СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ ВИРУСНО-БАКТЕРИАЛЬНЫХ ШТАММОВ ИЗ МЕСТНОГО ОЧАГА ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ АССОЦИИРОВАННОЙ ВАКЦИНЫ ИЛИ ПОЛИВАЛЕНТНОЙ ГИПЕРИММУННОЙ СЫВОРОТКИ ПРОТИВ ЗАБОЛЕВАНИЙ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА Российский патент 2000 года по МПК A61K39/02 A61K39/12 A61K39/116 A61K39/295 A61K39/40 A61K39/42 A61K39/00 A61K39/108 A61K39/112 A61K39/15 A61K39/265 A61K39/155 A61K39/39 A61K39/395 C12N1/20 C12N7/00 

Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и биотехнологии, в частности к получению вакцин или сывороток против вирусно-бактериальных заболеваний крупного рогатого скота.

Известно, что против многих инфекционных заболеваний крупного рогатого скота (КРС) в настоящее время не разработаны вакцинные и сывороточные препараты (например, против лейкоза) и в ряде случаев не идентифицированы их возбудители. В связи с вышесказанным разработка ассоциированной вакцины или поливалентной гипериммунной сыворотки против местных вирусно-бактериальных заболеваний КРС имеет крайне важное значение для ветеринарии, животноводства и здравоохранения.

Известен способ получения препарата для приготовления иммуноглобулина "Поликаниглоб", используемого при лечении и профилактике вирусных инфекций, включающий раздельное выращивание культуральных штаммов парвовируса "Геркулес" ВГНКИ N 29, аденовируса типа-2 "Ада" ВГНКИ N 15 и вируса чумы плотоядных "ЭПМ" (Заявка на патент РФ N 94031759, МПК⁶ A 61 K 39/40, C 12 N 7/00, опубл. 20.11.96). Для получения иммуноглобулина лошадей-продуцентов иммунизируют раздельно указанными компонентами (культуральными штаммами) препарата по схеме: первая инъекция внутримышечно в область шеи и крупа в объеме 10 - 100 см³ каждого антигена, вторую инъекцию проводят на 7-й день в область шейных лимфоузлов в объеме 30 - 90 см³ каждого антигена, третью и четвертую инъекции осуществляют соответственно на 22-й и 37-й день внутривенно в объеме 80 - 120 см³ каждого антигена. На 44-й день забирают кровь от каждой группы лошадей, отделяют сыворотки, стерилизуют и смешивают в равных объемах. Затем смесь сывороток обрабатывают ПЭГ-6000 Д и полученный осадок очищают методом каскадной фильтрации на нитроцеллюлозных фильтрах с диаметром пор от 1,2 до 0,22 мкм. Иммуноглобулин "Поликаниглоб" может использоваться с профилактической и лечебной целями против парвовирусного энтерита, аденовирусных инфекций и чумы собак.

Однако поливалентные сыворотки, производимые с использованием препарата, изготовленного данным способом, могут быть неэффективными в различных регионах, например России, в связи с тем, что они были созданы на основе отличающихся в антигенном отношении вирусных штаммов, выделенных от животных, обитающих в других регионах страны. При приготовлении поливалентных сывороток с использованием препарата, изготовленного по указанному способу, производится разбавление специфических антител (на конечном этапе получения сыворотки), полученных от разных животных-продуцентов, инфицированных разными вирусными штаммами. В результате использование подобного рода поливалентных сывороток требует введения их больным животным в большом количестве, увеличивая таким образом нагрузку на их иммунную систему и получая при этом слабый лечебный и профилактический эффект. Кроме того, отсутствие в данном препарате антител против патогенных для животных бактерий ограничивает спектр действия иммуноглобулина и требует при лечении и профилактике заболеваний животных введения дополнительных сывороток, содержащих антитела против бактериальных антигенов.

Наиболее близким техническим решением (прототипом) является способ получения препарата (бактериальной вакцины) против некробактериоза крупного рогатого скота, включающий предварительное выделение из местного очага эпизоотического штамма некробактериоза КРС, его идентификацию, наработку биомассы культуры возбудителя микробиологическим способом, разделение выращенной культуры на биомассу и культуральную жидкость, экстракцию антигена из биомассы и параллельно осаждение экзотоксина из культуральной жидкости, инактивацию антигенов формалином, объединение инактивированных антигенов с последующим добавлением адъюванта на основе минерального масла и ланолина и получением целевого продукта (Патент РФ N 2043773, МПК⁶ A 61 K 39/114, опубл. 20.09.95).

Недостатком данного способа является узкий спектр действия препарата (вакцины), приготавливаемого на его основе, вследствие использования для приготовления препарата только одной эпизоотической культуры возбудителя некробактериоза.

Задачей предлагаемого изобретения является создание такого способа, который позволил бы получать универсальный препарат на основе местных вирусно-бактериальных штаммов для приготовления ассоциированной вакцины или поливалентной гипериммунной сыворотки против заболеваний КРС более широкого спектра действия.

Указанная задача решается тем, что в способе получения препарата на основе местных вирусно-бактериальных штаммов для приготовления ассоциированной вакцины или поливалентной гипериммунной сыворотки против заболеваний крупного рогатого скота, включающем предварительное выделение из местного очага одного из эпизоотических штаммов возбудителей болезней, его идентификацию, наработку биомассы культуры возбудителя микробиологическим способом и, при необходимости, инактивацию биомассы культуры возбудителя химическим реагентом, согласно изобретению для приготовления компонентов "А", "Б" и "В" препарата из местного очага выделяют все эпизоотические штаммы возбудителей болезней, как бактериального, так и вирусного происхождения, которые после идентификации раздельно культивируют, причем вирусные штаммы выращивают на монослоях культур клеток, например MDBK, первичнотрипсинизированной культуре клеток почек телят, с добавлением питательной среды (например Игла МЭМ) до получения конечной концентрации каждого вируса не менее 1•10⁶ ЦПД/50 на 1 мл с последующим сливом вируссодержащей суспензии каждого штамма в равных объемах в общую емкость при перемешивании с получением компонента "А" препарата, который инактивируют формалином в конечной концентрации не более 0,2 - 0,4 мас.% и инкубируют не менее 3-5 суток при комнатной температуре с получением компонента "Б" препарата, а бактериальные штаммы культивируют в матрацах на микробиологическом питательном агаре (например агар Хоттингера, ГРМ - агар), до получения конечной концентрации каждого штамма бактерий не менее 1•10¹¹ кл/мл с последующим их сбором в равных объемах в общую емкость с использованием раствора Эрла, полученную смесь биомассы штаммов бактерий инактивируют формалином в конечной концентрации 0,2 - 0,4 мас.% с последующей инкубацией не менее 3-5 суток при комнатной температуре с получением компонента "В" препарата.

Получение в препарате конечной концентрации вирусов менее 1•10⁶ ЦПД/50 на 1 мл и бактерий - менее 1•10¹¹ кл/мл значительно снижает эффективность действия приготовляемых на его основе ассоциированной вакцины (обеспечивает низкий иммунитет) и гипериммунной сыворотки, полученной путем иммунизации лошадей этим препаратом (низкий титр антител).

Для приготовления ассоциированной вакцины используют компоненты "Б" и "В" препарата, которые смешивают в равных соотношениях, а в полученную смесь дополнительно вводят иммуномодулятор, например T-активин, или тимарис, или ридостин, при соотношении иммуномодулятора и смеси компонентов "Б" и "В" препарата не более 1:10.

Иммуномодуляторы являются неспецифическими лекарственными средствами, обеспечивающими более эффективное действие вакцины без проявления негативных эффектов.

Ридостин (ВФС 42-245-7-94. Ридостин для инъекций. Введена в действие от 02.03.95) - иммуномодулятор, лекарственная форма dS-РНК киллерного штамма дрожжей Sac. cerevisiae, производится в НИКТИ БАВ ГНЦ ВБ "Вектор", г. Новосибирск. Получен путем ферментативного и механического разрушения клеточных стенок дрожжей и извлечения dS-РНК фракционированием раствором хлористого лития. Препарат восстанавливает иммунологическую активность, стимулирует процессы кроветворения.

T-активин (иммуномодулятор) - препарат полипептидной природы, получаемый из вилочковой железы (тимуса) КРС, нормализует количественные и функциональные показатели T-системы иммунитета, стимулирует продукцию лимфокинов, в т. ч. α- и γ- интерферона, восстанавливает активность T-киллеров (Справочник. Лекарственные средства, применяемые в медицине. - М., 1989, - с. 370).

Тимарис (иимуномодулятор) - препарат полипептидной природы, получаемый путем экстракции из вилочковой железы (тимуса) КРС, восстанавливает иммунологическую реактивность (регулирует количество и соотношение T- и B-лимфоцитов и их субпопуляций, стимулирует процессы кроветворения (Справочник. Лекарственные средства, применяемые в медицине. - М., 1989, - с. 381).

При увеличении соотношения иммуномодулятора и компонентов препарата более 1:10 отмечено значительное токсическое действие иммуномодуляторов на организм вакцинируемого животного.

Для получения поливалентной гипериммунной сыворотки вначале приготавливают в равных соотношениях смесь компонентов "Б" и "В", а также в равных соотношениях смесь компонентов "А" и "В", лошадям-продуцентам подкожно в область шеи проводят первую инъекцию смеси компонентов "Б" и "В" препарата в объеме 10 - 20 мл; через 7 суток - вторую инъекцию смеси компонентов "А" и "В" препарата в объеме 40 - 50 мл и еще через 7 суток - третью инъекцию смеси компонентов "А" и "В" препарата в объеме 150 - 200 мл; через не менее 1,5 месяца проводят вновь трехкратную иммунизацию аналогично тому как, было описано ранее; через 8-9 суток после третьей (последней) инъекции компонентов препарата у лошадей-продуцентов осуществляют через стерильную герметичную систему забор крови в количестве до 10 литров в бутыли и еще через 5-6 суток осуществляют повторный забор крови в том же объеме; причем в каждый полученный образец крови объемом 10 л вводят не более 300 мл 10%-ного раствора цитрата натрия, далее материал отстаивают в течение 12 - 24 часов при комнатной температуре и добавляют в каждый образец крови объемом 10 л 10 - 15 мл 30%-ного раствора хлористого кальция, бутыли с образцами крови встряхивают и повторно отстаивают в течение 12 - 24 часов при комнатной температуре до образования сыворотки с последующим ее сливом в отдельные емкости.

Препарат с тремя отдельными компонентами (компонент "А" - смесь живых вирусных штаммов, компонент "Б" - смесь инактивированных вирусных штаммов и компонент "В" - смесь инактивированных бактериальных штаммов), включающими штаммы возбудителей заболеваний, полученных из местного очага, позволяет приготавливать как ассоциированные вакцины, обеспечивающие более длительный и напряженный иммунитет, так и поливалентные гипериммунные сыворотки более широкого спектра действия и более специфичные для КРС данного региона, а значит и действующие более эффективно.

Пример 1. Технология получения препарата на основе вирусно-бактериальных штаммов из местного очага
В АО "Салаир" Маслянинского района Новосибирской области осенью 1992 года от телят, больных респираторными и кишечными заболеваниями инфекционной природы с септическими явлениями (температурная реакция 40,0 - 41,0^oC), с помощью простых (например агар Хоттингера, ГРМ - агар, тиогликолиевая среда) и дифференциально-диагностических микробиологических сред (среда Олькеницкого, Эндо, висмут-сульфитная) выделены Эшерихия коли и Сальмонеллы. Кроме того, путем проведения 4 пассажей на перевиваемой культуре клеток MDCK, выделены вирусы инфекционного ринотрахеита и парагриппа 3.

Выделенные вирусы нарабатывают на культуре клеток MDCK в конечной концентрации не менее 1•10⁶ ЦПД/50 на 1 мл. Вирусные биомассы смешивают и делят на две части, одну из которых (компонент "А") хранят при температуре -18^oC в отдельной емкости, а другую - смешивают с формалином в конечной его концентрации 0,3 мас.% и инкубируют при комнатной температуре в течение 3 - 5 суток с получением компонента "Б" препарата, который также хранят в холодильнике при -18^oC.

Полученные бактерии нарабатывают в матрацах на микробиологическом питательном агаре (ГРМ-агар) и собирают с помощью шпателя и раствора Эрла в отдельные емкости (конечная концентрация каждого вида бактерий составляет при этом 1•10¹¹ клеток на 1 мл). Оба вида бактерий смешивают вместе и к полученной смеси добавляют формальдегид в конечной концентрации 0,3%. После проведенной инкубации в течение 5 суток при комнатной температуре получают компонент "В" препарата, который хранят в холодильнике при +4^oC.

Пример 2. Технология приготовления ассоциированной вакцины против заболеваний крупного рогатого скота и исследование эффективности ее действия
Для приготовления ассоциированной вакцины используют компоненты "Б" и "В" препарата, которые смешивают в равных соотношениях, а в полученную смесь дополнительно вводят иимуномодулятор, например тимарис, в количестве 1 мл на 10 мл смеси компонентов "Б" и "В" препарата. Полученную ассоциированную вакцину исследуют на специфическую стерильность на культуре клеток MDCK и на микробиологической питательной среде (ГРМ - агар). Кроме того, эту вакцину исследуют на реактогенность и безвредность по ответной реакции организма лабораторных животных (белые мыши массой 14 - 16 г и морские свинки массой 200 - 250 г), которым вводят вакцину подкожно (в объеме 0,2 мл и 0,5 мл соответственно). Таким образом приготовленный препарат представляет собой вакцину на основе местных вирусных и бактериальных штаммов для конкретного животноводческого хозяйства (АО "Салаир").

Перед применением препарата в хозяйстве показатели реактогенности и безвредности оценивают на группе изолированных телят, используя при этом от 5 до 10 животных, которым вводят подкожно по 5 мл вакцины. Наблюдение за лабораторными и домашними животными проводилось в течение 14 - 20 дней. Общее время, связанное с приготовлением конечной формы вакцины составляло 1,5 месяца. После получения хороших результатов на изолированных телятах, вакцинации подвергают двукратно стельных сухостойных коров за 2 и 1 месяц до отела, а также телят в возрасте 25 - 30 дней и 2 месяца.

Для этого проводят подкожную иммунизацию животных вакциной в области шеи. Перед применением вакцину разводят в 50 мл растворителя (физиологический раствор). При этом 1 доза каждого компонента препарата составляет 2 мл первичной вакцинации и 6 мл при повторной вакцинации. В результате проведенной работы гибель КРС в хозяйстве снизилась в 3 раза по сравнению с предыдущими годами, когда данная работа не проводилась.

Пример 3. Технология получения поливалентной гипериммунной сыворотки против заболеваний КРС и исследование эффективности ее действия
Для получения поливалентной гипериммунной сыворотки вначале приготавливают в равных соотношениях смесь компонентов "Б" и "В" и смесь компонентов "А" и "В" заявляемого препарата. Таким образом приготовленные смеси на основе местных вирусных и бактериальных штаммов для конкретного животноводческого хозяйства (АО "Салаир") использовали для проведения трехкратной иммунизации трех лошадей. Вначале проводят первый цикл трехкратной иммунизации лошадей: животным-продуцентам подкожно в область шеи проводят первую инъекцию смеси компонентов "Б" и "В" препарата в объеме 10 - 20 мл. Через 7 суток проводят вторую инъекцию смеси компонентов "А" и "В" препарата в объеме 40 - 50 мл и еще через 7 суток - третью инъекцию смеси компонентов "А" и "В" препарата в объеме 150 - 200 мл. Затем через не менее 1,5 месяцев после последней иммунизации первого цикла проводят второй цикл иммунизации, аналогично первому. Через 8 - 9 суток после третьей (последней) инъекции компонентов препарата второго цикла иммунизации у лошадей-продуцентов осуществляют через стерильную герметичную систему забор крови в количестве до 10 литров в бутыли и еще через 5-6 суток осуществляют повторный забор крови в том же объеме. Причем в каждый полученный образец крови объемом 10 л вводят 300 мл 10%-ного раствора цитрата натрия. Далее материал отстаивают в течение 12 - 24 часов при комнатной температуре и добавляют в каждый образец крови объемом 10 л 10 - 15 мл 30%-ного раствора хлористого кальция. Бутыли с образцами крови встряхивают для образования пены с фибрином и повторно отстаивают в течение 12 - 24 часов при комнатной температуре до образования сыворотки с последующим ее сливом в отдельные емкости.

Перед применением поливалентной сыворотки в хозяйстве показатели ее реактогенности и безвредности оценивают на лабораторных животных (белые мыши массой 14 - 16 г и морские свинки массой 200 - 250 г), которым вводят сыворотку подкожно (в объеме 0,2 мл и 0,5 мл соответственно). Наблюдение за лабораторными и домашними животными проводят в течение 14 - 20 дней. Специфическая активность антител к вирусам инфекционного ринотрахеита и парагриппа в такой сыворотке составляла в реакции нейтрализации 1:512 - 1:1024, а к Э. коли и Сальмонеллам в реакции приципитации в геле по Оухтерлони 1:32 - 1: 128. Общее время, связанное с приготовлением конечной формы препарата, составляет 3-4 месяца. После получения хороших результатов испытания сыворотку вводят внутримышечно в объеме 5 - 10 мл однократно больным телятам в АО "Салаир" и здоровым с профилактической целью. В результате проведенной работы гибель КРС в хозяйстве снизилась в 3 раза по сравнению с предыдущими годами, когда данная работа не проводилась.

При использовании препарата, изготовленного предлагаемым способом, удается получать сыворотки, содержащие антитела ко всем возбудителям заболевания в высоких титрах, равных тем, которые получаются при иммунизации животных одним или двумя микроорганизмами.

В результате широкого внедрения поливалентных гипериммунных сывороток против местных вирусно-бактериальных заболеваний КРС предполагается погасить энзоотические очаги инфекционных заболеваний среди КРС, существенно снизить объем циркуляции соответствующих вирусов и микробов в природе, что уменьшит в свою очередь опасность инфицирования человека, других домашних и диких животных и птиц. При этом создастся возможность производить экологически чистые (касаясь вирусно-бактериальных загрязнений) мясомолочные продукты высокого качества.

Промышленная применимость. Изобретение может быть использовано в ветеринарии, прикладной микробиологии и вирусологии.

Изобретение предназначено для получения вакцин или сывороток против вирусно-бактериальных заболеваний крупного рогатого скота. Для приготовления компонентов "А", "Б" и "В" препарата из местного очага выделяют все эпизоотические штаммы возбудителей болезней бактериального и вирусного происхождения. После идентификации их раздельно культивируют. Вирусные штаммы выращивают на монослоях культур клеток, например MDBK. При этом добавляют питательную среду, например Игла МЭМ, до получения конечной концентрации каждого вируса не менее 1-10⁶ ЦПД/50 на 1 мл. Сливают вируссодержащую суспензию каждого штамма в равных объемах в общую емкость. Перемешивают и получают компонент "А" препарата. Часть компонента "А" инактивируют формалином в конечной концентрации не более 0,2-0,4 мас.%. Инкубируют не менее 3-5 суток при комнатной температуре. Получают компонент "Б" препарата. Бактериальные штаммы культивируют в матрацах на микробиологическом питательном агаре, например ГРМ-агаре. Получают конечную концентрацию каждого штамма бактерий не менее 1-10¹¹ кл/мл. Затем их собирают в равных объемах в общую емкость с использованием раствора Эрла. Смесь биомассы штаммов бактерий инактивируют формалином в конечной концентрации 0,2-0,4 мас.%. Инкубируют не менее 3-5 суток при комнатной температуре. Получают компонент "В" препарата. Изобретение позволяет получать универсальный препарат на основе местных вирусно-бактериальных штаммов более широкого спектра действия. 2 з.п. ф-лы.

1. Способ получения препарата на основе вирусно-бактериальных штаммов из местного очага для приготовления ассоциированной вакцины или поливалентной гипериммунной сыворотки против заболеваний крупного рогатого скота, включающий предварительное выделение из местного очага эпизоотических штаммов возбудителей болезней, их идентификацию, наработку биомассы культур возбудителей микробиологическим способом и, при необходимости, инактивацию полученной биомассы химическим реагентом, отличающийся тем, что для приготовления компонентов "А", "Б" и "В" препарата из местного очага выделяют все эпизоотические штаммы возбудителей болезней как бактериального, так и вирусного происхождения, которые после идентификации раздельно культивируют, причем вирусные штаммы выращивают на монослоях культур клеток, например MDBK, с добавлением питательной среды, например Игла МЭМ, до получения конечной концентрации каждого вируса не менее 1 - 10⁶ ЦПД/50 на 1 мл с последующим сливом вируссодержащей суспензии каждого штамма в равных объемах в общую емкость при перемешивании с получением компонента "А" препарата, часть которого инактивируют формалином в конечной концентрации не более 0,2 - 0,4 мас.% и инкубируют не менее 3 - 5 суток при комнатной температуре с получением компонента "Б" препарата, а бактериальные штаммы культивируют в матрацах на микробиологическом питательном агаре, например ГРМ-агаре, до получения конечной концентрации каждого штамма бактерий не менее 1 - 10¹¹ кл/мл с последующим их сбором в равных объемах в общую емкость с использованием раствора Эрла, полученную смесь биомассы штаммов бактерий инактивируют формалином в конечной концентрации 0,2 - 0,4 мас.% с последующей инкубацией не менее 3 - 5 суток при комнатной температуре с получением компонента "В" препарата. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для приготовления ассоциированной вакцины используют компоненты "Б" и "В" препарата, которые смешивают в равных соотношениях, а в полученную смесь дополнительно вводят иммуномодулятор, например Т-активин, или тимарис, или ридостин, при соотношении иммуномодулятора и смеси компонентов "Б" и "В" препарата не более 1 : 10. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что для получения поливалентной гипериммунной сыворотки вначале приготавливают в равных соотношениях смесь компонентов "Б" и "В", а также в равных соотношениях смесь компонентов "А" и "В", лошадям-продуцентам подкожно в область шеи проводят первую инъекцию смеси компонентов "Б" и "В" препарата в объеме 10 - 20 мл, через 7 суток - вторую инъекцию смеси компонентов "А" и "В" препарата в объеме 40 - 50 мл и еще через 7 суток - третью инъекцию смеси компонентов "А" и "В" препарата в объеме 150 - 200 мл, через не менее 1,5 месяца повторяют аналогичное трехкратное введение смеси компонентов, через 8 - 9 суток после третьей (последней) инъекции компонентов препарата у лошадей-продуцентов осуществляют через стерильную герметичную систему забор крови в количестве до 10 л в бутыли и еще через 5 - 6 суток осуществляют повторный забор крови в том же объеме, причем в каждый полученный образец крови объемом 10 л вводят не более 300 мл 10%-ного раствора цитрата натрия, далее материал отстаивают в течение 12 - 24 ч при комнатной температуре и добавляют в каждый образец крови объемом 10 л 10 - 15 мл 30%-ного раствора хлористого кальция, бутыли с образцами крови встряхивают и повторно отстаивают в течение 12 - 24 ч при комнатной температуре до образования сыворотки с последующим ее сливом в отдельные емкости.