СИНТЕТИЧЕСКИЕ ОЛИГОНУКЛЕОТИДЫ-ПРАЙМЕРЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ДНК ЦИТОМЕГАЛОВИРУСА ЧЕЛОВЕКА Российский патент 2001 года по МПК C12N15/38 C12Q1/68 C07H21/04 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и может быть использовано для диагностических целей выявления цитомегаловируса (ЦМВ), а также для решения научно-исследовательских задач по изучению цитомегаловирусной инфекции.

Экспресс-диагностика инфекций, вызываемых ЦМВ, имеет важное значение в клинической практике, в особенности в практике трансплантологии или у беременных женщин, когда требуется быстрый метод для постановки диагноза, чтобы своевременно начать лечение. Такой широко применяемый метод диагностики вирусной инфекции как иммуноферментный анализ (ИФА), позволяющий по наличию динамики антител к ЦМВ судить о протекании инфекционного процесса в организме человека, представляет собой достаточно длительную процедуру, так как обычно для подтверждения анализа необходимо исследование парных сывороток, а это требует примерно двухнедельного срока (1), что затягивает постановку диагноза и, соответственно, начало лечения. В таких случаях лучше всего использовать метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), который позволяет непосредственно с высокой степенью чувствительности и быстро определить наличие вирусной ДНК в образце. Следует заметить, что метод ПЦР разработан не для того, чтобы вытеснить уже имеющиеся иммунологические и другие методы, но наоборот, с целью дополнить их, позволяя решать задачи диагностики инфекционных заболеваний более эффективно. В основе ПЦР лежит многократное копирование с помощью фермента ДНК-полимеразы определенного фрагмента ДНК, являющегося маркерным для данного вида возбудителя инфекционного заболевания. ПЦР является прямым методом выявления вируса и имеет высокую степень чувствительности.

Для эффективного проведения ПЦР необходимы праймеры - синтетические олигонуклеотиды определенного размера, специфичные для каждого вида и типа вируса. Ограниченность использования праймеров обусловлена их видоспецифичностью. Праймеры должны быть комплементарны последовательностям ДНК на левой и правой границах специфического фрагмента и ориентированы таким образом, чтобы синтез ДНК, осуществляемый ДНК-полимеразой, протекал только между ними. В результате происходит экспоненциальное увеличение количества копий специфического фрагмента. От правильно выбранных праймеров, определяющих специфичность ПЦР, зависит определение строгой видоспецифичности; с их помощью можно выявить целые роды или семейства микроорганизмов.

Известен способ специфического определения ЦМВ, предусматривающий амплификацию ДНК в жидкой смеси, содержащей ДНК-полимеразу, водную жидкую пробу и комбинацию праймеров, соответствующих 4- экзону большого раннего протеина, кодируемого MIE-геном ЦМВ (2). По описанию авторов выбранные праймеры не дают перекрестных реакций в ПЦР, если в качестве матриксов используют ДНК вируса простого герпеса 1 и 2 типов, вируса Эпштейна-Барр и ДНК человека и позволяют с высокой степенью чувствительности определять вирус в клинических образцах. Высокая специфичность ПЦР может быть достигнута за счет применения внутренних праймеров, т.н. "nested" ПЦР (3), а также за счет двухступенчатого способа ПЦР с использованием специфических рестриктаз (4, прототип). Недостатками описанных подходов выявления ЦМВ являются дороговизна и недоступность покупных праймеров, особенно для "nested" ПЦР, предлагаемых зарубежными фирмами, а также трудоемкость проведения процедуры двухступенчатого анализа клинических образцов.

Технической задачей изобретения является выявление ДНК цитомегаловируса с высокой степенью специфичности в клинических образцах, ограничиваясь одноступенчатой процедурой проведения ПЦР.

Поставленная задача решается посредством подбора уникальных праймеров для амплификации фрагмента гена UL-55, кодирующего гликопротеин B цитомегаловируса, для которого известно наибольшее количество нуклеотидных последовательностей различных штаммов ЦМВ. С этой целью был проанализирован большой массив баз данных по известным нуклеотидным последовательностям ДНК ЦМВ, состоящий из 22 клинических изолятов и уже известных в мире штаммов, на предмет выявления уникальных консервативных районов ДНК, не имеющих гомологий у других герпесвирусов как с целью исключения перекрестного реагирования близких видов и типов, так и с целью повышения внутриштаммовой специфичности ЦМВ. Был проведен компьютерный анализ кодируемых ими пептидных последовательностей с помощью программы SALIX, а с помощью компьютерной программы "OLIGO" были подобраны условия проведения полимеразной цепной реакции.

Для выявления участка ДНК с высокой степенью гомологии были проанализированы нуклеотидные последовательности из большого массива базы данных "GenBank". Был выбран ген UL-55 генома ЦМВ, кодирующий гликопротеин B, и к нему были подобраны праймеры следующего состава:
5'GAATCCAGGATCTGGTGCCTGGTA-3'
3'GATGGGAGTTCATGCCTCTACACCAC-5'
Полимеразную цепную реакцию проводили на амплификаторе марки Термоцик МС 16, производитель "ДНК-технология", г. Москва.

ПЦР-продукт был подвергнут электрофорезу в агарозном геле, и о положительной реакции судили по полосе амплификата, соответствующей размеру из 244 нуклеотидных пар оснований.

ПЕРЕЧЕНЬ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
Фиг. 1. Нуклеотидная последовательность гена UL - 55, амплифицируемая патентуемыми олигонуклеотидами-праймерами.

Фиг. 2. Электрофореграмма амплифицируемого фрагмента цитомегаловируса Дорожки 1-8: градиент температуры отжига 56 - 64^oC, дорожка 9: маркер pUC19/MspI.

Фиг. 3. Электрофорез продуктов ПЦР-исследования клинических образцов от пациента И-н в 2%-ном агарозном геле.

1-6-ПЦР ДНК HSV-1; 7-11- ПЦР ДНК HCMV;
12, 14 - положительный контроль ПЦР ДНК HSV-1;
16 - положительный контроль ПЦР ДНК HCMV;
13, 15 - отрицательный контроль ПЦР ДНК HSV-1 и HCMV.

Идентификация ДНК цитомегаловируса показана в примерах:
Пример 1. Амплификация участка ДНК гена UL-55 цитомегаловируса человека, кодирующего гликопротеин B.

Инкубационная смесь конечным объемом 50 мкл содержит 10 мМ Mg-буфер, 10 мМ d NTP, 2 мкл праймеров, 5 мкл ДНК - матрицы, 1 ед. ДНК-полимеразы, оставшийся объем - вода. Поверх смеси наслаивают 25 мкл минерального масла. В качестве матрицы используют суммарную ДНК зараженных HCMV клеток L68.

Реакцию проводят в следующем режиме: денатурация - 94^oC - 1 мин, отжиг - 59^oC - 1 мин, синтез - 72^oC - 5 мин, далее 30 циклов по схеме: денатурация при 93^oC в течение 1 мин, отжиг при 59^oC - 1 мин, синтез при 72^oC - 1 мин, на конечном 32-м цикле - 7 мин.

Пример 2. Определение ДНК ЦМВ в клинических образцах.

Апробацию полученных праймеров проводили в ПЦР с использованием образцов клинического материала (кровь, биопсийный материал) от 8 больных. В таблице приведены результаты ПЦР-исследования ДНК HCMV и ДНК HSVI. При выявлении ДНК HCMV в плазме крови положительный сигнал был получен у 7 пациентов (87,7%). Отсутствие в плазме положительного сигнала у 4-го номера компенсировалось наличием такого сигнала в другом образце: в маммарной артерии. Подтверждение положительного сигнала в плазме было получено еще у двух пациентов в других образцах биопсийного материала, а именно: в аорте, в маммарной артерии и в образце адвентиции аорты.

Анализ сыворотки крови пациентов выбранной группы методом ИФА показал наличие HCMV - специфических IgG с титрами от 1:1000 до 1:1400 у всех восьми пациентов, что вполне соотносится с полученными нами данными ПЦР. Следует заметить, что проведение ИФА с целью установления точного диагноза примерно занимает 2 недели, а ПЦР с предложенными праймерами около 5 часов.

На фиг. 3 приведен результат ПЦР-исследования образцов клинического материала, полученных от одного из пациентов. Из 5 проб, взятых из плазмы крови и биопсийного материала, ДНК HCMV обнаружена в 3 образцах (в плазме, аорте, маммарной артерии, 7-11 дорожки), в тоже время ДНК HSV 1 не обнаружена ни в одной из 6 проб (1-6 дорожки).

Таким образом, поставленная задача по получению высокоспецифичных праймеров, позволяющих выявлять ДНК ЦМВ при проведении ПЦР из различных клинических образцов, успешно решена; выбранные уникальные олигонуклеотиды не дают перекрестных реакций с родственными видами, позволяют, ограничиваясь одноступенчатой процедурой проведения реакции, быстро и надежно определять наличие ДНК цитомегаловируса.

Источники информации
1. Н. М. Махова, Н.А.Межевич, М.П. Гришаев, В.Д. Злобина, А.А.Чепурнов. Цитомегаловирусная инфекция у детей с онкогематологическими заболеваниями. Педиатрия, 1998, 2, с. 5-7.

2. И. Ф. Баринский, В.В. Бакаев, Т.А. Посевая, С.А. Клинчева, Н.П. Николаева, В.В. Длин, Н.В.Шебалина. Подбор праймеров и их использование в полимеразной цепной реакции для диагностики инфекций, вызываемых вирусами простого герпеса и цитомегаловирусом. Вопросы вирусол., 1994, 39,6, с. 245-247.

3. P.Cassinotti et al., - Suitability and Clinical Application of a Multiplex Nested PCR Assey for the Diagnosis of Herpes Simplex Virus Infections. - J. Med. Virology, 50: 75-81 (1996).

4. Inara E. Souza et al. , - Rapid Epidemiologic Characterization of Cytomegalovirus Strains From Pediatric Bone Marrow Transplant Patients. - Infection Control and Hospital Epidemiology, 1998, 16, 7, pp. 399-404.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и может быть использовано для диагностических целей выявления цитомегаловируса (ЦМВ), а также для решения научно-исследовательских задач по изучению цитомегаловирусной инфекции. Получены высокоспецифичные праймеры, позволяющие выявлять ДНК ЦМВ человека при проведении полимеразной цепной реакции (ПЦР) из различных клинических образцов. Выбранные уникальные олигонуклеотиды не дают перекрестных реакций с родственными видами, позволяют, ограничиваясь одноступенчатой процедурой проведения ПЦР, быстро и надежно определять наличие ДНК цитомегаловируса. 3 ил., 1 табл.

Синтетические олигонуклеотиды-праймеры, используемые для выявления ДНК цитомегаловируса человека, имеющие следующий нуклеотидный состав:
5'GAATCCAGGATCTGGTGCCTGGTA-3'
3'GATGGGAGTTCATGCCTCTACACCAC-5'