СПОСОБ УПРАВЛЕНИЯ БИОХИМИЧЕСКИМ ПРОЦЕССОМ Российский патент 2000 года по МПК C12N1/38 G05D21/00 

Изобретение относится к методам синтеза биохимических соединений с использованием ферментов или микроорганизмов, а именно к области биохимических процессов, и может быть использовано в различных областях биотехнологического синтеза.

Для регулирования биохимических процессов в настоящее время приняты использование различных штаммов культур микроорганизмов, изменение температуры, состава питательной среды, газовой среды, отбора продукта биохимической реакции и т.д.

В биохимическом синтезе достаточно широко используют введение в состав культуральной среды антиоксидантов. Использование антиоксидантов позволяет повысить качество готового продукта по ряду показателей, определяющих его биологическую ценность, а также улучшить экологические характеристики получения продуктов на стадиях микробиосинтеза и на постферментационных стадиях (Победимский Д.Г., Кирпичников П.А. Регуляция химических процессов антиоксидантами. Методологические подходы и их реализация. "Журнал физической химии", 1991, т. 65, N7, с. 1745 - 1753). Использование антиоксидантов основано на следующих положительных аспектах процесса: достаточно высокая эффективность по предотвращению окисления метаболитов и целевых продуктов при низком расходе антиоксиданта, полная безвредность в условиях применения на микробиологическом уровне, невысокая стоимость, устойчивость при хранении и транспортировке, растворимость в воде и основных пищевых растворителях. Указанная работа не содержит практических рекомендаций по применению антиоксидантов в биохимическом синтезе.

Техническая задача, решаемая использованием настоящего изобретения, состоит в разработке способа "мягкого" управления процессом биохимического синтеза.

Технический результат, получаемый в результате реализации изобретения, состоит в повышении эффективности биохимического синтеза при практически неизменной себестоимости.

Для достижения указанного технического результата предложено при введении в культуральную среду вещества, обладающего свойствами антиоксиданта, предварительно из группы теоретически подходящих антиоксидантов опытным путем выбрать по меньшей мере одно вещество, оказывающее максимальное влияние на количественные характеристики заранее выбранного параметра или параметров процесса, определить зависимость их изменения от количества вводимых веществ и использовать полученные сведения для управления процессом.

В ходе проведения различных биохимических процессов было замечено, что введение антиоксидантов позволяет управлять процессом биохимического синтеза. Экспериментально отмечен факт, что для одной и той же реакции использование различных антиоксидантов может привести как к повышению скорости протекания реакции, так и к замедлению, вплоть до полного прекращения его протекания.

Известно, что в процессе биохимического синтеза происходит взаимодействие исходных, промежуточных и конечных продуктов с различными окислителями. В качестве окислителя могут выступать кислород воздуха, а также химические вещества, участвующие в биохимическом синтезе. Использование в биохимическом синтезе антиоксидантов может привести к увеличению скорости и эффективности роста микробной культуры, биосинтеза продуктов метаболизма, увеличению производительности биореакторов - ферментеров, снижению расходных коэффициентов по субстрату, при этом повышается качество готового продукта (биомассы или метаболита) по ряду показателей, определяющих его биологическую ценность. Вышеуказанные возможные следствия применения антиоксидантов обоснованы их способностью прекращать или по крайней мере замедлять нежелательные с точки зрения протекания биохимического процесса окислительные процессы.

К сожалению, в настоящий момент не создана общая теория управления биохимическим процессом действием антиоксидантов.

Из опытных данных следует, что при выборе веществ, которые могли бы управлять ходом биохимической реакции, следует учитывать пространственный фактор, поскольку необходимо обеспечить геометрические условия возможности подхода антиоксиданта к защищаемой группе молекулы, участвующей в биохимическом синтезе. Необходимо учесть также обратимость соединения антиоксиданта с защищаемой группой. Кроме того, следует учитывать возможность индивидуального взаимодействия вводимого антиоксиданта и защищаемой группы. При выборе антиоксиданта необходимо учесть также количество стадий в биохимической реакции, а также на какой стадии и какие группы необходимо защищать от окисления, или наоборот - необходимо активно окислить. Все это делает выбор подходящего антиоксиданта для конкретного биохимического процесса достаточно сложной задачей, в основном решаемой путем выбора опытным путем оптимального антиоксиданта из группы теоретически подходящих веществ.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

1. При сернокислотной переработке древесного сырья для получения гидролизата, содержащего углеводы - редуцирующие моносахара, введение оксиэтилидендифосфоновой кислоты в качестве антиоксиданта в количестве 0,005-0,075 мас. % от массы абсолютно сухого сырья повысило доброкачественность гидролизата за счет уменьшения количества продуктов распада моносахаров и привело к приросту биомассы ассоциации дрожжей Candida scottii, Candida tropicals, Hansenula anomala на полученной углеводородном сырье от 2,5 до 17,0%. В то же время использование в качестве антиоксиданта дифенохинона практически не повлияло на выход дрожжевой массы, а использование ионола при его концентрации 0,05 мас.% привело к уменьшению выхода дрожжей на 3,3%.

2. При получении биомассы дрожжей Candida maltosa на высокоочищенных нормальных алканах введение в качестве антиоксиданта ионола в количестве 0,01 мас.% к объему жидкостного потока привело к увеличению содержания истинного белка в дрожжевых клетках не менее чем на 6,5% с увеличением содержания незаменимых аминокислот: изолейцина - на 11%, треонина - на 11% и триптофана - на 20%. При этом ионол как антиоксидант при синтезе белка в дрожжах Candida scottii, выращиваемых на гидролизате растительного сырья, оказался малоэффективным, поскольку прирост выхода истинного белка в клетках составил лишь 1,5%. Ионол отрицательно влияет на выход истинного белка в клетках этанолассимилирующих дрожжей Candida valida.

3. При получении внеклеточных L-аминокислот ауксотрофными и генноинженерными бактериальными штаммами-продуцентами (Bacillus subtilis, Brevibacterium, Corynebacterum и др.) антиоксиданты могут или увеличивать выход продукта, или не влиять на выход. В частности, при синтезе L-лизина использование в качестве антиоксиданта ионола в количестве до 0,1 г/л при культивировании на мелассной среде в промышленном ферментере емкостью 100 м³ позволило на 13% увеличить выход. В тех же условиях на среде меласса + ацетат + ионол выход увеличился до 21,3%. При этом коэффициент конверсии ацетата в L-аминокислоту повышается с 17,9% до 22,7%.

В то же время для той же биотехнологической системы использование в качестве антиоксидантов индивидуально добавленных соединений таких, как калиевая соль фенозан-кислоты и динатриевой соли фосфата D,L-α-токоферола при дозировках от 5•10^-4 до 5•10^-3 г/л практически не повлияло на выход целевого продукта. Однако использование вышеуказанных веществ в тех же концентрациях одновременно привело к появлению синергического стимулирующего эффекта: выход L-лизина увеличился на 22,1 - 27,6% при сокращении времени ферментации в 1,1 раза.

4. Антиоксиданты могут влиять не только на выход метаболитов, но и на биохимические характеристики процесса. Подобным образом предложено регулировать процесс получения отдельных технически важных жирных кислот при выращивании липидообразующих дрожжей. Введение в качестве антиоксиданта основания Манниха привело к увеличению выхода олеиновой кислоты на 24% при уменьшении выхода пальмитиновой и гептадеценовой кислоты. При многостадийных процессах биохимического синтеза антиоксидант - основание Манниха сокращал время наступления стационарной фазы роста.

Во всех перечисленных примерах предварительно на основе теоретических представлений выбирали группу веществ, которые могли быть использованы в качестве антиоксидантов для всех стадий процесса, а затем на модельных реакциях выбирали конкретные вещества, оказывающие желаемое воздействие на выбранные параметры процесса.

Изобретение касается методов синтеза биохимических соединений с использованием ферментов или микроорганизмов, а именно биохимических процессов, и может быть использовано в различных областях биотехнологического синтеза. Предварительно из группы теоретически подходящих антиоксидантов опытным путем выбирают по меньшей мере одно вещество, оказывающее максимальное влияние на количественные характеристики заранее выбранного параметра процесса. Определяют зависимость их изменения от количества вводимых веществ. Управление процессом проводят с использованием указанной зависимости, что позволяет повысить эффективность биохимического синтеза.

Способ управления биохимическим процессом, включающий введение в культуральную среду вещества, обладающего свойствами антиоксиданта, отличающийся тем, что предварительно из группы теоретически подходящих антиоксидантов опытным путем выбирают, по меньшей мере, одно вещество, оказывающее максимальное влияние на количественные характеристики заранее выбранного параметра или параметров процесса, определяют зависимость их изменения от количества вводимых веществ с использованием которой управляют процессом.