СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ КЛИНИЧЕСКОГО ТЕЧЕНИЯ УВЕАЛЬНОЙ МЕЛАНОМЫ Российский патент 2003 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к офтальмологии, а именно к офтальмоонкологии, и предназначено для прогнозирования клинического течения увеальной меланомы с целью увеличения продолжительности жизни и улучшения качества жизни этого тяжелого контингента больных.

Увеальная меланома является чрезвычайно злокачественной опухолью органа зрения, представляющая угрозу не только зрительным функциям, но и жизни пациента. Частота заболеваемости увеальной меланомой по данным различных авторов колеблется от 2, 3 до 7 человек на 1 млн населения.

Традиционными методами лечения являются органосохранный и ликвидационный методы (энуклеация и экзентерация). Принято считать, что частота перехода в генерализованные формы определяется многими факторами, в том числе и способами лечения. Так, вероятность развития метастазов максимально высока (до 80%) после экзентерации; более низка (до 37%) при энуклеации глаза, низка (до 10%) при органосохранных методах лечения. Выбор того или иного метода, как и объем операции зависят от размеров опухоли и факта выхода опухоли за пределы глаза, что по сути определяет клиническую стадию заболевания. Естественно, что опухоль, образующая эпибульбарные узлы и дающая рост в орбиту, более агрессивна и имеет больше шансов к метастазированию, чем маленькая опухоль радужки или постэкваториальной зоны, легко устраняющаяся локальной иридэктомией или локальным облучением (брахитерапия). Ни один из методов не дает гарантии от метастазов. К настоящему моменту не известны способы профилактики и лечения метастазирования при увеальной меланоме.

Вопросы прогнозирования клинического течения увеальной меланомы, в том числе и, главным образом, метастазирования, сводятся к выделению в группу риска развития метастазов тех пациентов, у которых имеется один или более прогностически неблагоприятных фактора. К ним относятся: пожилой возраст пациента, проминенция опухоли более 7 мм, диаметр более 10 мм, эпителиоидный тип меланомы, преэкваториальная локализация опухоли; менее значимыми являются клинические симптомы: геморрагии на поверхности опухоли, грибовидная форма, прорыв мембраны Бруха, прорастание опухоли за пределы оболочек глаза с формированием эпибульбарных узлов. Каждому из этих факторов дается корреляционный коэффициент, который указывает, с какой вероятностью можно прогнозировать развитие метастазов [Opthalmic Pathology and Intraocular Tumors. - 1996-1997. -р.186-190. - American Academy of Ophthalmology. San-Francisco] .

Совокупность этих показателей и дает общую картину. Чем их больше, тем хуже прогноз для пациента. Пациенты группы риска находятся под наблюдением и являются на контроль через укороченные интервалы (3 месяца).

Однако практика показывает, что такая система отбора группы риска далека от совершенства. Как правило, среди 100 человек, находящихся под наблюдением, со сходными факторами риска или их комбинациями только 25 умирает от метастатической болезни. Как впрочем, возникает смертность среди тех пациентов с увеальной меланомой, которые не относятся к группе риска. Следовательно, существуют другие, более патогенетически значимые, не учтенные нами закономерности развития метастатического процесса.

В поисках решения проблемы мы обратились к изучению роли ангиогенеза в метастазировании заболевания. По мнению многих авторов, именно показатели ангиогенеза вносят существенный вклад в распространение опухолевых клеток из органа зрения по организму с оседанием в органах инвазии. Логическим объяснением коррелятивному феномену служит теория ангиогенеза Фолькмана, впервые высказанная им в 1974 году. Опухоль, считает ученый, без собственной сети может достичь высоты не более 2 мм, далее она должна построить собственную систему кровоснабжения (неоангиогенез), чтобы расти и достичь полной автономии (вершиной которой является генерализация неопластического процесса). Соответственно переход в это новое качественное состояние должен наступить при определенных количественных показателях состояния неоангиогенеза [Folkman J. 1996. - J. Natl. Cancer Inst. Vol.88. - p.1091-1092].

За аналог нашего изобретения мы взяли морфогистологический способ оценки ангиогенеза с подсчетом количества сосудов и определением типа неоваскуляризации на срезе опухоли [A. Foss. Reassessment of the PAS patterns in uveal melanoma. Br. J. Ophthalmology, 1997, vol.81, p.240-246]. Чем выше эти показатели, тем хуже их прогноз.

Однако наличие 3-х гистологических типов увеальной меланомы с различными прогнозами и частотой метастазирования при одинаковых сроках наблюдения и различной продолжительностью жизни существенно снижает достоверность и информативность этого способа. Так, например, веретеноклеточные и эпителиоидные (более агрессивные) опухоли могут иметь одинаковые показатели ангиогенеза (количество сосудов на 1 мм² при одинаковом типе сети и т.д.), но их прогнозы существенно различаются.

Тем не менее, ad priore приняв за истину эту теорию и экстраполировав ее на увеальную меланому, мы решили, что существующие оценки ангиогенеза конкретной опухоли и конкретного пациента являются более точными показателями, нежели клиническая стадия заболевания, тип клеточного строения и т.д.

Вместе с тем, мы предположили, что существуют иные факторы оценки ангиогенеза, позволяющие реально определить готовность опухоли к метастазированию. Количественное их определение могло бы быть прогностически более достоверным и информативным, чем вышеописанный метод.

Известно, что основными участниками ангиогенеза являются эндотелиальный фактор роста (VEGF) и его рецепторы (FLT и FLK/KDR-1). Именно VEGF регулирует пролиферацию и выход эндотелиальных клеток сосудистой выстилки (первый цикл) с последующим формированием новообразованных сосудов и проницаемостью последних для оторвавшихся от клеточного матрикса, готовых к метастазированию опухолевых клеток (второй цикл). Соответственно логично было предположить их в качестве прогностических маркеров.

Для проверки нашей гипотезы мы отобрали в архивах МНИИ глазных болезней имени Гельмгольца и Московской офтальмологической больницы 194 блока энуклеированных глаз с увеальной меланомой. Собрали тщательную информацию о больных, чьи глаза подверглись анализу (факт жизни или смерти, состояние здоровья на сегодняшний момент, отсутствие метастазов, причину смерти в случае, если она имела место, в том числе и данные аутопсии, дополнительно оценивались клинико-анамнестические показатели, размеры и гистологическое строение, форма, локализация и т.д. (всего 56 различных показателей). Среди отобранных нами глаз 100 блоков принадлежали пациентам-москвичам с короткой продолжительностью жизни и смертью от метастатического процесса, ассоциированного с увеальной меланомой, и 94 - больным, которые прожили более 5 лет и (до 25 лет) и не имели метастазов на момент проведения исследования.

Полученные данные подверглись тщательной обработке с использованием современных статистических методов анализа.

Анализ результатов настоящего исследования проводили в соответствии со стандартными алгоритмами вариационной статистики с помощью пакета программ SAS (Statistical Analysis System, version 6.09, USA).

Для каждого показателя, измеряемого по количественной шкале, рассчитывали среднегрупповое значение, среднее квадратическое отклонение и стандартную ошибку среднего. Для показателей, измеряемых по номинальной или ранговой шкале, оценивали соответствующие частоты выявления разных градаций каждого показателя в процентах.

Связи между показателями оценивали по величине коэффициентов линейной корреляции.

Статистическую достоверность различий между значениями количественных показателей в разных группах больных вычисляли с помощью модифицированного t-критерия Стьюдента для независимых выборок, а ранговых показателей - по χ2-критерию Фишера.

На этапе планирования исследования были разработаны несколько индексных показателей, позволяющих повысить надежность статистических оценок. В частности, из-за невозможности вычисления объема внутриглазной опухоли для увеальных меланом различной конфигурации был предложен индекс объема опухоли, определяемый по ранговым показателям независимо от оцененных ее высоты и диаметра и т.д.

Для показателей ангиогенеза были предложены следующие ранжировки и индексы. Если интенсивность окрашивания исследуемого среза оценивалась в 3-балльной системе, распределение окраски по срезу определялась как доля окрашенных клеток от общего числа клеток в поле зрения микроскопа х40.

Поскольку полученные результаты пилотажных исследований свидетельствовали о никем ранее не описанном феномене селективной экспрессии рецепторов FLT к VEGF в ядре опухолевой клетки, возник вопрос о роли указанного факта в патогенезе и прогнозе увеальной меланомы. С этой целью измеряли уровни экспрессии рецепторов как в ядре, так и в цитоплазме. Соотношение цитоплазматической и ядерной рецепции к VEGF вычисляли путем деления соответствующих рангов для FLT_C (в цитоплазме) и FLT_N (в ядре опухолевой клетки). Информативность показателей FLT_C/FLT_N и FLT_N/FLT_C сравнивали с помощью расчета корреляционных связей с показателями клиники, гистологии и данными о продолжительности жизни и метастазировании.

Статистический анализ показал, что при более агрессивных эпителиоидных меланомах достоверно чаще, на большем проценте клеток и с большей интенсивностью рецепция FLT к VEGF наблюдается в цитоплазме, в то время как при веретеноклеточных рецепторы FLT экспрессируются практически в равной степени и в ядре и в цитоплазме.

Интенсивность экспрессии рецепторов FLT в ядре и цитоплазме, как и процент позитивных клеток уменьшались по мере увеличения размеров опухоли и возраста пациентов. Кроме того, наблюдали перераспределение зоны интенсивной экспрессии с выходом ее из области ядра в цитоплазму. При этом индекс соотношения показателя экспрессии в ядре к аналогичному показателю в цитоплазме на опухолевых срезах уменьшался по мере прогрессирования заболевания.

Корреляционный анализ показал тесную взаимосвязь этих показателей с некоторыми клинико-гистоморфологическими симптомами. Так, индекс FLT_N/_C тесно коррелировал с некротическими изменениями в строме опухоли (k=-0,20, p= 0,07), с интенсивностью пигментации (k=0,22, p=0,04), с геморрагиями на поверхности опухоли (k=-0,20, p=0,08).

Но самое главное выявлена корреляционная взаимосвязь между временем выживания пациента - коэффициент корреляции k=0,3, p=0,009.

То есть, чем выше этот показатель, тем больше продолжительность жизни пациента.

Почти все пациенты с ранней смертностью от метастатического процесса и короткой продолжительностью жизни (n=81 из 100 исследуемых образцов) укладывались в градацию индекса менее 1,0. А все больные с большой продолжительностью жизни (более 5 лет) имели индекс FLT_N/_C более 2 (n=88 из 94 образцов). И в 27 срезах индекс соотношения колебался в диапазоне 1,0-2,0. Т.е. достоверность и информативность метода составляет 81%.

Таким образом, принимая во внимание полученные данные, а также их высокую взаимосвязь с клиническим течением заболевания (переходом в стадию генерализации), считаем, что этот маркер ангиогенеза можно использовать в качестве прогностического.

Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа, позволяющего прогнозировать клиническое течение увеальной меланомы, в частности вероятность развития метастазов у каждого конкретного больного. Техническим результатом является объективизация и повышение точности прогнозирования. Технический результат достигается за счет морфологического анализа удаленной опухоли с точным определением количественных показателей экспрессии рецептора Flt в ядре и цитоплазме опухолевых клеток и индекса их соотношения.

Предлагаемый способ прогнозирования осуществляют следующим способом.

После энуклеации глаза с увеальной меланомой готовят парафиновый блок по стандартной технологии.

Парафиновые срезы толщиной 3-5 микрон готовили по стандарной методике, депарафинировали в ксилоле и регидратировали в батарее спиртов.

Для "демаскировки" антигенов проводили прогревание срезов на водяной бане в предварительно нагретом до 95-99^oС цитратном буфере [DAKO, Копенгаген, Дания] в течение 30 минут. Затем стекла охлаждают при комнатной температуре в течение 15-20 минут и переносят в фосфатный буфер.

Для блокирования эндогенной пероксидазы срезы инкубируют 20 минут в темноте с 3% перекисью водорода, приготовленной на дистиллированной воде, а затем промывают 5 минут в фосфатном буфере.

Для блокирования неспецифического связывания антител срезы инкубируют 15 минут с 1% раствором бычьего сывороточного альбумина. Инкубация с первичными антителами проводится при 4^oС в течение ночи. После первичных антител стекла промывают 2 раза по 5 минут в фосфатном буфере. Инкубацию со вторыми антителами, меченными биотином [LSAB+kit, DAKO, Копенгаген, Дания], проводят при комнатной температуре в течение 20 минут и затем срезы промываются 2х5 минут. Инкубацию с антителами, меченными стрептавидином [LSAB+kit, DAKO, Копенгаген, Дания], проводят при комнатной температуре в течение 20 минут и затем срезы промывают 3х5 минут.

Для визуализации иммуногистохимической реакции используется система DAKO, Копенгаген, Дания. Срезы докрашиваются гематоксилином и заключаются в бальзам.

В качестве первичных антител использовали антитела к FLT-1 (козьи поликлональные антитела; разведение 1:100; Santa Cruz Biotech, США).

Реакцию оценивали с применением светового микроскопа (увеличение х10, х20, х40) по следующим критериям. Оценивали локализацию окрашивания в клетке (ядро, цитоплазма, мембрана). Количество положительных клеток оценивалось в зонах, содержащих их максимальное количество. В качестве негативного контроля использовалось проведение иммуногистохимической реакции без добавления первичных антител. Результаты окрашивания оценивались также по интенсивности и количеству положительных клеток, а также зонам локализации свечения.

Если интенсивность окрашивания исследуемого среза оценивалась в 3-балльной системе, распределение маркера по срезу определялось как доля иммунопозитивных клеток от общего числа клеток в поле зрения микроскопа х40, в случае определения процента позитивных (окрашенных) клеток для протекающей реакции использовали следующую ранжировку. В случае, где процент позитивных не превышал 30%, реакция расценивалась как слабая (1-я градация фактора). Если процент позитивных клеток был больше 30%, но меньше 60%, реакция считалась умеренно выраженной (градация 2), а если указанный процент превышал 60%, то это соответствовало 3-й градации выраженности реакции.

Высчитывали индекс соотношения FLT_N/_C соответствующих градаций интенсивности экспрессии FLT_ в ядре к аналогичному показателю в цитоплазме.

При выявлении этого показателя менее 1,0 считали прогноз для конкретного пациента с таким показателем в плане клинического течения увеальной меланомы неблагоприятным с короткой продолжительностью жизни и высокой вероятностью метастазирования. Пациента выделяли в группу риска.

Пример 1. Больной М. 36 лет. Поступил с диагнозом: увеальная меланома правого глаза в стадии T3N0M0. ОС - здоров. Проведено обследование у онколога с использованием УЗИ органов брюшной полости и рентгенографии органов грудной полости. Признаков инвазии нет.

В стационаре, учитывая размеры опухоли и невозможность проведения органосохранного лечения, ему предложена энуклеация. Операция была проведена по стандартной технологии с использованием криофиксации глазного яблока (для абластичности). Линия отсечения произведена в 15 мм от заднего полюса глаза. Гистологически верифицирована эпителиоидная меланома в стадии T3N0M0.

После парафинизации блоков по вышеописанной методике провели иммуногистохимические исследования рецептора FLT с определением зон его локализации, интенсивности рецепции и, соответственно, определением индекса FLT_ N/_C. Показатель оказался 0,5, то есть неблагоприятный в плане прогноза. Больной выделен в группу риска. Приглашали его для контроля через короткие интервалы (3 месяца). На второй контрольной явке на сцинтиграфии выявлены вторичные изменения в печени метастатического характера.

Взят на курс биотерапии с целью замедления прогрессирования метастатического процесса. Стабилизация была достигнута на 3-м курсе. Релапсация составила 19 месяцев. Затем процесс вновь прогрессировал.

Пример 2. Больная М. 67 лет. Обратилась с жалобами на ухудшение зрения на правом глазу. Клинически и по УЗИ-данным определяется увеальная меланома огромных размеров на левом глазу. Безальтернативным методом лечения конкретного случая признана энуклеация, которая и произведена в условиях стационара. Гистологически верифицирована смешанноклеточная меланома.

Далее согласно описанной методике произведены иммуногистохимические исследования с определением индекса FLT_N/_C. Он оказался равным 3. При продолжительном наблюдении за больной (свыше 5 лет) с контролем соматического состояния и ревизией наиболее часто поддающихся инвазии органов признаков генерализации не установлено.

Изобретение относится к области медицины, в частности офтальмологии, а именно к офтальмоонкологии, и предназначено для прогнозирования клинического течения увеальной меланомы, в частности вероятности появления метастазов, с целью проведения своевременного и адекватного лечения и увеличения продолжительности жизни тяжелого контингента больных. Проводят точный морфологический анализ клеток удаленной опухоли с определением поочередно процента иммунопозитивных клеток, экспрессирующих рецептор FLT в ядре и цитоплазме, по отношению к общему количеству опухолевых клеток в поле зрения и индекса соотношения ранга FLT в ядре к рангу FLT в цитоплазме и при величине индекса менее 1 прогнозируют высокую вероятность метастазирования. Способ позволяет с высокой точностью прогнозировать вероятность появления метастазов при увеальной меланоме.

Способ прогнозирования клинического течения увеальной меланомы, включающий морфологический анализ клеток удаленной опухоли, отличающийся тем, что определяют поочередно процент иммунопозитивных клеток, экспрессирующих рецептор FLT в ядре и цитоплазме, по отношению к общему количеству опухолевых клеток в поле зрения, ранжируют эти проценты в соответствии с градацией 1, 2, 3, где процент позитивных клеток до 30% включительно градируется как 1, от 31 до 60% включительно - как 2, а выше 60% - как 3, определяют индекс соотношения ранга FLT в ядре к рангу FLT в цитоплазме и при величине индекса менее 1 прогнозируют высокую вероятность метастазирования.