СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПАРВОВИРУСА Б19 Российский патент 2000 года по МПК G01N33/569 

Изобретение относится к области медицины, а именно к созданию медицинских диагностикумов для определения наличия патогенных вирусов в крови человека. Нами разработан диагностикум для выделения паровируса Б19 в сыворотке крови на основе двухэтапной полимеразной цепной реакции.

На сегодняшний день существуют 2 основных метода идентификации ДНК парвовируса Б19. Первый из них - ДНК-гибридизация [1, 2, 3]. Однако этот метод требует много времени и достаточно трудоемок для скриннинга большого числа образцов. Второй метод - двухэтапная полимеразная цепная реакция (nested-PCR). Самая удачная на наш взгляд модификация определения ДНК ПВ Б19 описана авторами Musiani M., Gallinella G. et al. [4].

Методика, предложенная Musiani M., Gallinella G. et al.

1. К 50-ти мкл анализируемой сыворотки добавляют 100 мкл лизирующего раствора, содержащего 50 мМ KCl, 10 мМ Tris-HCl (pH 8,3), 25 мМ MgCl₂, 0,1 мг/мл желатина, 0,45% NP-40; 0,45% Tween 20 и 0,06 мг Proteinase K. Смесь инкубируют при 56^oC в течение одного часа, после чего прогревают в течение 10 мин при температуре 95^oC для инактивации фермента и центрифугируют при 14000 об/мин 15 минут. Супернатант используют в PCR.

2. Готовят рабочую смесь для двухэтапной постановки полимеразной цепной реакции (цифры приведены в расчете на одну пробу):
I этап
а) Реакционный буфер (Tris-HCl (pH 8,3) - 100 мМ, MgCl₂ - 15 мМ, KCl - 500 мМ, желатин 0,1%), мкл - 2,5
б) Праймер (нуклеотидная последовательность 5'-CTTTAGGTATAGCCAACTGG-3', 20 мкМ), мкл - 2
в) Праймер (нуклеотидная последовательность 5'-ACACTGAGTTTACTAGTGGC-3', 20 мкМ), мкл - 2
г) Смесь ATP, CTP, GTP, TTP (концентрация каждого компонента 2 мМ), мкл - 2,5
д) ДНК-полимераза, ед. активности - 1
е) Супернатант депротеинизированной и прогретой сыворотки, мкл - 5
ж) Деионизованная вода, мкл - До 25
I этап реакции амплификации проводят в программируемом термостате при следующем температурном режиме: 94^oC - 30 сек; 55^oC - 1 мин; 72^oC - 1 мин, число последовательных циклов - 35.

II этап
а) Реакционный буфер (Tris-HCl (pH 8,3) - 100 мМ, MgCl₂ - 15 мМ, KCl - 500 мМ, желатин 0,1%), мкл - 2,5
б) Праймер (нуклеотидная последовательность 5'-CTTTAGGTATAGCCAACTGG-3', 20 мкМ), мкл - 2
в) Праймер (нуклеотидная последовательность 5'-ACACTGAGTTTACTAGTGGC-3', 20 мкМ), мкл - 2
г) Смесь ATP, CTP, GTP, TTP (концентрация каждого компонента 2 мМ), мкл - 2,5
д) ДНК-полимераза, ед. активности - 1
е) Амплификат, полученный в результате проведения I этапа, мкл - 5
ж) Деионизованная вода, мкл - До 25
II этап реакции амплификации проводят в программируемом термостате при следующем температурном режиме: 94^oC - 30 сек; 55^oC - 1 мин; 72^oC - 1 мин, число последовательных циклов - 35.

Преимущество предлагаемого нами изобретения в том, что ДНК ПВ Б19 определяется непосредственно в сыворотке крови человека без предшествующей обработки ферментом proteinase K и последующей его инактивацией. Это ускоряет и удешевляет постановку теста, не уменьшая его чувствительности. Кроме того, разработанные нами две пары праймеров таковы, что за счет существенной разницы в температуре отжига внешней и внутренней пары исключено участие внешних праймеров на второй стадии реакции, что дает возможность проведения двух этапов в одной реакционной пробирке, а это, в свою очередь, также снижает вероятность контаминации образцов.

Описание предлагаемого способа определения парвовируса Б19.

1. К 50 мкл сыворотки крови больного добавляют 100 мкл физиологического раствора, содержащего 0,5% детергента NP-40, и смесь прогревают при температуре 95^oC в течение 10 минут, после чего центрифугируют при 14000 об/мин в течение 10 мин. Полученный супернатант используют в PCR.

2. Готовят рабочую смесь для двухэтапной постановки полимеразной цепной реакции (цифры приведены в расчете на одну пробу):
I этап
а) Реакционный буфер (TРИС-HCl (pH 8,3) - 100 мМ, MgCl₂ - 25 мМ, KCl - 500 мМ, формамид - 40%), мкл - 2,5
б) Праймер (нуклеотидная последовательность 5'-GACCTCCAAACCAC-3', 20 мкМ), мкл - 2
в) Праймер (нуклеотидная последовательность 5'-AATTGCTGATACACAG-3', 20 мкМ), мкл - 2
г) Смесь ATP, CTP, GTP, TTP (концентрация каждого компонента 2 мМ), мкл - 2,5
д) ДНК-полимераза, ед. активности - 1
е) Супернатант прогретой разведенной сыворотки, мкл - 5
ж) Деионизованная вода, мкл - До 25
I этап реакции амплификации проводят в программируемом термостате при следующем температурном режиме: 94^oC - 1 мин; 44^oC - 1 мин; 72^oC - 1 мин, число последовательных циклов - 20.

II этап
а) Реакционный буфер (TРИС-HCl (pH 8,3) - 100 мМ, MgCl₂ - 25 мМ, KCl - 500 мМ, формамид - 40%), мкл - 2,5
б) Праймер (нуклеотидная последовательность 5'-CAATTGTCACAGACACCAG-3', 20 мкМ), мкл - 2
в) Праймер (нуклеотидная последовательность 5'-TGCAATCCAGACAGGTAAG-3', 20 мкМ), мкл - 2
г) Смесь ATP, CTP, GTP, TTP (концентрация каждого компонента 2 мМ), мкл - 2,5
д) ДНК-полимераза, ед. активности - 1
е) Амплификат, полученный в результате проведения I этапа, мкл - 5
ж) Деионизованная вода, мкл - До 25
II этап реакции амплификации проводят в программируемом термостате при следующем температурном режиме: 94^oC - 1 мин; 56^oC - 1 мин; 72^oC - 1 мин, число последовательных циклов - 35.

После проведения двухэтапной полимеразной цепной реакции продукт подвергают электрофорезу в агарозном геле, содержащем бромистый этидий. О наличии ДНК ПВ Б19 в исследуемом образце судят по появлению полосы флюоресценции в УФ-свете на соответствующей дорожке в геле. Размер амплификата - 490 оснований.

Таким образом, предлагаемая нами методика отличается от прототипа следующим.

Во-первых, в предлагаемой методике длительный процесс депротеинизации образца сыворотки ферментом протеиназой K и его последующей инактивации заменен 10-минутным прогреванием образца при 95^oC, что позволяет сократить трудоемкость, время выполнения, стоимость анализа, а также исключить возможность контаминации образца на стадии подготовки ПЦР, а следовательно, и возможность получения ложноположительной реакции.

Во-вторых, две пары праймеров подобраны так, что температура отжига для внешней пары праймеров (44^oC) существенно ниже, чем для внутренней пары (56^oC). Такая разница в температуре отжига позволяет исключить участие пары внешних праймеров на второй стадии реакции и получить амплификат без примеси неспецифических продуктов реакции. Кроме того, это дает возможность проведения двух этапов в одной реакционной пробирке, что, в свою очередь, также уменьшает вероятность контаминации образцов.

Примеры использования способа приведены на фиг. 1 и 2.

Список литературы
1. Shade R.O., Blundell M.C., Cotmore S.F., Tattersall P., Astell C.R. "Nucleotide Sequence and Genom Organization of Human Parvovirus B19 Isoleted from Serum of Child During Aplastic Crisis". J. Virol. 58: 921-936 (1986).

2. McOmish F., Yap P.L., Jordan A., Hart H., Cohen B.J. and Simmonds P. "Detection of Parvovirus B19 in Donnated Blood: a Model System for Screening by Polymerase Chain Reaсtion". J. Clin. Microbiol. 31: 323-328 (1993).

3. Patent: WO 9112269-A 10 22-AUG-1991.

4. Musiani M., Gallinella G. et al. "Persistent B19 Parvovirus Infection in Haemophilic HIV-1 Infected Patients", J. of Med. Virol., 46: 103-108, 1995.

5. Frickhofen N., Young N.S. "A Rapid Method of Sample Preparation for Detection of DNA Viruses in Human Serum by PCR", J. Virol. Meth., 35: 65-72 (1991).

Изобретение относится к медицине, в частности вирусологии, и касается эффективных и высокоспецифичных способов определения парвовируса Б19 в сыворотке крови. Способ основан на постановке двухэтапной полимеразной цепной реакции, включающей предварительную тепловую обработку исследуемых сывороток при 95^oC в течение 10 мин. При этом в качестве исследуемых используют сыворотки, не обработанные ферментом proleinase K. В качестве праймеров на первом этапе реакции используют пару с температурой отжига 44^oC, состоящую из 5'-GACCTCCAAACCAC-3' и 5'-AATTGCTGATACACAG-3', а на втором этапе - пару с температурой отжига 56°С, состоящую из 5'-CAATTGTCACAGACACCАG-3' и 5'-TGCAATCCAGACAGGTAAG-3'. Два этапа реакции проводят в одной пробирке. Способ позволяет ускорить, удешевить постановку теста, снизить возможность контаминации образцов. 2 ил.

Способ определения паровируса Б 19 при помощи двухэтапной полимеразной цепной реакции, включающий тепловую обработку образцов исследуемых сывороток при 95^oС в течение 10 мин и непосредственно двухэтапную полимеразную цепную реакцию, отличающийся тем, что ДНК ПВ Б19 определяется непосредственно в сыворотке крови человека, не обработанной ферментом proteinase К, с последующей его инактивацией и в качестве праймеров на первом этапе реакции используют пару с температурой отжига 44^oС, состоящую из 5'-GACCTCCAAACCAC-3' и 5'-AATTGCTGATACACAG-3', а на втором этапе - пару с температурой отжига 56^oС, состоящую из 5'-CAATTGTCACAGACACCAG-3' и 5-TGCAATCCAGACAGGTAAG-3', при этом два этапа реакции проводят в одной пробирке.