглиев 10-11-дневных куриных эмбрионов вводится водный экстракт лиофильно высушенной пиявки Гирудо медициналис (Hirudo medicinalis).

Для лучшего понимания сущности изобретения приводим примеры конкретного моделирования влияния медицинской пиявки на стимуляцию роста нервных волокон в культуре ткани.

Пример 1.

Состав и приготовление питательной среды.

В работе использовали среду с pH 7.2 следующего состава: 35% - раствор Хенкса, 35% - среда Игла, 25% - фетальная сыворотка теленка с добавлением глюкозы (60 мг%), инсулина (0,5 ед/мл), пенициллина (100 ед/мл). Куриный эмбриональный экстракт готовили из 8-10-дневных куриных эмбрионов по методу, изложенному в работе [6].

Получение коллагена и коллагеновой подложки.

В работе использовали коллаген, который получали из сухожилий хвостов крыс. Крысиный хвост помещали в чашку Петри со спиртом, выдерживали при минус 10^oC не менее 15 минут, освобождали от кожи и при помощи двух зажимов разламывали на кусочки (по 1-1,5 см от кончика к центральной части), вытягивая сухожильные нити. Их помещали в чашку Петри со стерильной дистиллированной водой. Сухожилия от одного хвоста расщепляли на отдельные волокна при помощи тонких пинцетов, опускали в колбу, содержащую 150 мл 0,1%-ного раствора ледяной уксусной кислоты и оставляли в холодильнике на 48 ч. Затем содержимое колбы центрифугировали (6000 об/мин в течение 1 ч) и получали до 80 мл вязкого раствора. К остатку добавляли 30 мл раствора уксусной кислоты, через 24 ч снова центрифугировали и получали до 40 мл раствора коллагена. Приготовленный таким образом коллаген хранится в холодильнике до 1 года.

Перед использованием коллаген подвергали диализу и испытывали на стерильность. Диализованный коллаген наносили по 1-2 капли на обезжиренные покровные стекла (12х24 мм), расположенные в стерильных чашках Петри. Коллагеновую пленку уплотняли парами аммиака. Через 2 - 5 мин восстановленный коллаген образовывал тонкую гель-пленку. Для нейтрализации щелочной реакции геля стекла промывали дистиллированной водой и переносили в чашку Петри.

Выделение тканей и методы культивирования.

Для выделения и препарирования ткани использовали бинокулярный стереоскопический микроскоп МБС-1 с модификацией, позволяющей в два раза увеличить фокусное расстояние (140 мм) при сохранении всех других рабочих характеристик.

Органотипическая культура спинальных ганглиев куриных эмбрионов.

Для взятия материала (спинальные ганглии 10 - 12-дневных куриных эмбрионов на уровне пояснично-крестцового отдела спинного мозга) и его препаровки использовали набор инструментов для глазной хирургии. Спинальные ганглии извлекали под микроскопом и помещали в стерильную чашку Петри на покровные стекла с коллагеновой подложкой. На одно покровное стекло располагали 3 эксплантата спинальных ганглиев на расстоянии 3 мм друг от друга. Для прикрепления эксплантатов к подложке покровные стекла с эксплантатами в герметически закрытых чашках Петри помещали в термостат при температуре 36,8^oC на 30 минут.

Дальнейшее культивирование осуществляли во вращающихся пробирках. При этом покровные стекла с прикрепленными к ним эксплантатами вносили в пробирки, содержащие 1,5 - 2 мл питательной среды. Затем плотно закрытые пробирки помещали под углом 5^o во вращающийся со скоростью 12 об/час барабан аппарата для культивирования тканей, установленного в термостате.

Морфологические и морфометрические методы исследования развития эксплантатов нервной ткани.

Рост нервных элементов в культуре ткани исследовали прижизненно с помощью светового микроскопа, а также на гистологических препаратах, окрашенных метиленовым синим, гематоксилин-эозином и с применением импрегнации серебром по Бильшовскому-Гросс.

На окрашенных препаратах, а также при прижизненном наблюдении с помощью фазово-контрастного микроскопа уже через 24 часа культивирования в эксплантатах спинальных ганглиев можно выделить 2 зоны: центральную (более плотную) и периферическую (в виде характерного ореола вокруг ганглия).

Для количественной оценки влияния тестируемых веществ на рост нейритов (в нашем случае - водных экстрактов медицинской лиофилизированной пиявки) спинальных ганглиев применяли морфометрический метод. Учитывая неоднородность морфологической картины эксплантатов с целью унификации конечных показателей степени роста нейритов для ее оценки использовали относительный критерий - индекс площади (ИП).

Интенсивность роста эксплантатов оценивали по величине ИП, который рассчитывали как отношение площади всего эксплантата, включая периферическую зону роста, к исходной площади ганглия (т.е. площади центральной зоны). За условную единицу площади принимали квадрат-окуляр сетки микроскопа (сторона квадрата при увеличении 3,5•10 равнялась 150 мкм).

В каждой экспериментальной серии за "h" принимали количество эксплантатов спинальных ганглиев, развивавшихся в культуральной среде при добавлении тестируемого вещества. Статистическую обработку результатов проводили с использованием t-критерия Стьюдента.

Подготовка медицинской пиявки для исследования.

Емкости, содержащие медицинскую пиявку после удаления воды замораживали при минус 40 - 50^oC. Продолжительность промораживания при такой температуре не менее 24 часов.

В аппаратах типа "ТГ-50" в течение 20 минут создают вакуум 160 - 70 МкМ. Сушку проводят при температуре минус 38 - 40^oC в течение 12 часов (до видимого высушивания препарата). В дальнейшем температуру в сублиматоре постепенно повышают (1-2^oC в час) и в течение 36 - 40 час доводят до 0^oC. Зону 0^oC проводят плавно. В течение последующих 6 - 8 час температуру доводят до 28^oC. Процесс сушки заканчивается при поддержании постоянной температуры в препарате на щадящем уровне (28^oC) в течение 6 час, процесс сушки длится 60 - 68 час. Контроль за процессом сушки ведут по температурным данным и остаточному давлению в сушильной камере. В начале сушки остаточное давление в сублиматоре не должно превышать 350 МкМ, а к концу сушки - не более 100 МкМ.

Лиофильно высушенную пиявку (или отдельные части ее тела - голову, туловище, хвост) выдерживают в дистиллированной стерильной воде при 20 - 22^oC в течение 1 - 3 суток, затем определяют концентрацию белка в водных растворах и готовят необходимое разведение экстрактов для их последующего использования в качестве добавки при культивирования нервных клеток.

В первой серии опытов в культуральную среду помещали водные растворы экстрактов лиофилизированной пиявки в концентрации 50, 200, 400 нг/мл. Источником для экстракции являлась целая пиявка, ее голова и хвост.

На фиг. 1, фиг. 4 представлены полученные нами результаты, из которых следует, что достоверный эффект стимуляции роста нервных волокон в культуре ткани был достигнут при использовании экстрактов из головы пиявки. Экстракты из целой пиявки или ее хвоста обладали эффектом, соизмеримым с контролем. Водные экстракты были получены при суточной экспозиции образцов в воде.

Следует отметить, что при использовании водного экстракта головы пиявки был получен четкий "доза-эффект" стимуляции роста нервных волокон в диапазоне концентраций 50, 200, 400 нг/мл.

Пример 2.

Вся предыдущая подготовка эксперимента описана в "примере 1". Отличие состояло в том, что использовали водные экстракты головы пиявки, которые получали путем экспозиции сухого вещества в воде в течение трех суток. Нами был получен куполообразный эффект в диапазоне концентраций 100 - 800 нг/мл с максимумом эффекта стимуляции роста нервных волокон при концентрации 200 нг/мл.

Получение подобного эффекта может быть связано с тем, что более длительная экстракция (более 1 суток) приводит к появлению в водном растворе ингибиторов роста нервных волокон (фиг. 2).

Пример 3.

Вся предыдущая подготовка эксперимента описана в "примере 1". Отличие состояло в том, что для исключения неспецифического стимулирующего эффекта водного раствора из головы пиявки эти экстракты подвергали термическому воздействию при температуре 100^oC в течение 20 минут.

Из результатов, представленных на фиг. 3, следует, что при такой обработке водных экстрактов стимуляции роста нервных волокон не наблюдали. Кроме того, это наблюдение говорит о том, что присутствующие в водных растворах головы пиявки стимуляторы роста нервных волокон являются термонестабильными в отличие, например, от мозгового нейритстимулирующего белка (МНСБ) [7].

Т. о. полученные нами результаты свидетельствуют о наличии в головке пиявки вещества (веществ), стимулирующих рост нервных волокон.

Обладают ли такой способностью известные компоненты секрета пиявки - гирудин, эглины, гиалуронидаза, дестабилаза или это связано с наличием еще не дифференцированных индивидуальных веществ покажут дальнейшие исследования.

Литература
1. Калюнов В.Н. Фактор роста нервов. Минск: Наука и техника, 1984, 214 с.

2. Green L., Shooter E. Annu. Rev. Neurosci, 1980, V 3, 353 - 402.

3. Крашенюк А.И. Крашенюк С.В. В кн: Материалы IV конференции Ассоциации гирудологов. М., 1995, с. 19. Под ред. В.В.Птушкина.

4. Крашенюк А. И. , Крашенюк С.В. Успехи гирудологии и гидрудотерапии. Материалы четвертой научно-практической конференции Ассоциации гирудологов России (25 - 30 сентября 1994 г.). Санкт-Петербург-Зеленогорск, 1994, 18-20, Под ред. А.И. Крашенюка.

5. А. с. СССР N 1695367 "Способ моделирования кустиковидного тканевого рецептора в культуре ткани". Приоритет от 09.11.88 г., бюлл. N 44, 30.11.91 г.

6. Чалисова Н.И., Мелькишев В.Ф., Акоев Г.Н., Людыно М.И., Куренкова Т. Ю. Цитология, 1991, 33, N 2, 29-31.

7. Гончарова В. П., Акоев Г.Н., Романюк А.В., Чалисова Н.И. Нейрофизилогия, 1988, 20, N 1, 15-19.

Изобретение относится к биологии, экспериментальной медицине, гирудологии, гирудотерапии, практической медицине. Для моделирования влияния медицинской пиявки на стимуляцию роста нервных волокон культивируют спинальный ганглий эмбрионов курицы на коллагеновом субстрате в среде, содержащей фетальную сыворотку теленка, глюкозу, среду Игла, раствор Хенкса и инсулин с добавлением в среду в качестве стимулятора водного экстракта головной части лиофилизированной медицинской пиявки в концентрации 200-400 нг/мл, полученный при суточной экспозиции, или в концентрации 100-200 кг/мл, полученный при экспозиции в течение трех суток. Способ помогает объяснить существование некоторых эффектов воздействия живой медицинской пиявки на восстановление функции нервно-мышечных структур при органическом поражении клеток нервной системы человека, например, при детском церебральном параличе или миопатии. 4 ил.

Способ моделирования роста нервных волокон путем культивирования спинального ганглия эмбрионов курицы на коллагеновом субстрате в среде, содержащей фетальную сыворотку теленка, глюкозу, среду Игла, раствор Хенкса и инсулин с добавлением в среду стимулятора роста нервных волокон, отличающийся тем, что в качестве стимулятора используют водный экстракт головной части лиофилизированной медицинской пиявки в дозе 200 - 400 нг/мл, полученный при суточной экспозиции, или в дозе 100 - 200 нг/мл, полученный при экспозиции в течение трех суток.