СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ ВИРУСНЫХ АЭРОГЕННЫХ ИНФЕКЦИЙ Российский патент 1998 года по МПК A61K38/21 A61K39/12 

Изобретение относится к медицине, а именно к способам неспецифической иммунопрофилактики вирусных инфекций.

Вирусы венесуэльского энцефаломиелита лошадей (ВЭЛ), Марбург и Эбола относят к возбудителям заболеваний, вызывающим особо опасные (генерализованные) инфекции.

В отечественной и зарубежной научно-технической документации имеется небольшой объем информации по оценке лечебно-профилактического действия некоторых иммуномодуляторов при инфекциях Марбург [5, 8] Эбола [6, 7] и ВЭЛ [1, 2, 4] Все они касаются заболеваний, вызванных заражением животных и человека через кожные покровы. В то же время, такого рода данных практически не представлено в отношении восприимчивых макроорганизмов, инфицированных аэрогенным путем, хотя способ проникновения вируса через респираторный тракт может быть одним из основных при авариях, которые могут возникнуть в лабораторных условиях при работе с возбудителями вирусных заболеваний.

Проведение профилактических мероприятий в данном случае с использованием специфических иммунных сывороточных препаратов может оказаться менее эффективным по сравнению с их действием на макроорганизм, зараженный через кожные покровы [3] Поэтому остается актуальной проблема поиска эффективных неспецифических лекарственных средств при этих инфекциях.

Известны способы профилактики и лечения вирусных инфекций с использованием индуктором интерферона: двуспиральная рибонуклеиновая кислота [9] и реаферон ( α-2 интерферон, полученный генноинженерным путем) [10] вводимых в организм внутримышечным способом.

Известен способ профилактики инфекции Эбола у обезьян, зараженных внутримышечным способом, который включает в себя введение человеческого интерферона (внутримышечно) за 2 сут до заражения или через 1 ч после инфицирования с последующим продолжением курса профилактической обработки [14] В результате этих опытов не было отмечено различий в клинике и исходе заболевания между опытными и контрольными группами обезьян.

Недостатком известных способов является малая их профилактическая эффективность, т.к. в известных схемах введения в организм указанных индукторов интерферона не учитываются особенности (пути) инфицирования организма, что очень важно при его аэрогенном инфицировании вирусами ВЭЛ, Марбург и Эбола.

Наиболее близким техническим решением (прототипом) является способ профилактики инфекции, вызываемой вирусом ВЭЛ, включающий введение в организм препаратов, содержащих индуктор интерферона и/или иммуномодулятор, до начала или в период возможного попадания инфекции в данный организм [11] В качестве индуктора интерферона используют поли-ИЦ, стабилизированный поли-L-лизином и карбоксиметилцеллюлозой (поли-ИЦЛЦ). Поли-ИЦЛЦ индуцирует синтез интерферона в больших концентрациях у грызунов, приматов и человека. Препарат вводят в организм внутривенно и внутримышечно в дозе 0,3 и 3,0 мг/кг веса за 8 ч до инокуляции вируса ВЭЛ (штамм ТС-83).

Недостатками способа-прототипа являются высокая токсичность этого иммуномодулятора (гипертермия, поражение гематопоэтических органов, коагулопатия, вторичные геморрагические поражения, шок), накопление (кумуляция) при введении в организм животных и человека [12] и чрезвычайно высокая его стоимость [13] Все эти обстоятельства крайне осложняют возможность широкого использования препарата в медицине. Причем допустимые нетоксические дозы препарата при его парентеральном введении не гарантируют обеспечение профилактического эффекта при аэрогенных вариантах инфицирования организма вирусами ВЭЛ, Марбург и Эбола.

Задачей предлагаемого технического решения является создание такого способа, который позволил бы обеспечить повышение профилактического и экстренно-профилактического эффекта при возможных аэрогенных инфекциях, вызываемых вирусами ВЭЛ, Марбург и Эбола.

Указанная задача решается тем, что в способе профилактики аэрогенных инфекций, вызываемых вирусами ВЭЛ, Марбург и Эбола, включающем парентеральное введение в организм препаратов, содержащих индуктор интерферона и/или иммуномодулятор, до начала или в период возможного попадания инфекции в организм аэрогенным путем, согласно изобретению одновременно с внутримышечным введением препаратов в организм эти препараты дополнительно и в тех же дозах вводят интраназально с обеспечением распределения их по всему дыхательному тракту, причем в качестве профилактических препаратов используют реаферон или ридостин, или реаферон с ридостином, или реаферон с полирибонатом, или реаферон с ридостином и полирибонатом, которые вводят в организм не чаще двух раз в сутки в суммарных дозах: реаферон (1,0 100,0)•10⁶ МЕ/кг; ридостин 1,0 8,0 мг/кг; полирибонат 10,0 100,0 мг/кг.

Реаферон (ВФС-42-227 ВС-89) белок с молекулярной массой 18 КД, синтезированный в результате встраивания в генетический аппарат псевдомонады с помощью плазмиды G3 гена человеческого лейкоцитарного интерферона α-2 В качестве стабилизатора биологической активности содержит человеческий альбумин и маннит в конечной концентрации по 5 мг/кл. Удельная активность 4•10⁸ МЕ/мг белка.

Ридостин (ТУ 9291-008-00479979-94) ВФС 42-245-7-94 лекарственная форма dS-РНК киллерного штамма дрожжей Sac. cerevisiae, производится в НИКТИ БАВ ГНЦ ВБ "Вектор", г. Новосибирск. Получен путем ферментативного и механического разрушения клеточных стенок дрожжей и извлечения dS-РНК фракционированием раствором хлористого лития.

Полирибонат (ТУ 9291-007-00479979-94) ВФС 42-264-3-95 лекарственная форма РНК дрожжей, производится НИКТИ БАВ ГНЦ ВБ "Вектор". Содержание РНК в пересчете на сухое вещество достигает 93% а белка не более 0,7% ВФС - временные фармакопейные статьи разработаны в ГНЦ ВБ "Вектор" и утверждены и Государственном институте стандартизации им. Тарасевича (г. Москва).

При введении в организм доз препаратов меньших, чем дозы препаратов, указанные в предлагаемом техническом решении, не наблюдается профилактического эффекта. При введении в организм доз препаратов больших, чем дозы препаратов, указанные в настоящем изобретении, наблюдается значительное увеличение их токсичности.

Пример 1. Методика инфицирования лабораторных животных при исследовании профилактического действия препаратов.

В работе используют вирус ВЭЛ (штамм Тринидад), вирус Марбург (штамм Рорр) и вирус Эбола (штамм Заир вариант 8 М.С.).

Эксперименты проводят на морских свинках массой 180 200 г.

Аэрозольное заражение морских свинок осуществляют в малой динамической камере при относительной влажности воздуха 50 70% и температуре 20 - 24^oC.

При инфицировании вирусом ВЭЛ используют вируссодержащую суспензию, полученную путем культивирования возбудителя ВЭЛ на культуре клеток Vero роллерным способом. Дозы заражения составляют от 3 до 100 респираторных ЛД50 для подопытных животных.

При заражении вирусами Марбург и Эбола используют гомогенаты печени морских свинок, содержащих указанные вирусы. Дозы заражения составляют 5 20 респираторных доз ЛД50 для морских свинок.

Биологическую концентрацию вирусов Марбург и Эбола в пробах микроциклонов определяют по результатам титрования на морских свинках, которым внутрибрюшинно вводят материал в объеме 0,5 мл, и по методу бляшек на культуре клеток VERO соответственно.

Камера позволяет одновременно инфицировать 10 морских свинок. Скорость потока аэрозоля в канале экспонирования составляет 10 см/с, а время прохождения аэрозольным потоком всей камеры 5 7 с.

Распыление инфекционного материала осуществляют с помощью биологического генератора аэрозоля (БГ-2). Медианно-массовый диаметр частиц аэрозоля составляет 1,1±0,6 мкм.

Разведение аэрозоля проводят с помощью дозирующей аэрозольной приставки, изменяя диафрагмы выходного отверстия от 0,5 до 6 мм. Пробы аэрозоля отбирают в микроциклоны, в которые предварительно заливают по 10 мл сорбирующей жидкости, состоящей из раствора Хенкса, содержащего 2% (по объему) инактивированной сыворотки крови крупного рогатого скота, 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Объемная скорость отбора проб аэрозоля составляет 10,0±0,5 л/мин.

Биологическую концентрацию вируса в пробах микроциклонов определяют по результатам титрования на культуре клеток фибробластов эмбриона курицы по методу бляшек.

Наблюдение за животными ведут в течение 11 сут в случае инфицирования вирусом ВЭЛ и в течение 21 сут в случае инфицирования вирусами Марбург и Эбола. Специфичность гибели морских свинок оценивают по наличию бляшек на культуре клеток фибробластов эмбриона курицы при внесении на клеточный монослой 0,2 мл 10%-ной мозговой суспензии павшего животного.

Статистическую обработку полученных результатов проводят по методу Стьюдента и по таблицам Генеса.

Прежде чем начать экспериментальную работу по выбору оптимальных схем введения лекарственных препаратов проводят дополнительные исследования, связанные с изучением особенностей патогенетической картины заболевания морских свинок, аэрогенно инфицированных вирусами ВЭЛ, Марбург и Эбола. Животных заражают в аэрозольной камере дозой 10 респираторных ЛД50. Через определенные промежутки времени инфицированных животных вскрывают (после предварительной прижизненной отмывки органов и тканей от крови) и производят забор различных биопроб для вирусологического изучения. Концентрацию вируса во всех отобранных пробах определяют путем титрования по методу бляшек на монослое клеток фибробластов эмбриона курицы.

Проведенные исследования показывают, что органом первичного размножения вируса у морских свинок являются легкие. В процессе инфекции максимальных концентраций вирус достигает в обонятельных луковицах и больших полушариях головного мозга, селезенке и крови.

Отмечено, что за 4 12 ч перед появлением вируса в обонятельных луковицах головного мозга животных возбудитель заболевания регистрировали в обонятельной области полости носа. Это обстоятельство в совокупности с данными электронно-микроскопических исследований свидетельствует о возможности распространения вируса в головной мозг инфицированных животных по обонятельному пути.

В связи с вышеизложенным в опытах на аэрогенно зараженных морских свинках лекарственные вещества вводят как внутримышечным способом, так и интраназальным (нацеливаясь на доставку иммуномодуляторов к органам и клеткам первичного и вторичного размножения вируса).

Пример 2. Изучение эффективности экстренно-профилактического действия лекарственных препаратов на морских свинках, инфицированных вирусом ВЭЛ (Штамм Тринидад).

При изучении экстренно-профилактического действия препаратов аэрогенно инфицированным морским свинкам (10 респираторных ЛД50) вводят по отдельности и в различных сочетаниях лекарства следующим образом: реаферон в дозе 250 тыс. МЕ/голову через 2 ч после заражения и далее 2 раза в сутки в течение 10 дней; ридостин в дозе 1 мг/голову через 2 ч, 2 и 4 сут после заражения; полирибонат в дозе 5 мг/голову через 2 ч, 1 и 2 сут после заражения. Все препараты применяют, обрабатывая животных как внутримышечно, так и интраназально (под эфирным наркозом), разделяя инокулят на 2 равные части по объему (по 0,25 мл). Препарат с помощью микродозатора наносят по возможности на большую часть поверхности дыхательного тракта животных.

Результаты этих исследований представлены в табл. 1. Из приведенных данных следует, что защитное действие препаратов в той или иной степени проявляются в каждом из испытанных вариантов при экстренной профилактике заболевания у морских свинок. Наибольший процент выживших животных наблюдается при использовании ридостина и ридостина с реафероном и составляет 20% с вероятностью случайного отклонения p 0,05. Для варианта с использованием сочетания трех препаратов (реаферон, ридостин и полирибонат) процент выживших животных ниже, причем не наблюдается значимого отклонения этой величины от контроля. Зато средняя продолжительность жизни в этом случае возрастает на 3,2 сут (p 0,02).

Пример 3. Изучение эффективности профилактического действия препаратов на морских свинках, инфицированных вирусом Марбург (штамм Рорр).

При проведении исследований по изучению эффективности профилактического действия иммуномодуляторов в опытах на животных, инфицированных аэрозолем вируса Марбург, лекарственные препараты вводят в различных сочетаниях следующим образом: реаферон в дозе 250 тыс. МЕ/голову, ридостин в дозе 1 мг/голову, полирибонат в дозе 5 мг/голову. Введение препаратов осуществляют за 48, 24 ч до заражения, в момент инфицирования и через 24, 48, 72, 96 ч после заражения, обрабатывая животных как внутримышечно, так и интраназально (под эфирным наркозом), разделяя инокулят на две равные части по объему (по 0,25 мл).

Результаты этих исследований представлены в табл. 2.

Было отмечено, что все испытанные препараты при комбинированном применении обладают достоверным профилактическим эффектом (увеличение выживаемости животных и средней продолжительности их жизни).

Пример 4. Изучение экстренно-профилактического действия препаратов на морских свинках, инфицированных вирусами Марбург (штамм Рорр) и Эбола (штамм Заир вариант 8 М.С.)
С целью изучения экстренно-профилактического действия иммуномодуляторов в опытах на аэрогенно инфицированных (вирусами Марбург и Эбола) морских свинках лекарственные препараты вводят по отдельности и в различных сочетаниях следующим образом: реаферон в дозе 250 тыс.МЕ/голову через 2 ч после заражения и далее 2 раза в сутки в течение 2 недель; ридостин в дозе 1 мг/голову через 2 ч, 2 и 4 сут после заражения; полирибонат в дозе 5 мг/голову через 2 ч, 1 и 2 сут после заражения.

Все эти препараты использовали, обрабатывая животных как внутримышечно, так и интраназально (под эфирным наркозом), разделяя инокулят на 2 равные части по объему (по 0,25 мл).

Результаты этих исследований представлены в табл. 3 и 4.

Из анализа табл. 3 и 4 видно, что некоторый положительный эффект экстренной профилактики заболевания Марбург у морских свинок наблюдается только в случае применения ридостина (см. табл. 3). При этом уменьшается число погибших опытных животных (p 0,1), а их средняя продолжительность жизни увеличивается по сравнению с контрольной группой животных (p 0,15).

Анализируя результаты исследований, представленных в табл. 4, необходимо отметить, что лишь сочетанное введение ридостина и реаферона аэрозольно инфицированным вирусом Эбола морским свинкам вызывало значимый положительный эффект по увеличению средней продолжительности жизни этих животных по сравнению с контролем (p 0,04).

Таким образом, предлагаемый способ иммунопрофилактики позволяет получить положительный профилактический эффект с помощью ридостина и ридостина в сочетании с полирибонатом при аэрогенной инфекции ВЭЛ у животных. Сочетанное применение ридостина с реафероном и реаферона с полирибонатом до аэрогенного заражения вирусом Марбург вызывает увеличение выживаемости животных с вероятностью более 95% Проведение экстренно-профилактических мероприятий дает следующий положительный эффект на аэрогенно инфицированных животных:
при заболевании ВЭЛ внутримышечные и интраназальные введения морским свинкам ридостина или ридостина с реафероном увеличивает значимо коэффициент выживаемости животных (K_z) до 0,29; аналогичное введение ридостина с реафероном и полирибонатом существенно повышает среднюю продолжительность жизни (СПЖ) животных (p 0,02);
при заболевании Марбург внутримышечное и интраназальное применение ридостина создает защиту (K_z 0,2; p 0,10) и с вероятностью 85% увеличивает СПЖ на 2,4 сут у морских свинок;
при заболевании Эбола внутримышечные и интраназальные введения морским свинкам ридостина с реафероном достоверно p 0,04 повышает СПЖ на 2,9 сут.

Промышленная применимость. Изобретение может быть использовано в медицине и экспериментальной вирусологии при иммунопрофилактике особо опасных вирусных инфекций.

Источники информации.

1. Шубладзе А.К. Гайдамович С.Я. Гаврилов В.И. // Вопр. вирусол. 1959, N 3, с. 305 310.

2. Gibbs E.P.J.// Equine Veterinar J. 1976, Vol. 8, N 2, p. 66 71.

3. Ryzhikov A.B, Tkacheva N.V. Sergeev A.N. et. al.// 4th International aerosol Conf. Los Angeles, 29 aug. 2 sept. 1994.Abstr. Ed. Richard C. Flagen. Los Angeles, 1994, Vol. 2, p 723 724.

4. Wedum A.G.//Publ. Health Rep. 1964, Vol. 79, N 7, p. 619 633.

5. Anonymous//Br.Med.J. 1977, Vol. 1, p. 64 64.

6. Bowen E.T.W. Baskerville A. Contell K.et al. //Ebola virus haemorrhagic fever /Ed. S.R.Pattyn/-Elsevier.-North Holland, Amsterdam, New York, 1978, p. 245 251.

7. Markin V. A. Michailov V.V. Bogatikov G.Y. et al.// Int. Symp. "100 Years of virol". St. Petersburg, 21 25 sept. 1992. M. 1992, с. 57 58.

8. Stewart W. The interferon system. New York, 1979, 143 p.

9. Заявка Франции N 2433535, кл. C 07 H 21/02, опубл. 18.04.80.

10. Авт. свид. N 1680200, кл. A 61 K 37/66, опубл. 30.09.91.

11. Hilmos D.E. Stephen E.Z. Spertrel R.O. Levy H.B. Use of poly (ICLC) for the prophylaxis and treatment of venezuelan equine encephalomyelitis virus infection in nonhuman primates // Amer. Soc. Microbiol, 1978, vol. 1, p. 317 319 (прототип).

12. Индукторы интерферона // Серия "Взаимодействие вирусов и клетки"/ Под ред. Р.А.Кукайн и др. Рига, изд. "Зинатне", 1981, с. 11 13.

13. Дьяков С.И. Чижов Н.П. Сидоренко С.В. Современные антибиотики и противовирусные препараты в экспериментальной химиотерапии бактериальных и вирусных инфекций. Мн. Беларусь, 1988, с. 163 164.

14. Bowen E.T.W. Baskerville A.//Ebola virus haemorragic fever. Ed. by Pattyn S.R. North Holland, Amsterdam, N-Y. Elsevier, 1978, p. 245 251.

Использование: ветеринария, медицина, профилактика вирусных аэрогенных инфекций. Сущность изобретения: до начала и в период возможного заражения в организм вводят внутримышечной и интраназально реаферон и/или ридостин, и/или полирибонат. 4 табл.

Способ профилактики вирусных аэрогенных инфекций, включающий внутримышечное введение в организм препаратов, содержащих индуктор интерферона и/или иммуномодулятор, до начала или в период возможного попадания возбудителя инфекции в организм аэрогенным путем, отличающийся тем, что одновременно с внутримышечным введением препаратов в организм дополнительно осуществляют интраназальное введение тех же препаратов в тех же дозах, причем в качестве препаратов, содержащих индуктор интерферона и/или иммуномодулятор, используют реаферон или ридостин, или реаферон с ридостином, или реаферон с полирибонатом, или реаферон с ридостином и полирибонатом, которые вводят в организм не чаще двух раз в сутки в суммарных дозах: реаферон (1,0 100,0) • 10⁶ МЕ/кг, ридостин 1,0 8,0 мг/кг, полирибонат 10,0 100,0 мг/кг.