СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ИНФИЦИРОВАНИЯ НЕДОНОШЕННЫХ НОВОРОЖДЕННЫХ Российский патент 2000 года по МПК G01N33/68 

Изобретение относится к медицине, а именно к неонатологии, и позволяет диагностировать инфицирование недоношенных новорожденных с первых часов их жизни.

В структуре перинатальной смертности недоношенные дети составляют до 60-70% (9), инфицированность недоношенных новорожденных в последнее время резко возрастает с 5,3 до 27,4% (1,2,4), а мертворождаемость от инфицирования достигает 14,9 - 16,8% (2,4,6).

Низкая частота выявления инфицирования (3,9) заключается в том, что его клинические проявления часто скрываются за другими диагнозами, такими как внутриутробная гипоксия, асфиксия, внутричерепная травма (5), а существующие способы диагностики оказываются запоздалыми или неэффективными.

Известен способ диагностики инфицирования недоношенных новорожденных путем исследования содержания в крови количества лейкоцитов и тромбоцитов при рождении (7). При выявлении лейкоцитоза, гиперлейкоцитоза с ядерным нейтрофильным сдвигом влево или выраженной лейкопении с относительным лимфоцитозом, тромбоцитопении (количество тромбоцитов менее 150•10⁹/л) диагностируют инфицирование недоношенного новорожденного с точностью 50%.

Недостатки данного способа:
1. Исследуемые показатели могут оставаться в пределах нормальных величин даже при генерализованной гнойно-септической инфекции у детей в состоянии анергии (7).

2. Изменения вышеперечисленных показателей встречаются не только при инфицировании, но и при заболеваниях системы крови.

3. Низкая точность способа (50%).

Известен способ диагностики инфицирования недоношенных новорожденных путем исследования содержания в пуповинной крови C - реактивного белка (6). При выявлении положительной реакции диагностируют инфицирование недоношенного новорожденного с точностью 50%.

Недостатки данного способа:
1. Диагноз инфицирования ставится на основании полуколичественного метода и выражается (+), (++), (+++). Точность способа не превышает 50%, что делает способ малодостоверным.

2. Инфицирование, приобретенное в родах, данным способом не выявляется.

3. Диагностика инфицирования данным способом возможна только через (20±4)ч.

4. Способ осуществляют при строгом температурном режиме: (12±6)^oC
5. C - реактивный белок не определяется в возрасте более трех дней, ввиду его отсутствия.

Наиболее близким по техническому решению является способ диагностики инфицирования недоношенных новорожденных путем определения содержания либо специфических иммуноглобулинов М в сыворотке крови или выявление специфических антигенов методом микроиммуноферментного анализа (МИФА) (8) в сыворотке крови и при наличии специфических иммуноглобулинов М к цитомегаловирусу свыше 0.650±0.005 (в единицах Index Cut Off для IgM), к Toxoplasma gondii свыше 0.450±0.005 или при выявлении антигена стрептококка серогруппы "A" и антигена Chlamydia trachomatis, диагностируется инфицирование недоношенного новорожденного с точностью - 87,5%.

Способ имеет существенные недостатки:
1. Выявление только специфической инфекции, которая в структуре инфекций составляет 6-8% (9).

2. Результат МИФА зависит от пола, возраста, состояния организма, биологических ритмов новорожденного.

3. Исследования методом микроиммуноферментного анализа (МИФА) проводятся на специальном дорогостоящем оборудовании, с использованием дорогостоящих реактивов, требующем специальной подготовки персонала. Стоимость 1 анализа от 40 до 70 руб. в зависимости от вида выявляемой инфекции.

Указанные недостатки предлагается устранить в заявляемом способе.

Достижение предполагаемого технического результата обеспечивается определением в сыворотке пуповинной крови недоношенных новорожденных в первые часы жизни содержания малонового диальдегида (МДА) и при содержании МДА ≥ 5,3 нмоль/мл диагностируют инфицирование недоношенного новорожденного.

При осуществлении изобретения может быть получен следующий результат: с первых часов жизни недоношенного новорожденного диагностируется инфицирование с точностью 94,4%.

Способ осуществляется следующим образом: у ребенка при рождении забирают 1,5 мл пуповинной крови, получают сыворотку общепринятым методом, в которой определяют МДА по методу К. Jagi (10).

К 0,3 мл сыворотки крови добавляют 2,4 мл 1/12 нормальной серной кислоты, встряхивают и добавляют 0,3 мл 10%-ной фосфорно-вольфрамовой кислоты, содержимое пробирки перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 10 мин.

Центрифугируют 15 мин при 3000 об/мин. Надосадочную жидкость удаляют. Осадок дважды промывают 1 мл бидистиллированной воды. К осадку добавляют 3 мл бидистиллированной воды и 1 мл 0,8%-ного раствора 2-тиобарбитуровой кислоты. Содержимое пробирки встряхивают и нагревают в кипящей бане в течение 1 ч, охлаждают и центрифугируют 15 мин при 6000 об/мин.

Интенсивность розовой окраски определяют на спектрофотометре при длине волны 532 нм в кювете толщиной слоя 1 см против воды. Интенсивность окраски стабильна в течение часа.

Реактивы стандартизованы заводами-изготовителями. Длительность постановки реакции всего 2 часа.

Расчет содержания МДА производится по стандартной формуле метода К. Jagi (1968 г).

где E - показания прибора; 0,3 - количество сыворотки; 10⁶ - коэффициент пересчета в нмоли; 1,56 • 10⁵ - молярный коэффициент экстинкции; 4 - разведение сыворотки.

Концентрация МДА выражается в нмоль/мл.

Отличительная особенность способа: предлагается диагностировать инфицирование недоношенных новорожденных по содержанию МДА в сыворотке пуповинной крови и при значении последнего, равном 5,3 нмоль/мл и более, диагностируют инфицирование.

Новизна способа заключается в том, что предлагается диагностировать инфицирование недоношенных новорожденных по содержанию в крови малонового диальдегида. Кроме того, разработан нормативный показатель, соответствующий содержанию МДА ≥ 5,3 нмоль/мл (нормативный показатель установлен заявителями), свидетельствующий о наличии инфицирования.

МДА (Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. - Наука, 1972, с. 252) является одним из конечных продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) и характеризует интенсивность этого процесса.

Наряду с биохимическими показателями диагноз инфицирования верифицирован изменением клинической картины и состоянием ребенка, наличием в общем анализе крови увеличения содержания лейкоцитов, нейтрофильных гранулоцитов, лейкопении с относительным лимфоцитозом и методом МИФА.

Существо способа поясняется следующими примерами.

Пример 1. Новорожденный Ш. родился в срок гестации 36 нед. с оценкой по шкале Ангар 5-6 баллов и массой тела 2140 г. На основании клинических данных поставлен диагноз: синдром дыхательных расстройств 1-2 степени. Пневмопатия. Диффузные ателектазы легких. Синдром угнетения. Недоношенность 1 степени. Гипотрофия 1 степени.

Согласно предлагаемому способу в сыворотке пуповинной крови ребенка проведено исследование содержания МДА, которое составило 4,6 нмоль/мл, что ниже заявляемого параметра. Заключение: инфицирование не выявлено.

Одновременно исследована кровь по способу-прототипу - методом МИФА. Заключение: инфицирование не выявлено.

Пример 2. Новорожденный О. родился в срок гестации 36 нед. с оценкой по шкале Апгар 6-6 баллов и массой тела 2700 г. На основании клинических данных поставлен диагноз: острая интранатальная асфиксия на фоне хронической внутриутробной гипоксии. Синдром угнетения. Синдром повышенной судорожной готовности. Синдром дыхательных расстройств 1 степени. Диффузные ателектазы легких. Недоношенность 1 степени.

Согласно предлагаемому способу в сыворотке пуповинной крови ребенка проведено исследование содержания МДА, которое составило 5,2 нмоль/м, что ниже заявляемого параметра. Заключение: инфицирование не выявлено.

Одновременно исследована кровь по способу-прототипу - методом МИФА. Заключение: инфицирование не выявлено.

Пример 3. Новорожденный Н. родился в срок гестации 32 нед. с оценкой по шкале Апгар 4-5 баллов и массой тела 2000 г. На основании клинических данных поставлен диагноз: тяжелая интранатальная асфиксия на фоне хронической внутриутробной гипоксии. Синдром дыхательных расстройств 2 степени. Пневмопатия. Диффузные ателектазы легких. Синдром угнетения. Отечный синдром 2 степени. Недоношенность 2 степени.

Согласно предлагаемому способу в сыворотке пуповинной крови ребенка проведено исследование содержания МДА, которое составило 5,3 нмоль/мл, что соответствует заявляемому параметру. Заключение: диагностировано инфицирование, что в дальнейшем подтверждено изменением клинической картины (нарастание дыхательной недостаточности, мышечной гипотонии, вялости).

Через день исследована кровь по способу-прототипу - методом МИФА. Заключение: выявлен антиген стрептококка серогруппы A.

Пример 4. Новорожденный К. родился в срок гестации 33 нед. с оценкой по шкале Апгар 2-4 балла и массой тела 3000 г. На основании клинических данных поставлен диагноз: тяжелая интранатальная асфиксия на фоне хронической внутриутробной гипоксии. Синдром дыхательных расстройств 2-3 степени. Пневмопатия. Диффузные ателектазы легких. Синдром угнетения. Отечный синдром. Диабетическая фетопатия. Недоношенность 2 степени. Внутриутробное инфицирование?
Согласно предлагаемому способу в сыворотке пуповинной крови ребенка проведено исследование содержания МДА, которое составило 5,7 нмоль/мл, что выше заявляемого параметра. Заключение: диагностировано инфицирование.

Одновременно исследована кровь по способу-прототипу - методом МИФА. Заключение: инфицирование не выявлено.

При наблюдении в динамике за ребенком на 4-5 день выявлено изменение клинической картины, выражающееся нарастанием вялости, дыхательной недостаточности, появлением апноэ, срыгиваний. Повторно проведено исследование содержания МДА, которое составило 7,3 нмоль/мл, что выше заявляемого параметра.

При повторном исследовании крови по способу-прототипу - методом МИФА - выявлен антиген Chlamydia trachomatia.

Пример 5. Новорожденный Л. родился в срок гестации 35 нед. с оценкой по шкале Апгар 5-6 баллов и массой тела 1700 г. На основании клинических данных поставлен диагноз: тяжелая интранатальная асфиксия на фоне хронической внутриутробной гипоксии. Синдром дыхательных расстройств 2 степени. Пневмопатия. Диффузные ателектазы легких. Синдром угнетения. Недоношенность 1 степени. Синдром задержки развития плода 3 степени. Симметричный тип. Внутриутробное инфицирование?
Согласно предлагаемому способу в сыворотке крови ребенка проведено исследование содержания МДА, которое составило 8,4 нмоль/мл, что выше заявляемого параметра. Заключение: диагностировано инфицирование.

Одновременно исследована кровь по способу-прототипу - методом МИФА. Заключение: выявлены IgM к цитомегаловирусу и антиген стрептококка серогруппы "A".

Указанным способом обследовано 89 новорожденных, которые обследованы и способом-прототипом. Результаты исследования приведены в таблице.

Преимущества способа:
1. Использование способа для диагностики любого вида инфицирования у недоношенных новорожденных любой степени тяжести.

2. Длительность осуществления способа 2 часа.

3. Использование пуповинной крови.

4. Точность способа - 94,4%.

5. Исследование содержания МДА может быть проведено независимо от времени суток, пола, возраста, биологических ритмов.

6. Предлагаемый показатель может быть использован как скрининговый тест для диагностики инфицирования недоношенных новорожденных.

7. Для применения способа не требуется дорогостоящего оборудования и реактивов, специальной подготовки персонала. Способ может быть осуществлен лаборантом со средним медицинским образованием.

8. Способ может быть использован в учреждениях родовспоможения всех уровней.

9. Стоимость 1 анализа 15 руб.

Способ может быть использован в медицине, а именно в педиатрии. Диагностику инфицирования недоношенных новорожденных осуществляют по изменению в сыворотке пуповинной крови концентрации МДА и при уровне МДА ≥ 5,3 нмоль/мл диагностируют инфицирование недоношенного новорожденного. Способ обеспечивает повышение точности диагностики инфицирования недоношенных новорожденных. 1 табл.

Способ диагностики инфицирования недоношенных новорожденных путем исследования крови, отличающийся тем, что в сыворотке пуповинной крови недоношенных новорожденных определяют концентрацию малонового диальдегида (МДА) и при его содержании, равном 5,3 нмоль/мл и более, диагностируют инфицирование недоношенного новорожденного.