Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и может быть использовано для диагностической цели идентификации вируса простого герпеса 1 типа (ВПГ), а также для решения научно-исследовательских задач по изучению этой группы вирусов.
В последние годы разрабатываются методы диагностики вирусных инфекций, которые можно объединить понятием "генодиагностика", позволяющие обнаруживать гены или последовательности ДНК, специфичные для определения вида возбудителя инфекционного заболевания. Следует заметить, что генетические методы разрабатываются не для того, чтобы вытеснить уже имеющиеся иммунологические и другие методы, но наоборот, чтобы их дополнить. Такой широко применяемый в целях диагностики метод как иммуноферментный анализ (ИФА), позволяющий по наличию динамики антител к инфекционному агенту, судить о протекании инфекционного процесса в организме человека, представляет собой достаточно длительную процедуру, так как обычно для подтверждения анализа необходимо исследование парных сывороток, а это требует примерно двухнедельного срока, что сильно затягивает постановку диагноза и, соответственно, начало лечения. В таких случаях лучше всего использовать метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), который позволяет с высокой степенью точности и быстро определять наличие вирусной ДНК.
ПЦР является прямым методом выявления вируса и имеет высокую степень чувствительности, данный метод незаменим в ряде случаев клинической практики (например, в практике трансплантологии, тестирование в женских консультациях).
В основе ПЦР лежит многократное копирование с помощью фермента ДНК-полимеразы определенного фрагмента ДНК, являющегося маркерным для данного вида возбудителя инфекционного заболевания.
Для эффективного проведения ПЦР необходимы праймеры - синтетические олигонуклеотиды определенного размера, специфичные для каждого вида и типа вируса. Ограниченность использования праймеров обусловлена их видоспецифичностью. Праймеры должны быть комплементарны последовательностям ДНК на левой и правой границах специфического фрагмента и ориентированы таким образом, чтобы синтез ДНК, осуществляемый ДНК-полимеразой, протекал только между ними. В результате происходит экспоненциальное увеличение количества копий специфического фрагмента. От правильно выбранных праймеров зависит определение строгой видоспецифичности.
Известен способ типоспецифического определения ВПГ, предусматривающий амплификацию ДНК в жидкой смеси, содержащей ДНК-полимеразу, водную жидкую пробу и комбинацию праймеров, соответствующих району гена тимидинкиназы генома ВПГ (1). По описанию авторов выбранные праймеры не дают перекрестных реакций в ПЦР, если в качестве матриксов используют ДНК из клеток Vero, инфицированных вирусом простого герпеса 2-го типа. Высокая специфичность ПЦР может быть достигнута за счет применения внутренних праймеров, т.н. "nested" ПЦР (2), а также за счет двухступенчатого способа ПЦР, но с использованием специфических рестриктаз (3, прототип). Недостатками описанных подходов для выявления вируса простого герпеса 1 типа является дороговизна и недоступность предлагаемых различными зарубежными фирмами праймеров, а также трудоемкость проведения процедуры двуступенчатого анализа клинических образцов.
Технической задачей изобретения является выявление ДНК ВПГ1 с высокой степенью специфичности в клинических образцах, ограничиваясь одноступенчатой процедурой проведения ПЦР.
Поставленная задача решается посредством подбора уникальных праймеров для амплификации фрагмента гена US-6 генома ВПГ1, кодирующего гликопротеин D, для которого было найдено наибольшее количество нуклеотидных последовательностей из известных штаммов и клинических изолятов. С этой целью были проанализированы области последовательностей генома вирусов из 5 клинических изолятов и уже известных в мире штаммов вируса герпеса 1 типа на предмет выявления консервативных районов ДНК, не имеющих гомологий у других герпесвирусов с целью исключения перекрестного реагирования близких видов и типов. Был проведен компьютерный анализ кодируемых ими пептидных последовательностей с помощью программы SALIX, а с помощью компьютерной программы "OLIGO" были подобраны условия проведения полимеразной цепной реакции с данными праймерами.
Для выявления гомологий ДНК ВПГ 1 типа были проанализированы консервативные участки вариабельных частей генов, кодирующих основные гликопротеины ВПГ 1 типа, и из большого массива базы данных "GenBank" был выбран участок гена US-6 (по наибольшему числу сопоставимых гомологий) и к нему подобраны праймеры следующего состава:
5'CCCTAGATGAGGATCCGTACGCCC-3'
3'TTGTTTGGTGGGGAGCTCGCGGGG-5',
специфичные к консервативному участку вариабельной части данного гена, кодирующего гликопротеин D, ответственного за прикрепление вирусной частицы к клеточным рецепторам при герпесвирусной инфекции, т.е. имеющего прямое отношение к вирусной инфекционности.
Полимеразную цепную реакцию проводили на амплификаторе марки Термоцик МС 16, производитель "ДНК-технология", г. Москва.
ПЦР-продукт был подвергнут электрофорезу в агарозном геле, и о положительной реакции судили по полосе амплификата, соответствующей размеру 400 пар нуклеотидных оснований.
ПЕРЕЧЕНЬ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
Фиг. 1. Нуклеотидная последовательность гена US-6, амплифицируемая патентуемыми олигонуклеотидами - праймерами. Продукт амплификации соответствует отрезку нуклеотидной последовательности генома HSV-1 длиной 400 bp.
Фиг. 2. Электрофореграмма амплифицируемого фрагмента HSV-1. Дорожки 1-8: градиент температуры отжига 56-64oC, дорожка 9: маркер pUC19/MspI
Идентификация ДНК вирусов простого герпеса 1 типа показана в примерах.
Пример 1. Амплификация участка ДНК гена US-6, кодирующего гликопротеин D.
Инкубационная смесь конечным объемом 50 мкл содержит: 10 мМ Mg - буфер "Unipol", 10 мМ d NTP, 2 мкл праймеров, 5 мкл ДНК-матрицы, 1 мкл 5% твина, 0,5-1 ед. ДНК-полимеразы Tag, оставшийся объем занимает вода. Поверх смеси наслаивают 25 мкл минерального масла.
Реакцию проводят в следующем режиме: денатурация - 94oC- 1 мин, отжиг - 58oC - 1 мин, синтез - 72oC - 5 мин, далее 30 циклов по схеме: денатурация при 93oC в течение 0,5 мин, отжиг при 58oC - 1 мин, синтез при 72oC - 0,5 мин. Синтез на конечной стадии, т.е. в последнем цикле проводят при 72oC в течение 7 мин.
Пример 2. Определение ДНК ВПГ1 в клинических образцах.
Для апробации полученных праймеров использовали образцы клинического материала от 8 больных в ПЦР. Во всех клинических образцах (плазма и биопсийный материал) не было обнаружено ДНК вируса простого герпеса 1 типа, в то время как ДНК цитомегаловируса определялась в 7 из 8 случаев. Исследование сывороток этих же больных методом ИФА показало присутствие в их крови титров IgG HSV-1, которые располагались в интервале 1:1000-1:1200 и не отличались от соответствующих показаний, полученных при анализе условно здоровой группы людей, служившей контролем. В полученных двумя методами результатах нет противоречия, так как установлено, что иммуноглобулины класса IgG всегда присутствуют в 86-100% как у практически здоровых людей, так и у больных с различной симптоматикой (4). Специфика метода ИФА заключается в том, что реакция иммуной системы организма, вырабатывающая антитела к инфекционному агенту, имеет свою инерцию, т. е. вирусной инфекции уже нет (нет клиники заболевания, не обнаруживается ДНК вируса), а иммунная память о ней в виде наличия антител еще существует в крови, что и наблюдается в данном случае.
Таким образом, поставленная задача по получению высокоспецифичных праймеров, позволяющих выявлять ДНК ВПГ 1 типа для проведения ПЦР из различных клинических образцов, успешно решена; выбранные уникальные олигонуклеотиды не дают перекрестных реакций с родственными видами, позволяют, ограничиваясь одноступенчатой процедурой проведения реакции, быстро и надежно определять наличие или отсутствие ДНК ВПГ 1 типа.
Источники информации
1. И. Ф. Баринский, В.В. Бакаев, Т.А. Посевая, С.А. Клинчева, Н.П. Николаева, В. В. Длин, Н.В. Шебалина. - Подбор праймеров и их использование в полимеразной цепной реакции для диагностики инфекций, вызываемых вирусами простого герпеса и цитомегаловирусом. - Вопросы вирусол., 1994, 39,6, с. 245-247.
2. P.Cassinotti et al., - Suitability and Clinical Application of a Multiplex Nested PCR Assey for the Diagnosis of Herpes Simplex Virus Infections. - J. Med. Virology, 50:75-81 (1996).
3. Inara E. Souza et al., - Rapid Epidemiologic Characterization of Cytomegalovirus Strains From Pediatric Bone Marrow Transplant Patients. - Infection Control and Hospital Epidemiology, 1998, 16,7, PP. 399-404.
4. СПИД и оппортунистические вирусные нейроинфекции. Под ред. Н.П. Глинских. - Екатеринбург, Изд. Ураль. Универ. - 1993, 226 с.
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и может быть использовано для диагностической цели идентификации вируса простого герпеса 1 типа (ВПГ), а также для решения научно-исследовательских задач по изучению этой группы вирусов. Получены высокоспецифичные праймеры, позволяющие выявлять ДНК ВПГ 1 типа для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) из различных клинических образцов. Выбранные уникальные олигонуклеотиды не дают перекрестных реакций с родственными видами, позволяют, ограничиваясь одноступенчатой процедурой проведения ПЦР, быстро и надежно определять наличие или отсутствие ДНК ВПГ 1 типа. 2 ил.
Синтетические олигонуклеотиды - праймеры, используемые для выявления ДНК вирусов простого герпеса 1 типа человека, имеющие следующий нуклеотидный состав: 5'CCCTAGATGAGGATCCGTACGCCC-3' 3'TTGTTTGGTGGGGAGCTCGCGGGG-5'
| WO 9806873 A1, 19.02.1998 | |||
| US 5354653 A, 11.10.1994 | |||
| WO 9214846 A1, 03.09.1992. |
