СИНТЕТИЧЕСКИЕ ОЛИГОНУКЛЕОТИДЫ-ПРАЙМЕРЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ДНК ВИРУСА ПРОСТОГО ГЕРПЕСА 2 ТИПА (ВПГ-2) ЧЕЛОВЕКА Российский патент 2003 года по МПК C12Q1/68 C07H21/04 C12N15/38 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и может быть использовано для идентификации нуклеиновой кислоты вируса простого герпеса 2 типа (ВПГ), а также для решения научно-исследовательских задач по изучению этой группы вирусов.

В последние годы разрабатываются методы диагностики вирусных инфекций, которые можно объединить понятием "генодиагностика", позволяющие обнаруживать гены или последовательности ДНК, специфичные для определения вида возбудителя инфекционного заболевания. Следует заметить, что генетические методы разрабатываются не для того, чтобы вытеснить уже имеющиеся иммунологические и другие методы, но наоборот, чтобы их дополнить. Такой широко применяемый в целях диагностики метод как иммуноферментный анализ (ИФА), позволяющий по наличию динамики антител к инфекционному агенту, судить о протекании инфекционного процесса в организме человека, представляет собой достаточно длительную процедуру, так как обычно для подтверждения анализа необходимо исследование парных сывороток, а это требует примерно 2-х недельного срока, что сильно затягивает постановку диагноза и, соответственно, начало лечения. В таких случаях лучше всего использовать метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), который позволяет с высокой степенью точности быстро определять наличие вирусной ДНК.

ПЦР является прямым методом выявления вируса и имеет высокую степень чувствительности, данный метод незаменим в ряде случаев клинической практики (например, в практике трансплантологии, тестирование в женских консультациях).

В основе ПЦР лежит многократное копирование с помощью фермента ДНК-полимеразы определенного фрагмента ДНК, являющегося маркерным для данного вида возбудителя инфекционного заболевания.

Для эффективного проведения ПЦР необходимы праймеры - синтетические олигонуклеотиды определенного размера, специфичные для каждого вида и типа вируса. Ограниченность использования праймеров обусловлена их видоспецифичностью. Праймеры должны быть комплементарны последовательностям ДНК на левой и правой границах специфического фрагмента и ориентированы таким образом, чтобы синтез ДНК, осуществляемый ДНК-полимеразой, протекал только между ними. В результате происходит экспоненциальное увеличение количества копий специфического фрагмента. От правильно выбранных праймеров зависит определение строгой видоспецифичности.

Известен способ типоспецифического определения ВПГ, предусматривающий амплификацию ДНК в жидкой смеси, содержащей ДНК-полимеразу, водную жидкую пробу и комбинацию праймеров, соответствующих району гена тимидинкиназы генома ВПГ [1]. По описанию авторов, выбранные праймеры не дают перекрестных реакций в ПЦР, если для выявления ВПГ 1-го типа в качестве матрицы используют ДНК из клеток Vero, инфицированных вирусом простого герпеса 2-го типа и, наоборот, для выявления ВПГ 2-го типа использовали ДНК ВПГ 1-го типа. Высокая специфичность ПЦР может быть достигнута за счет применения внутренних праймеров, т. н. "nested" ПЦР [2], а также за счет 2-х ступенчатого способа ПЦР, но с использованием специфических эндонуклеаз рестрикции [3]. Недостатками описанных подходов является дороговизна и недоступность предлагаемых различными зарубежными фирмами праймеров, а также трудоемкость проведения процедуры двухступенчатого анализа клинических образцов.

Технической задачей изобретения является выявление ДНК ВПГ 2-го типа с высокой степенью специфичности в клинических образцах, ограничиваясь одноступенчатой процедурой проведения ПЦР.

Поставленная задача решается посредством подбора уникальных праймеров для амплификации фрагмента гена UL-44 генома ВПГ 2-го типа, кодирующего гликопротеин gC, для которого было найдено наибольшее количество нуклеотидных последовательностей из известных штаммов и клинических изолятов. С этой целью были проанализированы области последовательностей генома вирусов из 6 клинических изолятов и уже известных в мире штаммов вируса герпеса 2-го типа на предмет выявления консервативных районов ДНК (фиг.2а и 2б), не имеющих гомологии у других герпесвирусов с целью исключения перекрестного реагирования близких видов и типов. Был проведен компьютерный анализ кодируемых ими пептидных последовательностей с помощью программы SALIX, а с помощью компьютерной программы "OLIGO" были подобраны условия проведения полимеразной цепной реакции с данными праймерами.

Для выявления гомологий ДНК ВПГ 2-го типа были проанализированы консервативные участки частей генов, кодирующих основные гликопротеины ВПГ 2-го типа, и из большого массива базы данных "GenBank" был выбран участок гена UL-44 ВПГ-2 (с 138 по 1580 п.н.) (по наибольшему числу сопоставимых гомологий). Этот участок гена UL-44 ВПГ-2 (кодирующий гликопротеин gC) был проанализирован на предмет гомологии к аналогичному участку гена UL-44 ВПГ-1 (фиг. 1) как самого близкородственного в подсемействе Simplex вирусов семейства Herpesviridae [4, 5] , чтобы избежать перекрестного реагирования, выбран наиболее негомологичный участок (с 163 по 597 п.н.), и к нему подобраны праймеры следующего состава:
5'-CCGTGGGCCTGTGGGGCC-3' (18 н.)
5'-TCCGATCTCGGCGTCCGTCG-3' (20 н.)
специфичные к консервативному участку вариабельной части данного гена (фиг. 3), кодирующего гликопротеин С, входящего в состав вирусной оболочки [5].

Полимеразную цепную реакцию проводили на амплификаторе марки Термоцик МС 16, производитель "ДНК-технология", г. Москва.

Продукт ПЦР был подвергнут электрофорезу в 2% агарозном геле, и о положительной реакции судили по полосе фрагмента ДНК, соответствующей размеру 392 пары нуклеотидных оснований (фиг.4).

ПЕРЕЧЕНЬ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
Фиг. 1. Сравнение нуклеотидных последовательностей гена UL-44 ВПГ-1 и ВПГ-2 (GC1KOS и GC2333, соответственно). Внизу, под нуклеотидными последовательностями приведена консенсусная последовательность между этими вирусами. Позиции праймеров указаны подчеркиванием.

Фиг. 2а. и 2б. Нуклеотидная последовательность гена UL-44 для основных штаммов ВПГ-2 ("333", "BBKS", "JDZ", "ММА", "SAM", "WTW", по данным банка данных "GeneBANK"), амплифицируемая патентуемыми олигонуклеотидами-праймерами (подчеркнуты). Продукт амплификации соответствует отрезку нуклеотидной последовательности генома ВПГ-2 длиной 392 п.о. Внизу, под нуклеотидными последовательностями приведена консенсусная последовательность для этих штаммов.

Фиг. 3. Рестрикционная карта амплифицируемого фрагмента ВПГ-2 (жирным шрифтом выделены уникальные сайты эндонуклеаз рестрикции).

Фиг. 4. Электрофореграмма амплифицируемого фрагмента ВПГ-2. Дорожки 2-11 - градиент температуры отжига 58-67^oС; дорожка 1 и 12 - маркер pUC19/MspI.

Идентификация ДНК вируса простого герпеса 2-го типа показана в примерах.

Пример 1. Амплификация участка ДНК гена UL-44, кодирующего гликопротеин С.

Инкубационная смесь конечным объемом 50 мкл содержит: 60 мМ Tris-HCl (pH 8.5 при 25^oС); 1,5 мМ MgCl₂; 25 мМ KCl; 10 мМ 2-меркаптоэтанол; 0,1% Тритон Х-100; 5% ДМСО; 10 мМ dNTP; 2 мкл праймеров (1 о.е. каждого); 5 мкл ДНК - матрицы (~0,1 мкг); 0,5-1 ед. Taq ДНК-полимеразы; оставшийся объем занимает вода. Поверх смеси наслаивают 25 мкл минерального масла. Все манипуляции на этапе приготовления реакционной смеси поводят на тающем льду.

Реакцию проводят в следующем режиме: денатурация - 94^oС - 1 мин, отжиг - 64^oС - 0,5 мин, синтез - 72^oС - 0,5 мин, далее 40 циклов по схеме: денатурация при 94^oС в течение 0,5 мин, отжиг при 64^oС - 0,5 мин, синтез при 72^oС - 0,5 мин. Синтез на конечной стадии, т.е. в последнем цикле проводят при 72^oС в течение 3 мин. Продукты амплификации в ПЦР анализируют электофорезом в 2% агарозном геле в стандартном Трис-Ацетатном буфере (рН 8.0) при напряжении 1 вольт на сантиметр геля.

Пример 2. Определение ДНК ВПГ 2-го типа в клинических образцах.

Для апробации полученных праймеров в ПЦР, использовали образцы клинического материала от больных с диагнозом острого генитального герпеса. Во всех клинических образцах (кровь и соскобы с мест повреждения) в ПЦР с патентуемыми праймерами, амплифицировался специфичный фрагмент ДНК. Исследование сывороток этих же больных методом ИФА показало присутствие в их крови титров IgG ВПГ, которые располагались в интервале 1:1000-1:1200 и не отличались от соответствующих показаний, полученных при анализе условно здоровой группы людей, служившей контролем. В полученных двумя методами результатах нет противоречия, так как установлено, что иммуноглобулины класса IgG всегда присутствуют в 86-100% как у практически здоровых людей, так и у больных с различной симптоматикой [4]. Специфика метода ИФА заключается в том, что реакция иммунной системы организма, вырабатывающей антитела к инфекционному агенту, имеет свою инерцию, т.е. - вирусной инфекции уже нет (нет клиники заболевания, не обнаруживается ДНК вируса), а иммунная память о ней в виде наличия антител еще существует в крови, что и наблюдается в данном случае.

Таким образом, поставленная задача по получению высоко специфичных праймеров, позволяющих выявлять ДНК ВПГ 2-го типа для проведения ПЦР из различных клинических образцов, успешно решена. Выбранные уникальные олигонуклеотиды не дают перекрестных реакций с родственными видами, позволяют, ограничиваясь одноступенчатой процедурой проведения реакции, быстро и надежно определять наличие или отсутствие ДНК ВПГ 2-го типа.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. И.Ф. Баринский, В.В. Бакаев, Т.А. Посевая, С.А. Клинчева, Н.П. Николаева, В.В. Длин, Н.В.Шебалина - Подбор праймеров и их использование в полимеразной цепной реакции для диагностики инфекций, вызываемых вирусами простого герпеса и цитомегаловирусом. \\Вопросы вирусол., 1994, 39, 6, с.245-247.

2. P. Cassinotti et al. , - Suitability and Clinical Application of a Multiplex Nested PCR Assey for the Diagnosis of Herpes Simplex Virus Infections.- J. Med. Virology, 50: 75-81 (1996).

3. Inara E. Souza et al. , - Rapid Epidemiologic Characterization of Cytomegalovirus Strains From Pediatric Bone Marrow Transplant Patients.- Infection Control and Hospital Epidemiology, 1998, 16, 7, рр.399-404.

4. СПИД и оппортунистические вирусные нейроинфекции. Под ред. Н.П. Глинских.- Екатеринбург, Изд. Урал.Универ. - 1993, 226с.

5. Fields Virology. Third Edition, edited by B.N. Fields, D.M. Knipe, P. M. Howley, et al./Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia. //(1996), P. 2231-2295.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии. Полученные высокоспецифичные праймеры используются для идентификации вируса простого герпеса 2 типа (ВПГ), а также для изучения этой группы вирусов. Выбранные уникальные олигонуклеотиды не дают перекрестных реакций с родственными видами, позволяют, ограничиваясь одноступенчатой процедурой проведения ПЦР, быстро и надежно определять наличие или отсутствие ДНК ВПГ 2 типа. 4 ил.

Синтетические олигонуклеотиды - праймеры, используемые для выделения ДНК вирусов простого герпеса 2 типа человека, имеющие следующий нуклеотидный состав:
5'-CCGTGGGCCTGTGGGGCC-3' (18 н. )
5'-TCCGATCTCGGCGTCCGTCG-3' (20 н. ).