СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АУТОПРОБИОТИКА, СОДЕРЖАЩЕГО ЖИВЫЕ БИФИДОБАКТЕРИИ И ЛАКТОБАЦИЛЛЫ Российский патент 1999 года по МПК A61K35/74 C12N1/20 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к микробиологии, и может быть использовано в медицине и ветеринарии для лечения и профилактики заболеваний, связанных с нарушениями состава и функций нормальной микрофлоры человека и животных.

Известно, что с современных позиций микрофлору человека и животных рассматривают как совокупность множества микробиоценозов, занимающих многочисленные экологические ниши на коже и слизистых открытых полостей макроорганизма. В любом микробиоценозе всегда имеются постоянно обитающие виды бактерий (автохтонная, индигенная микрофлора), а также транзиторные, случайные виды (аллохтонная микрофлора).

Функции, выполняемые нормальной микрофлорой в организме хозяина, многообразны. В совокупности выполняемых ею функций нормальную микрофлору человека и животных можно рассматривать как первичную мишень воздействия любого фактора внешней среды, как неспецифический барьер, лишь после прорыва которого инициируется включение неспецифических и специфических механизмов защиты. Если эти факторы по своей интенсивности превышают компенсаторные возможности данной экосистемы, возникают микроэкологические нарушения, нередко сопровождающиеся патологическими процессами. Перечень заболеваний и патологических состояний, связанных с микроэкологическими нарушениями, велик. Он включает как инфекционные заболевания, так и неинфекционные, в том числе так называемые "болезни цивилизации" (атеросклероз, мочекаменная болезнь, аллергические и онкологические заболевания и др.).

В настоящее время для восстановления нарушенного микробиоценоза человека и животных используют разнообразные приемы, прежде всего введение в больших количествах антагонистических штаммов бактерий - представителей нормальной микрофлоры (бифидобактерий, лактобацилл и др.) в составе пробиотиков - фармакопейных препаратов или продуктов функционального питания. Эти бактерийные препараты и продукты функционального питания являются достаточно эффективным лечебно-профилактическим средством, однако их эффективность в значительной степени ограничена тем, что используемые в их составе в качестве действующего начала штаммы микроорганизмов - представителей нормальной микрофлоры являются чужеродными для организма реципиента. В результате происходит обычное при трансплантации донорских тканей отторжение, т.е. вводимые в составе пробиотиков микроорганизмы не приживаются на слизистых кишечника и транзитом выводятся из организма. Поэтому для получения положительного эффекта от применения бактерийных препаратов и продуктов функционального питания требуется длительный курс их применения (не менее 2-х недель) и введение большого количества жизнеспособных клеток бактерий (не менее 10⁷ КОЕ бактерий в 1 дозе).

Известен способ ускорения лечения дисбактериозов кишечника путем введения аутоштаммов бифидобактерий и лактобацилл [1].

Аутоштаммы выделяли из фекалий путем последовательных десятикратных разведений физиологическим раствором исследуемого материала до 10^-8. Исследуемый материал из различных разведений засевали на соответствующие питательные среды для определения исходных уровней энтеробактерий, энтерококков, стафилококков, лактобактерий, бифидобактерий. Через двое суток материал из изолированных колоний лактобактерий, выросших на среде МРС-4, в наибольшем разведении (10³) и из изолированных колоний бифидобактерий, выросших на питательной среде Блаурокка в наибольшем разведении (10⁷), вновь пересевали на соответствующие селективные питательные среды. Выросшие через 2 суток после второго пассажа изолированные колонии бифидобактерий и лактобактерий пересевали на жидкие среды МРС-4 и Блаурокка для получения биомассы микроорганизмов, которая была использована в виде аутоштаммов для лечения дисбактериоза кишечника.

В данном способе в виде аутоштаммов было использовано всего по одному штамму выделенных отдельно бифидобактерий и лактобацилл из всего многообразия видов этих индигенных микроорганизмов (до 5 видов бифидобактерий и более 10 видов лактобацилл). Кроме того, при данном способе выделения аутоштаммов велика вероятность того, что выделенные культуры являются клонами чужеродных для хозяина микроорганизмов, случайно попавших в пищеварительный тракт с пищей и водой.

Цель изобретения - получение аутопробиотика, содержащего комплекс живых бифидобактерий и лактобацилл - представителей индигенной микрофлоры кишечника хозяина, предназначенный для восстановления нарушенной микроэкологии его кишечника.

Поставленная цель достигается тем, что бифидобактерии и лактобациллы выделяют одновременно в виде естественных комплексов кишечника человека и/или животных путем деконтаминации содержимого толстого кишечника от посторонней микрофлоры за счет многократных разведений исследуемого материала жидкой питательной средой, содержащей селективные агенты, пригодной для выделения и культивирования бифидобактерий и лактобацилл, с последующим удалением аллохтонной микрофлоры путем добавления к биоматериалу, разведенному до 10^-6, сыворотки крови того же индивидуума, у которого был взят образец кишечного содержимого, последующего его культивирования в течение 48 часов при 38^oC и дальнейшего пересева полученной биомассы на жидкие питательные среды для культивирования бифидобактерий и лактобацилл без добавления селективных агентов. Полученная после культивирования биомасса содержит бифидобактерии и лактобациллы, являющиеся истинными представителями индигенной микрофлоры хозяина, и пригодна для использования в качестве аутопробиотика для восстановления и коррекции микроэкологических нарушений кишечника человека и животных.

Способ осуществляют следующим образом.

Пример 1. Пробоподготовка.

От момента последнего принятия пищи до взятия материала должно пройти не менее 8 часов. При этом исключают любые факторы, способные хотя бы потенциально влиять на состав микрофлоры хозяина (лекарственные препараты, стрессы, алкоголь и т.п.). Пробу содержимого толстой кишки отбирают в стерильный одноразовый пластиковый контейнер, специально предназначенный для этих целей. Для определения количества отобранного биоматериала контейнер взвешивают до и после забора материала.

Пример 2. Деконтаминация биоматериала от транзиторной микрофлоры.

Деконтаминацию биоматериала от транзиторной микрофлоры осуществляют путем последовательного десятикратного разведения испытуемого образца. Способ осуществляют следующим образом.

Готовят 2 параллельных ряда пробирок с последовательными десятикратными разведениями биоматериала любой жидкой питательной средой, пригодной для выделения и культивирования бифидобактерий и лактобацилл, например МРС или БС-средой, с добавлением селективных агентов. Первый ряд состоит из пробирок до разведения 10^-9 и предназначен для оценки общего количественного содержания бифидобактерий и лактобацилл в исходном биоматериале. Второй ряд предназначен для получения аутопробиотика и состоит из пробирок с биоматериалом до разведения 10^-6.

Пример 3. Деконтаминации биоматериала от чужеродных микроорганизмов и получение аутопробиотика.

Известно, что среди механизмов, контролирующих состав микрофлоры хозяина, важную роль играют иммуноглобулины, прежде всего IgA, препятствующие адгезии и способствующие выведению чужеродных микроорганизмов во внешнюю среду. Подтверждением роли IgA в предотвращении колонизации слизистых посторонними микроорганизмами является тот факт, что 99% бактерий - представителей индигенной анаэробной флоры не покрыты секреторными иммуноглобулинами. Напротив, энтеробактерии, энтерококки и другие аэробные бактерии кишечника полностью покрыты IgA. В основе этого явления, по мнению D.van der Waaij, лежит феномен иммунологической толерантности к индигенной микрофлоре [2]. Нарушение процесса формирования иммунологической толерантности при дефектах микробной экологии беременных и их потомства ведет к снижению колонизационной резистентности. Установлено также, что слизистые желудочно-кишечного тракта начинают реагировать на вводимые микроорганизмы синтезом IgA только тогда, когда количество микроорганизмов составляет 10⁶ и более клеток на грамм содержимого тонкой кишки [3]. Это позволило сделать вывод, что любые микроорганизмы, обнаруживаемые в пищеварительном тракте здорового человека в количествах менее 10⁶ КОЕ/г являются транзиторными и их влияние на физиологические функции организма хозяина может быть проигнорировано. Естественно, это не касается микроорганизмов, относящихся к известным кишечным патогенам (сальмонеллы, шигеллы и др.).

Исходя из этого для удаления чужеродных микроорганизмов, присутствующих в биоматериале в сопоставимых с индикаторными бактериями индигенной микрофлоры (бифидобактерии, лактобациллы и др.) количествах (более 10⁶ КОЕ/г), а также для гарантированного удаления аллохтонных, включая патогенные, бактерий осуществляют 2-й этап деконтаминации.

В пробирку из последнего десятикратного разведения биоматериала второго ряда, приготовленного с использованием жидкой питательной среды по примеру 2, добавляют сыворотку крови того же индивидуума, у которого был взят исследуемый биоматериал, в количестве 10% (возможно от 5 до 20%) от объема исследуемого образца. Содержимое пробирки тщательно перемешивают встряхиванием, герметично закрывают пробкой и помещают в термостат при 38^oC на 48 часов. Затем пробу вытаскивают из термостата, делают контрольные посевы для определения количества бифидобактерий, лактобацилл и наличия посторонней микрофлоры. В случае отсутствия последней делают пересев материала (1:10) в жидкую питательную среду для культивирования бифидобактерий и лактобацилл без добавления селективных агентов и культивируют при 38^oC в течение 48 часов. Полученную биомассу используют в качестве аутопробиотика. Добавление к разведенному биоматериалу сыворотки крови того же индивидуума позволяет иммуноглобулинам крови связать оставшуюся аллохтонную флору и получить биомассу бифидобактерий и лактобацилл, являющихся истинными представителями индигенной микрофлоры хозяина, пригодный для дальнейшего использования в качестве аутопробиотика для восстановления микрофлоры кишечника.

Контроль полученного аутопробиотика осуществляют общепринятым методом посева на селективные питательные среды Эндо, Плоскирева, МПА и ТГС для определения посторонней микрофлоры - на этих средах рост в аэробных условиях должен отсутствовать. Для оценки количественного содержания отдельно бифидобактерий и лактобацилл делают посевы на среды МРС и бифидум-среду с добавлением соответствующих селективных агентов. Все определения ведут общепринятыми методами.

Таким образом, предложен способ получения аутопробиотика на основе естественных микробиоценозов бифидобактерий и лактобацилл толстой кишки человека и животных. Пробиотик может быть использован для лечения дисбактериоза и заболеваний, связанных с нарушениями нормальной микрофлоры кишечника, как у человека, так и у ценных экземпляров животных и птиц.

Список литературы:
1. Авторское свидетельство СССР N 1286212, A 61 K 35/74, 30.01.87.

2. Van der Vaaij D. Evidence of imminoregulation of the composition of intestinal microflora and its practical consequences. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis., 1988, vol. 7.

3. Lorenz A. Interaction of some species of the gut microflora and their influence on the amount of IgA in the gut lumen of gnotobiotic rats. Abstr. XII Intern. Sympos. Gnotobiology, Honolulu, June 23-28, 1966.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к микробиологии, и может быть использовано в медицине и ветеринарии для лечения и профилактики заболеваний, связанных с нарушениями состава и функций нормальной микрофлоры человека и животных. Бифидобактерии и лактобациллы выделяют одновременно в виде естественных комплексов кишечника человека и/или животных путем деконтаминации содержимого кишечника от посторонней микрофлоры. Проводят многократные разведения исследуемого образца жидкой селективной питательной средой, пригодной для выделения и культивирования бифидобактерий и лактобацилл. Удаляют аллохтонную микрофлору путем добавления в разведенный до 10^-6 биоматериал сыворотки крови того же индивидуума, у которого было взято кишечное содержимое. Культивируют в течение 48 ч при 38^oC с последующим пересевом на те же питательные среды, но без добавления селективных агентов. Полученная биомасса содержит бифидобактерии и лактобациллы, являющиеся истинными представителями индигенной микрофлоры хозяина. Предложенный способ позволяет использовать в качестве аутопробиотика полученную биомассу для восстановления микрофлоры кишечника человека и ценных экземпляров животных и птиц.

Способ получения аутопробиотика для восстановления микроэкологии кишечника человека и животных, предусматривающий выделение живых бифидобактерий и лактобацилл из кишечника хозяина и использование их в виде аутомикроорганизмов, отличающийся тем, что бифидобактерии и лактобациллы выделяют одновременно в виде естественного комплекса индигенных микроорганизмов путем разведения содержимого толстой кишки хозяина жидкой селективной питательной средой для выделения и культивирования бифидобактерий и лактобацилл, добавления в него сыворотки крови того же хозяина, культивирования смеси и последующего пересева на питательную среду для культивирования бифидобактерий и лактобацилл без добавления селективных агентов.