СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ОЦЕНКИ СОДЕРЖАНИЯ БИФИДОБАКТЕРИЙ В СМЕШАННЫХ КУЛЬТУРАХ МИКРООРГАНИЗМОВ Российский патент 2000 года по МПК C12Q1/06 C12N1/20 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к производству бактерийных препаратов и продуктов питания, а также к медицинской и санитарной микробиологии и может быть использовано для оценки количества бифидобактерий в различном биоматериале.

По данным РАМН, почти у 90% населения России отмечены нарушения количественного и качественного состава кишечной микрофлоры, обозначаемые терминами "дисбактериоз" или "дисбиоз". Для направленного создания или восстановления нарушенной микрофлоры человека и животных используют разнообразные приемы, прежде всего введение в больших количествах антагонистических штаммов бактерий - представителей нормальной микрофлоры в составе пробиотиков - фармакопейных препаратов или продуктов функционального питания. Наименьшими побочными эффектами при длительном их применении обладают пробиотики, в состав которых входят бифидобактерии. Бифидобактерии с современных позиций являются эффективным биокорректором, обладающим многофакторным регулирующим и стимулирующим воздействием на организм.

Многообразные позитивные эффекты, обнаруживаемые у человека при постоянном употреблении кисломолочных продуктов, содержащих бифидобактерии, явились основанием для создания разнообразных видов продуктов функционального питания с включением в них в качестве активного действующего начала бифидобактерии (соки, жвачки, мороженое, кондитерские изделия, салаты, сыры, сметана, кефир, масло, крем, творог и др.). Все возрастающая популярность и разнообразие продуктов питания, содержащих бифидобактерии во всех развитых странах объясняется тем, что их регулярное использование в течение длительного времени значительно способствует поддержанию физического и духовного здоровья, продлевает срок активной жизни, смягчает воздействие неблагоприятных факторов внешней среды, стрессов и т.п.

Установлено также, что максимальный положительный эффект на организм человека оказывают препараты и продукты, содержащие живые бифидобактерии в количестве не менее 10⁷ КОЕ в 1 мл. Именно количественное содержание жизнеспособных бифидобактерий является основным показателем качества бифидосодержащих препаратов и продуктов питания. Вместе с тем многие препараты и продукты питания содержат в своем составе не только бифидобактерии, но и другие виды микроорганизмов (лактобациллы, эшерихии коли, бациллы и др.), которые либо способствуют расширению спектра биологической активности этих препаратов (например, отечественные препараты бификол, бифацид, бифилакт и др. ), либо необходимы для оптимизации технологического процесса и получения продукта с высокими потребительскими характеристиками (стрептококки, лактобациллы, грибы и т.д.), либо являются естественными контаминантами (различные энтеробактерии, мезофильные грамположительные бактерии и др.). Существующие методы микробиологического контроля таких бифидосодержащих продуктов лечебно-профилактического назначения предусматривают определение количества технологически значимой микрофлоры: молочнокислых бактерий и бифидобактерий.

Известно также, что микрофлора человека и многих животных на 85-98% состоит из бифидобактерий. Попадая с фекалиями в окружающую среду, эти микроорганизмы могут быть четким показателем фекального загрязнения почвы, сточных вод, другого материала. Обнаружение фекального загрязнения окружающей среды путем определения в биоматериале бифидобактерий является объективным санитарным показателем.

Известные приемы выделения из смешанных культур жизнеспособных клеток бифидобактерий для количественного их подсчета основаны на посеве исследуемого материала методом последовательных десятикратных его разведений в ряд пробирок с питательной средой для выделения бифидобактерий. При этом в исследуемом материале бифидобактерий должны содержаться в количестве не менее 10⁷ КОЕ/мл (восьмая и последующие пробирки в ряду), а посторонняя микрофлора должна отсутствовать или присутствовать в значительно более низких количествах. Однако в тех случаях, когда в состав биопрепаратов или кисломолочных продуктов входят другие пробиотические или технологические культуры в сопоставимых с бифидобактериями количествах, для определения количества бифидобактерий в конечных продуктах необходимы специальные приемы для селективной изоляции бифидобактерий, что достигается введением в питательную среду дополнительных агентов, ингибирующих рост других микроорганизмов (неомицин в концентрациях до 1000 мкг/мл, стрептомицин - 3000 мкг/мл, пропионовая кислота и другие) [1].

Известна способность азида натрия ингибировать рост грамнегативных микроорганизмов. В настоящее время способность азида натрия оказывать бактериостатический эффект на грамнегативные бактерии и не влиять на рост грамположительных анаэробных и микроаэрофильных микроорганизмов является общепризнанной.

Известно использование азида натрия в составе стандартной жидкой питательной среды Bacto azide dextrose broth [2]. Содержание азида натрия в питательной среде составляет 0,2 г/л. При посеве исследуемого материала в эту жидкую питательную среду полностью ингибируется рост кишечных палочек и стафилококков и отмечается хороший рост фекальных стрептококков. Однако эта питательная среда предназначена для обнаружения стрептококков в воде, молоке, сточных водах и не может быть использована для селективного выделения бифидобактерий из смешанной среды уже потому, что не подавляет рост лактобацилл, которые, как правило, входят в состав смешанных стартерных культур для приготовления бифидосодержащих препаратов и особенно кисломолочных продуктов питания.

Известен метод определения количества бифидобактерий в препарате бифидобактерий и молочнокислых бактерий (Бифилакт) [3]. Метод предполагает подготовку проб к анализу, приготовление последовательных десятикратных разведений исследуемого образца для посева, приготовление селективной питательной среды для определения количества бифидобактерий в смешанной культуре микроорганизмов. В этом случае для придания селективных свойств в составе гидролизатно-молочной или кукурузно-лактозной среды увеличивают массовую долю агара с 2.5 до 17 г на 1 л питательной среды и вносят раствор неомицина из расчета 0,2 см³ на 20 см³ среды. Метод определения количества бифидобактерий основан на способности бифидобактерий расти в питательных средах, разлитых высоким столбиком в пробирках при температуре 37^oC и образовывать в них через 24-72 ч гвоздикообразные характерные колонии. Проведение исследований предусматривает приготовление из первого разведения исследуемого образца последующие десятикратные разведения до 10-го разведения с таким расчетом, чтобы последние из них не содержали бифидобактерий. Из приготовленных разведений исследуемого образца делают посевы по 1,0 см³ в два параллельных ряда пробирок с питательной средой. Посевы выдерживают в термостате с температурой 38^oC в течение 72 ч, а в случае определения бифидобактерий в смешанных с молочнокислыми бактериями культурах - от 3 до 5 суток. Из изолированных колоний, выросших в последнем разведении, делают препараты, окрашивают по Граму и микроскопируют. Подсчет количества клеток бифидобактерий в 1,0 см³ продукта производят путем умножения числа выросших колоний на соответствующее разведение. За окончательный результат анализа принимают среднее арифметическое результатов, полученных в двух параллельных рядах. Для определения истинного количества бифидобактерий в среде с неомицином результат следует удвоить.

Недостатком метода является то, что аминогликозидные антибиотики, к которым относится неомицин, широко используются в медицинской, ветеринарной практике, сельском хозяйстве. Результатом этого явилось появление и широкое распространение в природе большого числа неомицинустойчивых штаммов аэробных микроорганизмов (псевдомонад, энтеробактерий, ацинетобактеров и др.), способных расти на питательных средах с добавлением неомицина. Поэтому данный способ ограничен тем, что входящие в состав исследуемого биоматериала аэробные микроорганизмы, например широко используемые при производстве кисломолочных продуктов молочнокислые бактерии, чувствительны к неомицину.

Целью изобретения является способ количественной оценки содержания бифидобактерий в смешанных культурах микроорганизмов.

Поставленная цель достигается тем, что в состав питательной среды для выделения и культивирования бифидобактерий в качестве селективного агента вносят смесь азида натрия и лития пропионовокислого. Введение в состав питательной среды азида натрия позволяет ингибировать рост посторонней грамотрицательной микрофлоры, а введениe дополнительно лития пропионовокислого позволяет ингибировать рост лактобацилл, которые растут на всех средах для культивирования бифидобактерий и на которые азид натрия не оказывает бактериостатического действия.

Пример 1. Приготовление пропионата лития.

5 г углекислого лития добавляют к 100 мл концентрированной пропионовой кислоты, перемешивают смесь в течение 30 мин до полного растворения лития. Смесь фильтруют через бумажный фильтр, помещают в стеклянный сосуд с притертой пробкой и хранят в темном месте при комнатной температуре в течение 1 месяца.

Пример 2. Приготовление селективной питательной среды для выделения бифидобактерий.

Может быть использована любая стандартная питательная среда для выделения и культивирования бифидобактерий. При этом питательную среду для селективного выделения бифидобактерий готовят ex tempore путем добавления к готовой питательной среде для культивирования бифидобактерий азида натрия и лития пропионовокислого.

Берут стандартную питательную среду для выделения бифидобактерий сухую (бифидум-среду) производства Государственного научного центра прикладной микробиологии МЗ РФ (г. Оболенск Московской обл.) следующего состава, г/л:
Панкреатический гидролизат казеина - 30.0
Экстракт пекарных дрожжей - 5.2
Натрий хлористый - 2.5
Глюкоза - 7.5
Лактоза - 2.5
Цистеин - 0.5
Аскорбиновая кислота - 0.5
Ацетат натрия - 0.3
Магний сернокислый - 0.5
Агар - 0.7-1.0
pH 7.0±0.3
50.35 г сухой среды тщательно размешивают в 1 л дистиллированной воды, нагревают до кипения, стерилизуют автоклавированием при температуре 110^oC в течение 30 мин и охлаждают до температуры 50-45^oC. Затем к питательной среде добавляют приготовленный по примеру 1 литий пропионовокислый из расчета 20-35 мл (оптимально 25 мл) на 1 л готовой среды и одновременно добавляют азид натрия в количестве 120-150 мг/л (оптимально 130 мг/л) среды.

Приготовленную питательную среду перемешивают и стерильно разливают по 9 мл в два ряда пробирок.

Из первого разведения исследуемого образца биоматериала готовят последующие десятикратные разведения до 10-го разведения с таким расчетом, чтобы последние из них не содержали бифидобактерии. Из приготовленных разведений исследуемого образца делают посевы по 1,0 см³ в два параллельных ряда пробирок со свежеприготовленной питательной средой с селективными агентами. Посевы выдерживают в термостате с температурой 38^oC в течение 48 ч, а в случае определения бифидобактерий в смешанных с молочнокислыми бактериями культурах - от 48 до 72 ч. Из изолированных колоний, выросших в последнем разведении, делают препараты, окрашивают по Граму и микроскопируют. При этом в препарате обнаруживают только бифидобактерии. Для дополнительного контроля колонию рассевают на ТГС среде для контроля стерильности и помещают в термостат при 37^oC на 48 ч. Рост на ТГС среде отсутствует. Подсчет количества клеток бифидобактерий в 1,0 см³ исследуемого биоматериала, например кисломолочного продукта, производят путем умножения числа выросших колоний на соответствующее разведение. За окончательный результат анализа принимают среднее арифметическое результатов, полученных в двух параллельных рядах.

Предлагаемый способ прост в использовании, доступен любой бактериологической лаборатории и позволяет выделять из смешанной культуры и проводить количественное определение бифидобактерий в различном биоматериале - продуктах питания, бактерийных препаратах, содержимом кишечника, в сточных водах и другом биоматериале, содержащем смешанные культуры микроорганизмов. При этом возможно использование любых питательных сред для выделения и культивирования бифидобактерий.

Список литературы
1. Shah N.P. Isolation and enumeration of bifidobacteria in fermentedd milk prodacts. A review. Milchwiss, 1997, vol.52, 72-76.

2. Difko Manual. Dehydrated culture media and reagents for microbiology. Difko. Tenth edition. Difko laboratories, Detroit, Michigan 48232 USA, 1994, 101-102.

3. TУ-49.1016-85 Технические условия. Препарат сухой бифидобактерий и молочнокислых бактерий (Бифилакт). Министерство мясной и молочной промышленности СССР. Утверждены 0.06.1985 г.

Изобретение относится к биотехнологии. Может быть использовано в медицине, санитарной микробиологии и в пищевой промышленности для количественного определения бифидобактерий в различном биоматериале. Способ предусматривает посев исследуемых проб в селективную питательную среду для выделения бифидобактерий. Посевы выдерживают в термостате. Производят подсчет количества клеток бифидобактерий в исследуемом биоматериале. В качестве селективных агентов используют азид натрия и литий пропионовокислый, которые одновременно вносят в питательную среду в количестве соответственно 120-150 мг и 20-30 мл на 1 л питательной среды. Предлагаемый способ более прост в использовании, доступен любой бактериологической лаборатории и позволяет выделять из смешанной культуры и проводить количественное определение бифидобактерий в различном биоматериале. При этом возможно использование любых питательных сред. 1 з.п. ф-лы.

1. Способ количественной оценки содержания бифидобактерий в смешанных культурах микроорганизмов, предусматривающий посев исследуемых проб в селективную питательную среду для выделения бифидобактерий с последующим термостатированием и подсчетом количества клеток бифидобактерий в исследуемом биоматериале, отличающийся тем, что в качестве селективных агентов используют азид натрия и литий пропионовокислый, которые одновременно вносят в питательную среду, предназначенную для выделения и культивирования бифидобактерий. 2. Способ количественной оценки содержания бифидобактерий в смешанных культурах микроорганизмов по п.1, отличающийся тем, что азид натрия вносят в питательную среду в количестве 120 - 150 мг/л, а пропионат лития в количестве 20 - 30 мл/л.