СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНА ПРОТИВ НЕКРОБАКТЕРИОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА Российский патент 1995 года по МПК A61K39/02 C12N1/20 

Изобретение относится к иммунобиотехнологии и касается получения антигена из возбудителя некробактериоза, который может быть использован в производстве диагностических и лечебно-профилактических препаратов.

Некробактериоз инфекционное заболевание крупного рогатого скота, овец, ягнят, лошадей. Пораженность стада в отдельных хозяйствах достигает 40-50 Симптоматические средства лечения не защищают животных от повторного заражения некробактериозом, в связи с чем становится очевидным актуальность проблемы получения высокоактивного антигена и использование его в составе профилактических и лечебных препаратов.

Известен способ получения вакцины для профилактики и лечения некробактериоза овец и коз, содержащей инактивированные формалином антигены из штаммов Bacteroides nodosus, F. necrophorum, Clostridium perfringens, Stapn. aureus и адъювант-фосфат кальция [1]
Однако вакцина "Pietivac" обладает невысокой эффективностью.

Известен также способ получения вакцины для профилактики некробактериоза крупного рогатого скота на основе инактивированного формалином эндотоксина F. necrophorum [2]
К недостаткам этой вакцины относятся низкая активность взятых в качестве антигенов эндотоксинов и вследствие этого непродолжительность иммунитета.

Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности является способ получения антигена для профилактики некробактериоза, включающий культивирование вирулентного штамма F. necrophorum, его инактивацию, отделение микробных клеток от культуральной жидкости и экстракцию антигена при механической дезинтеграции клеток (ультразвук) [3]
Однако известный антиген не проявляет высоких протективных свойств.

Целью изобретения является получение активного штаммово-специфического антигена из возбудителя некробактериоза.

Для этого используется бактериальная суспензия из местных штаммов возбудителя некробактериоза с оптимальной оптической плотностью и биологической активностью. Применяются относительно щадящие методы обработки бактериальной массы (лизис, гомогенизирование), способствующие сохранению активности клеточных компонентов. В качестве антигена используется цитоплазматическая фракция, содержащая липо-, полисахариды, белки и нуклеиновые кислоты, являющиеся инициаторами иммунного ответа у привитых животных.

Для осуществления способа используют местные штаммы возбудителя некробактериоза, которые по своим культурально-морфологическим, тинкториальным и биологическим свойствам не отличаются от штаммов, депонированных во Всесоюзном научно-контрольном институте ветеринарных препаратов. Их выращивают для получения бактериальной массы, которую инактивируют формалином, затем осаждают центрифугированием. Полученный осадок, содержащий бактериальные клетки, разводят в дистиллированной воде в соотношении 1: 20 и подвергают лизису замораживанием оттаиванием. Лизированную бактериальную массу дополнительно подвергают механическому разрушению в гомогенизаторе, затем центрифугируют. Полученный после центрифугирования осадок, содержащий клеточные оболочки, отбрасывают, а цитоплазматическую фракцию, состоящую из белков, нуклеиновых кислот и полисахаридов, используют в качестве антигена.

Культуру F. necrophorum выращивают в питательной среде на основе мясного гидролизата из непищевого сырья от крупного рогатого скота в течение 18 ч в анаэробных условиях при 37^оС. Критерием качественного культивирования является показатель степени размножения (2-3 ед.) бактериальной суспензии и ее патогенность, которая выявляется внутрибрюшинным введением проб белым мышам в дозе по 0,5 мл и гибелью их через 24-48 ч.

П р и м е р 1. Для приготовления антигена производят предварительный подбор штаммов путем серологической идентификации и выявления антител против возбудителя некробактериоза в сыворотках крупного рогатого скота.

Антигенную активность штаммов и подбор их для конкретного хозяйства проводят путем взятия проб крови от 5-10 животных из неблагополучного по некробактериозу хозяйства и испытания их в реакции непрямой иммунофлуоресценции. При этом отбирают штаммы с высокой антигенной активностью (титр антител 1:640, 1:1280 и выше).

Культуру F. necrophorum подобранного штамма выращивают в питательной среде на основе мясного гидролизата из непищевого сырья от крупного рогатого скота в течение 18 ч в анаэробных условиях при 37^оС.

В процессе культивирования определяют оптическую плотность бактериальной суспензии и рН.

Критериями качественного культивирования являются:
увеличение количества бактериальных клеток от 1-2 млн./см³ до 10⁷ 2˙10⁷ микроб.кл./см³;
содержание сырой бактериальной массы, равное 16-18 г на 1 л среды;
проявление патогенной активности в полученной культуре, которая выявляется внутрибрюшинным введением проб белым мышам в дозе 0,5 мл и гибелью их через 24-48 ч.

Полученная таким образом культура позволяет получать антиген с выраженной активностью.

В бактериальную суспензию добавляют 0,3% формалина и выдерживают при 4^оС в течение 24 ч для инактивации. После контроля биологической стерильности высевами на питательные среды микробную массу осаждают из суспензии в сепараторной центрифуге при 20 000 g. Для получения антигена используют осадок, который ресуспензируют в дистиллированной воде в соотношении 1:20. Полученную взвесь трижды замораживают и оттаивают при температуре 50 и 37^оС, что приводит к полному лизису всех микробных клеток. Бактериальную массу дополнительно подвергают механическому разрушению в гомогенизаторе в условиях охлаждения до 0^оС. В качестве антигенного после центрифугирования при 1,5 тыс. g, в течение 30 мин. Специфическая активность антигена представлена в табл. 1 и 2.

Иммуногенность антигена определяют на белых мышах подкожной вакцинацией в дозе 0,2 мл. Вакцинированных и невакцинированных (контрольных) животных через 14 дн. после иммунизации заражают титрованной культурой возбудителя в дозе 10 ЛД₅₀ гомологичного штамма в объеме 0,2 мл под кожу корня хвоста.

Как видно из табл. 1 и 2, выделенная фракция в сочетании с масляным адъювантом обладает высокой специфической и иммуногенной активностью.

Использование способа позволяет получать антиген некробактериозного возбудителя, обладающий высокой специфичностью, иммуногенной активностью, он прост в исполнении, так как не требует специального оборудования (термостатированных колонок, дезинтегратора).

Полученный таким способом антиген из различных местных штаммов возбудителя испытан с положительным результатом в ряде неблагополучных хозяйств на крупном рогатом скоте для профилактической вакцинации против некробактериоза.

Использование: ветеринарная микробиология, лечебно-профилактический препарат, штаммоспецифический антиген из возбудителя некробактериоза, профилактика некробактериозной инфекции. Сущность изобретения: для получения антигена предусмотрено использование местного или подобранного для каждого конкретного хозяйства штаммов возбудителя некробактериоза, которые выращивают в анаэробных условиях с целью получения микробной суспензии. Процесс культивирования заканчивают на стадии, в которой полученная культура характеризуется максимальной оптической плотностью и патогенностью для лабораторных животных (белые мыши). Антиген, извлеченный из анактивированной бактериальной массы и представляющий собой цитоплазматическую фракцию, обладает выраженной активностью в реакции непрямой иммунофлуоресцении с гомологичными сыворотками крови и с гетерологичными того же вида. Полученный антиген обладает по сравнению с полисахаридными антигенами иммуногенной активностью и вызывает невосприимчивость к заражению у 50 80% белых мышей через 14 20 дней после их иммунизации, а также предохраняет крупный рогатый скот от заражения некробактериозом в течение 6 мес после вакцинации (срок наблюдения). 2 табл.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНА ПРОТИВ НЕКРОБАКТЕРИОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА, включающий культивирование вирулентного штамма Fusobacterium necrophorum, его нактивацию, отделение микробных клеток от культуральной жидкости, экстракцию антигена с последующим выделением целевого продукта, отличающийся тем, что используют штамм Fusobacterium necrophorum, выделенный из местного очага и вызывающий гибель мышей, при внутрибрюшинном введении через 24 48 ч, культивирование проводят до накопления 10⁷ 2 · 10⁷ микр. кл/см³, экстракцию антигена осуществляют путем последовательного трехкратного замораживания оттаивания клеток и затем гомогенизацией в водной среде, полученный гомогенат центрифугируют при 15000 20 000 g и из супернатанта выделяют целевой продукт, представляющий собой цитоплазматическую фракцию.