ПОЛИМЕРНЫЙ КОНЪЮГАТ, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ Российский патент 2000 года по МПК A61K47/48 C08F220/36 C08F220/36 C08F220/56 C08F220/60 

Настоящее изобретение относится к водорастворимому полимерносвязанному камптотецину и производным полимерносвязанного камптотецина, наделенным противоопухолевой активностью, к способу их получения и к содержащим их лекарственным препаратом.

Камптотецин представляет алкалоид, выделенный из листьев и коры Camptotheca acumihata; известны также другие аналоги камптотецина, которые получены полусинтезом или полным синтезом из камптотецина: см.: J.Amer. Chem. Soc. 94(10), 3631, 1972, J. Chem. Soc. D. (7), 404, (1970); патент США N 4981969 (Jan. I, 1991), патент США N 5049668 (Sep. 17, 1991).

Камптотецин имеет пентациклическую структуру, состоящую из системы конденсированных колец, образующей хинолиновое кольцо (кольца A и B), пирролидиновое кольцо (кольцо C), пиридиновое кольцо (кольцо D) и α -гидрокси- δ -лактоновую составляющую (кольцо E).

Камптотецин и несколько его производных, замещенных в кольце A, проявляют антиопухолевую активность против множества плотных опухолевых линий, включая клеточные линии, невосприимчивые к химикотерапевтическим средствам (см. : J. Chem. Pharmacol. 30, 770 (1990); Cancer Chemother Pharmacol. 28, 192 (1991)).

Камптотецин, а также большинство его производных практически нерастворимы в наполнителях, подходящих для парентерального введения, из-за слабой основности атома азота хинона. Предлагалось несколько водорастворимых пролекарств для того, чтобы солюбилизировать камптотецин, например, производные 20-O-фосфата или 20-O-ациламино, которые можно протонировать посредством минеральных кислот, обеспечивая таким образом растворимость в воде: см.: патент США N 4943579 (Jul. 24, 1990).

Введение таких лекарственных средств связано с побочным токсическим действием, включая гематологическое и желудочно-кишечное. Были предприняты многочисленные попытки для улучшения терапевтического индекса камптотецина путем модификации его структуры.

Настоящее изобретение обеспечивает полимерные конъюгаты камптотецина, которые являются водорастворимыми и обладают противоопухолевой активностью in vivo и пониженной токсичностью. Более конкретно, изобретение обеспечивает полимерный конъюгат, который обозначен здесь как A, и который состоит по существу из:
(i) от 60 до 99 мол.% N-(2-гидроксипропил)метакрилоиламидных звеньев, представленных формулой 1

(ii) от 1 до 40 мол. % 20-O-(N-метакрилоиламиноацил)камптотециновых звеньев, представленных формулой 2

в которой SPA представляет пространственную группу, имеющую соответствующие концевые амино- и карбонильные группы, которые разделены, по крайней мере, тремя атомами, и O-CPT представляет остаток камптотецина, при этом C-20 группа камптотецина связана с концевой карбонильной группой пространственной группы SPA; и
(iii) от 0 до 10 мол. % N-метакрилоилглицина или N-(2-гидроксипропил)метакрилоилглицинамидных звеньев, представленных формулой 3

вкоторойZпредставляетгидроксиилиостатокформулы-NH-CH₂-CH(OH)-CH₃.

Изобретение также обеспечивает способ получения полимерного конъюгата, который определен выше, при этом способ включает взаимодействие производной 20-O-ациламино-камптотецина формулы 7
H-(SPA)-O-CPT 7
в которой /A/ и O-CPT являются такими, как они определены выше, с полимером, состоящим по существу из:
(i) от 60 до 90 мол.% N-(2-гидроксипропил)метакрилоиламидных звеньев, представленных формулой 1

и
(iv) от 40 до 1 мол.% N-метилакрилоилглициновых звеньев, представленных формулой 4

в которой R₂ представляет (a) остаток активного сложного эфира или (b) гидрокси; и возможное замещение остаточных групп активного сложного эфира 1-амино-2-пропанолом.

Полимерный конъюгат A содержит N-(2-гидроксипропил)метакрилоиламидные звенья, представленные формулой 1, в количестве 60 мол.% или выше, например, по крайней мере, 80 мол.% или, по крайней мере, 85 мол.%. Эти звенья могут присутствовать в количестве от 91 до 98 мол.%. Конъюгат может содержать от 1 до 40 мол. % 20-O-(N-метакрилоилглициламиноацил)камптотециновых звеньев, представленных формулой 2, например, от 1 до 20 мол.% этих звеньев.

Конъюгат может содержать от 1 до 8 мол.%, например, от 2 до 6 мол.% этих звеньев.

Пространственная группа SPA может иметь от трех до двенадцати, например, от шести до девяти атомов. Обычно группа является чувствительной к внутриклеточному гидролизу. Предпочтительно она является устойчивой к внеклеточному гидролизу. Пространственная группа может быть пептидной промежуточной группой, содержащей, например, от 1 до 4 или от 2 до 4 аминокислотных остатков. Промежуточная группа может, таким образом, быть дипептидом, трипептидом или тетрапептидом.

Предпочтительно, пространственную группу SPA выбирают из Ala-Gly, Phe-Gly, Phe-Phe, Leu-Gly, Val-Ala, Phe-Ala, Leu-Phe, Leu-Ala, Phe-Leu-Gly, Phe-Phe-Leu, Leu-Leu-Gly, Phe-Tyr-Ala, Phe-Gly-Phe, Phe-Phe-Gly и Phe-Leu-Gly-Phe. Альтернативно пространственная группа /A/ представляет группу формулы HN-Y-CO, в которой Y представляет C₃-C₆-линейный или разветвленный алкил, например, -(CH₂)_n-, в котором n равно 3, 4, 5 или 6.

Альтернативно пространственная группа SPA является группой формулы Ala-Gly-NH-Y-CO, Phe-Gly-NH-Y-CO, Phe-Phe-NH-Y-CO-, Leu-Gly-NH-Y-CO-, Val-Ala-NH-Y-CO-, Phe-Ala-NH-Y-CO, Leu-Phe-NH-Y-CO-, Leu-Ala-NH-Y-CO-, Phe-Leu-Gly-NH-Y-CO-, Phe-Phe-Leu-NH-Y-CO-, Leu-Leu-Gly-NH-Y-CO-, Phe-Tyr-Ala-NH-Y-CO-, Phe-Gly-Phe-NH-Y-CO-, Phe-Phe-Gly-NH-Y-CO- или Phe-Leu-Gly-Phe-NH-Y-CO-, где Y имеет те же самые значения, которые указаны выше.

Остаток камптотецина обозначен O-CPT. Камптотецин может быть самим камптотецином или его аналогом, например, A-кольцевым аналогом. Такой A-кольцевой аналог представляет, таким образом, камптотецин, замещенный в A-кольце. Камптотецин может быть в природной S-форме или в R-форме или в смеси R- и S-формы (рацемическая смесь). Соответствующие остатки камптотецина O-CPT обозначены формулой 5

в которой R₁ представляет, например, водород, гидрокси-, или амино-, или метилендиоксигруппу, связанную с двумя смежными атомами углерода в A-кольце. Предпочтительно, R₁ представляет водород, 9-, 10-, 11- или 12-гидрокси, 9- или 10-нитро-, 9- или 10-амино- или 10-, 11-метилендиокси. Более предпочтительными являются остатки камптотецина формулы 6

в которой R₁ является таким, как он определен выше.

Предпочтительно звенья формулы 2 присутствуют в количестве от 1 до 10 мол. %, например, от 0,5 до 5 мол.%. Также предпочтительно, чтобы содержание камптотецина составляло от 1 до 10% (вес/вес), более предпочтительно от 4 до 8% (вес/вес) относительно полимерного компонента конъюгата.

Изобретение также обеспечивает производную 20-O-ациламино-камптотецина формулы 7, которая определена выше. Настоящее изобретение, кроме того, обеспечивает способ получения производной 20-O-ациоаминокамптотецина, который включает конденсацию камптотецина с N-замещенной аминоацильной производной формулы 8
R₃-SPA-P, 8
в которой SPA является такой, как она определена выше, и R₃ представляет защитную группу для амино, например, t-boc, CBZ, FMOC, трифенилсилил, дифенилметилен, или трифенилметил, и P является остатком активного сложного эфира, например, p-нитрофенокси, пентафторфенокси или N-гидроксисукцинимидо, в присутствии активирующего агента, например, 4-диметиламинопиридина, для получения N-защищенного-20-O-(ациламино) соединения, представленного формулой 9
R₃- SPA-/O-CPT/, 9
в которой R₃, SPA и /O-CPT/ являются такими, как они определены выше, и удаление N-защитной группы из полученного соединения.

Получение соединений формулы 8 осуществляют в соответствии со стандартными методиками синтеза, которые хорошо известны из литературы. Подходящие N-защищенные аминоацильные производные формулы 8 включают N-тритил-L-фенил-аланил-L-лейцил-глицил-p-нитрофениловый эфир (8a) или N-тритил-глицил-L-лейцил-глицил-p-нитрофениловый эфир (8b) или 6-N-тритилгексаноил-p-нитрофениловый эфир (8c). Некоторые производные формулы 8 и их получение описаны также в нашей находящейся на совместном рассмотрении Международной заявке на патент N PCT/EP 94/01100.

Таким образом, можно допустить, например, взаимодействие камптотецина с молярным избытком, например, с 5-кратным молярным избытком или большим, главным образом 2 мол. эквивалентом, N-защищенной аминоацильной производной формулы 5 в безводном растворителе, например, безводном диметилформамиде или диметилсульфоксиде, в присутствии активирующего агента, например, 4-диметиламинопиридина. В этом способе замещенную аминокислоту вводят в положение C-20 молекулы камптотецина. Реакцию можно обычно осуществить в течение времени от 8 до 24 часов. Реакцию обычно проводят при температуре от 15 до 40^oC.

Следует отметить, что следуя таким реакционным условиям, 9-аминокамптотецин пространственно специфически взаимодействует в C-20-гидроксиположении, что обусловлено слабой основностью 9-аминогруппы.

Защитную группу R₃ для амино удаляют посредством соответствующего средства, устраняющего защиту, при этом получают производную 20-O-ациламино-камптотецина формулы 7. Следовательно, устранение защиты может быть достигнуто путем обработки уксусной кислотой или путем восстановления. Следовательно, может быть также использован гидрогенолиз.

Конденсацию производной 20-O-ациламино-камптотецина формулы 7 с полимером, состоящим по существу из N-(2-гидроксипропил)метакрилоиламидных звеньев формулы 1 в количестве от 60 до 99 мол.% и N-метакрилоиламидных звеньев формулы 4 в количестве от 40 до 1 мол.% и возможно последующее замещение остаточных групп активного эфира осуществляют в условиях, способных сохранить природу связи между камптотецином и промежуточными группами /A/, а также свойства конъюгата.

Полимеры, состоящие по существу из N-(2-гидроксипропил)метакрилоиламидных звеньев формулы 1 в количестве от 60 до 99 мол.% и N-метакрилоилглициновых звеньев формулы 4 в количестве от 40 до 1 мол.%, получают путем сополимеризации N-(2-гидроксипропил)метакриламида с N-метакрилоилглицином или с производными активного N-метакрилоиглицинового эфира, которые описаны в Makromol. Chem. 178, (1977). R₂ может представлять фенилоксигруппу, которая замещена в фенильном кольце одной или несколькими группами, оттягивающими электроны. Примеры подходящих групп, оттягивающих электроны, включают нитро-(-NO₂) и галоген. R₂ является предпочтительно отщепляемой группой

в которой L является группой, оттягивающей электроны, например, -NO₂ или галогеном, например, фтором или хлором, и m является целым числом от 1 до 5, типично от 1 до 3, предпочтительно 1 или 2. Предпочтительно R₂ является p-нитрофеноксигруппой или 2,4-дихлорфеноксигруппой.

Предпочтительно реакцию между полимером, в котором R₂ представляет (a) остаток активного эфира, и соединением формулы 7 для получения полимерного конъюгата изобретения осуществляют в безводном полярном органическом растворителе, например, диметилформамиде или диметилсульфоксиде. Реакцию можно обычно осуществлять в течение времени от 8 до 24 часов. Реакцию проводят при температуре от 15 до 30^oC, предпочтительно при комнатной температуре в течение 15 часов; затем можно осуществить аминолиз остаточного активного эфира в присутствии 1-амино-2-пропанола при комнатной температуре в течение времени от 0,5 до 1 часа. Этот конъюгат соответственно осаждают ацетоном, растворенным в этаноле, и переосаждают ацетоном.

В другом методе для того, чтобы получить полимерный конъюгат изобретения, реакцию между полимером, в котором R₂ представляет гидроксигруппу (b), и соединением формулы 7 осуществляют в безводном полярном растворителе, например, диметилформамиде или диметилсульфоксиде в присутствии конденсирующего вещества, например, 2-этокси-1-этоксикарбонил-1,2-дигидрохинолина. Реакцию обычно можно осуществлять в течение времени от 8 до 24 часов. Реакцию обычно проводят при температуре от 15 до 30^oC, предпочтительно при комнатной температуре в течение 15 часов; затем конъюгат можно осадить ацетоном, растворить в этаноле и переосадить ацетоном.

Например, полимер, в котором R₂ представляет (a) остаток активного эфира, обеспеченный при концентрации 14% (вес/об.) в безводном диметилсульфоксиде, обрабатывают производной 20-O-аминоацилкамптотецина формулы 7, в количестве 3% (вес/об.) при комнатной температуре в течение 15 часов. Затем добавляют 1-амино-2-пропанол, 0,1% (вес/об.), и реакционную смесь поддеррживают при комнатной температуре в течение 1 часа. Конъюгат можно осадить ацетоном, затем растворить абсолютным этанолом при концентрации 10% (вес/об.) и осадить опять ацетоном для получения нейтрального камптотецинового конъюгата согласно изобретению.

В другом примере полимер, в котором R₂ представляет (b) гидрокси, обеспеченный при концентрации 15% (вес/об.) в безводном диметилсульфоксиде, обрабатывают производной 20-O-аминоацилкамптотецина формулы 7, 3% (вес/об.), в присутствии 2-этокси-1-этоксикарбонил-1,2-дигидрохинолина, 1,3% (вес/об.) при комнатной температуре в течение 15 часов. Затем, чтобы вызвать осаждение, добавляют ацетон, осадок растворяют абсолютным этанолом при концентрации 10% (вес/об.) и опять производят осаждение путем добавления ацетона до получения полимерного конъюгата в соответствии с изобретением.

Содержание активного лекарственного вещества, например, камптотецина или его A-кольцевого аналога, в полимерных конъюгатах изобретения определяют HPLC (жидкостной хроматографией высокого давления) или спектроскопическим анализом поглощательной способности.

Полимерные конъюгаты камптотецина и его A-кольцевые аналоги, описанные в настоящем изобретении, наделены улучшенной водорастворимостью и пониженной токсичностью. Конъюгаты проявляют хорошую водорастворимость, биосовместимость и выделяют камптотецин в плазму или после усвоения в клетки путем ферментативного расщепления.

Биологическая активность
Сополимер N-(2-гидроксипропил)метакриламида, 20-O-/N-метакрилоилглицил/камптотецина и N-(2-лейцилглицил)камптотецина и N-(2-гидроксипропил)метакрилоилглицинамида (A2) испытывали на голой мыши, которой сделали пересадку рака толстой кишки - HT29 (Таблица 1), и на преждевременно рожденной мыши с запущенной мышиной ретикулоклеточной саркомой M5076 (Таблицы 2 и 3) в сравнении со свободным камптотецином (CPT).

При сравнении с камптотецином для производной полимерносвязанного камптотецина A2 наблюдали во всех экспериментах более высокую ударную активность. Заслуживает внимания тот факт, что в эксперименте с раком толстой кишки - HT29 обнаружили вылеченную мышь.

Противоопухолевую активность испытывали при той же самой схеме лечения для A2 и CPT.

Следует отметить, что было найдено, что полимерносвязанный камптотецин A2 сильно растворим в воде и растворим в физиологическом растворе и его вводили внутривенно, тогда как CPT растворяли в смеси воды и Tween 80.

Получение лекарства и его введение
Соединение A2 непосредственно перед использованием растворили в дистиллированной воде и концентрацию проверили спектрофотометрически при 370 нанометрах (E1% 57,18).

Камптотецин (CPT) растворили в дистиллированной воде 10% раствором Tween'a. Лечение осуществляли внутривенно в количестве 10 мл/кг массы тела, а контрольную мышь подвергли обработке дистиллированной водой.

Опухоли
Рак толстой кишки пересадили подкожно швейцарской голой мыши, используя 15-20 мг опухолевых клеток. Мышиную ретикулоклеточную саркому M5076 поддерживали путем последовательных внутримышечных пассажей и подкожной пересадки (5•10⁵ клеток/мышь) сходной мыши C57B1/6.

Все животные были от Charles River Calco, Como, Италия.

Использовали 10 обычных мышей/группа и 8 мышей с атимией.

Обычные мыши весили от 20 до 22 г и их поддерживали при стандартных лабораторных условиях.

Мышиную колонию при определенном режиме испытывали на отсутствие антител согласно перечня патогенных микроорганизмов, включая гепатит, Sendai вирус и Mycoplasma Purmonis.

Оценка противоопухолевой активности и токсичности
Развитие опухоли определяли посредством штангенциркуля, и вес опухоли подсчитывали согласно Geran et al. (см.: Cancer Chem. Rep. Part 3,3 (2) ed. 3, ppi-103, 1972). Противоопухолевую активность выражали в виде процентного содержания угнетения роста опухоли (% T/I), используя следующую формулу:

Среднее увеличение времени жизни (T/C%) вычисляли, используя следующую формулу:

Вылеченными мышами были мыши без опухоли в конце эксперимента. Токсичность оценивали на основе уменьшения массы тела и макроскопических данных аутопсии главным образом с точки зрения уменьшения размера селезенки и печени.

Токсичность
Токсичность сополимера N-(2-гидроксипропил)метакриламида, 20-O-/N-метакрилоилглицина-L-фенилаланил-L-лейцилглицил/камптотецина и N-(2-гидроксипропил)метакрилоилглицинамида (А2) оценивали на здоровых мышах C57BI/F, подвергнутых внутривенному лечению, в сравнении с камптотецином (CPT).

Значения LD₁₀ ⁽¹⁾ и LD₅₀ ⁽²⁾ для мышей C57BI/F были следующими:
Соединение А2 LD₁₀ 129 мг/мг, LD₅₀ 151 мг/мг.

Cоединение СРТ LD₁₀ 16,9 мг/мг, LD₅₀ 43,4 мг/мг.

(1) LD₁₀: доза, включающая 10% мертвых мышей.

(2) LD₅₀: доза, включающая 50% мертвых мышей.

Низкая токсичность производной полимерносвязанного камптотецина А2 дает возможность применять повышенные дозы продукта и достигнуть эквивалентных или улучшенных результатов по сравнению с таковыми с камптотецином.

Полимерносвязанные камптотецины обладают противоопухолевой активностью. Они ингибируют топоизомеразу 1. Они пригодны для лечения лейкемии и в особенности опухолей толстой и прямой кишки.

Следовательно, можно лечить человека или животного способом, включающим введение им терапевтически эффективного количества полимерного конъюгата изобретения. Таким образом можно улучшить состояние человека или животного.

Диапазон принимаемой дозы зависит от способа применения лекарственного средства, от возраста, веса и состояния пациента, подвергнутого лечению. Полимерные конъюгаты обычно вводят парентеральным путем, например, внутримышечно, внутривенно или в виде шарика. Подходящий диапазон дозы составляет от 1 до 1000 мг камптотецина на 1 м² площади поверхности тела, например, от 10 до 50 мг/м².

Полимерные конъюгаты вместе с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем могут образовать лекарственные препараты. Обычно полимерные конъюгаты создают для парентерального введения, например, путем растворения в воде для инъекции или физиологического раствора.

Последующие примеры иллюстрируют изобретение без ограничения его. По всему описанию аминокислотные остатки показаны трехбуквенным кодом в соответствии с Eur. J. Biochem. 138. 9-37, 1984.

Устойчивость полимерных конъюгатов в мышиной плазме или плазме крови человека оценивали следующим образом: к 1 мл мышиной плазмы или плазмы крови человека добавили различные концентрации полимерного конъюгата изобретения А и в соответствующие периоды времени (24, 48, 72, 96 часов) собрали 100 мл пробы и хранили при -70^oC до дальнейшей обработки.

Каждую пробу экстрагировали путем добавления 100 мл 0,25 М фосфорной кислоты, 500 мл CH₃CN и 700 мл этилацетата и энергичного встряхивания в течение 20 минут при 4^oC. После этого пробу центрифугировали при 15000 х г в течение 10 минут и всплывшее наверх отделили. К остатку добавили 300 мл CH₃CN и 500 мл центрифугировали при 15000 х г в течение 10 минут. Всплывшее наверх отделили. Органические фазы объединили и выпарили, используя высоковакуумную центрифугу. Пробу извлекли путем добавления 500 мл MeOH/воды pH 2 (70/30 по объему) и инжектировали в аппаратуру для жидкостной хроматографии высокого давления для определения общего процентного содержания лекарства.

Система HPLC
Колонна - μ Boldapak C10 (Waters) 3,9х300 мм
Скорость протока 1,5 мл/мин
Детектор - спектрофотометрическая флюоресценция 650-40 (Perkin Elmer); эмиссия 434 нм (щель 5); возбуждение 370 нм (щель 5)
Инжекция 10 μл
Подвижная фаза 51,5% MeOH; 47,5% воды, 1% фосфорной кислоты.

Пример 1.

6-N-Тритилгексаноил-п-нитрофениловый эфир (8c) (C₆H₅)₃C-NH(CH₂)₅CO-OC₆H₄pNO₂.

6-Аминокапроновую кислоту (6,5 г, 50 миллимолей), суспендированную в смеси сухого хлороформа (75 мл) и сухого ацетонитрила (15 мл), добавили к триметилсилихлориду (6,3 мл, 50 миллимолей) и держали под флегмой в течение 2 часов при сильном перемешивании. После этого смесь охладили и добавили один за другим триэтиламин (13,7 мл, 100 миллимолей) и тритилхлорид (14 г, 50 миллимолей), растворенный в сухом хлороформе (100 мл). Смесь выдерживали при комнатной температуре всю ночь, затем добавили метанол (10 мл) и реакционную смесь концентрировали под пониженным давлением. Остаток промыли холодным 5% водным раствором лимонной кислоты (200 мл) и экстрагировали этилацетатом (200 мл).

Органическую фазу отделили и экстрагировали холодным 1 N водным раствором гидроксида натрия (200 мл). Водную фазу отделили, охладили льдом, уксусной кислотой довели pH до 5 и экстрагировали этилацетатом (2х100 мл). Органический растворитель удалили под пониженным давлением для получения 6-N-тритилкапроновой кислоты (16 г) после кристаллизации из этилацетата. Это вещество растворили в безводном тетрагидрофуране (150 мл) и обработали p-нитрофенолом (5,6 г, 400 миллимолей) и дициклогексилкарбодиимидом (8,4 г, 40 миллимолей) при 0^oC в течение 1 часа при перемешивании, затем всю ночь при 8^oC. После этого реакционную смесь отфильтровали, охладили при 0^oC в течение 2 часов и фильтровали опять. В конечном счете органический растворитель удалили под пониженным давлением и остаток кристаллизовали этиловым эфиром для получения названного соединения 8c (16,4 г). Осуществили TLC (тонкослойную хроматографию) на пластинах Kieselgel F₂₄₅(Merck) и элюировали систему этиловым эфиром/н-гексаном (1: 1 по объему) R_f = 0,6; FD-MS: m/Z/M+H/⁺ 495
H¹-ЯМР (90 Mhz, CDCl₃):
1,1-1,9 (m, 6H), 2-2,5 (m, 4H), 5,7-5,9 (m, 2H, NH-COOH), 7,2-7,7 (m, 15H).

Пример 2.

20-O-(6-аминогексаноил)камптотецин (7a).

Камптотецин (6a, R₁=H, 0,7 г, 2 миллимоля) растворили в сухом диметилсульфоксиде (100 мл) и добавили к 6-N-тритилгенсаноил-п-нитрофениловому эфиру (8c, 2 г, 4 миллимоля), полученному, как описано в примере 1, и 4-диметиламинопиридину (0,24 г, 2 миллимоля). Реакционную смесь поддерживали при комнатной температуре в течение 48 часов, затем разбавили хлороформом (400 мл) и промыли водой (3х100 мл). Органическую фазу отделили, сушили над безводным сульфатом натрия и концентрировали до маленького объема под пониженным давлением.

Необработанный продукт подвергли мгновенной хроматографии на колонке с кремниевой кислотой при элюировании хлороформом до получения 20-O-(6-N-тритилгексаноил)камптотецина (0,6 г). Осуществили TLC (тонкослойную хроматографию) на пластинах Kieselgel F₂₄₅(Merck) при элюировании системы хлороформом/метанолом (95: 5 по объему) R_f = 0,4, N-защищенную производную обработали 95% трифторуксусной кислоты (10 мл) при комнатной температуре в течение 50 минут.

После удаления кислоты под пониженным давлением названное соединение 7c собрали этиловым эфиром. Выход составили 0,4 г. Осуществили тонкослойную хроматографию на пластинах Kieselgel F₂₄₅(Merck) при элюировании системы метиленхлоридом/метанолом/уксусной кислотой/водой (80:20:7:3).

R_f = 0,6 FD-MS: m/z /M+H/⁺ 462.

Пример 3.

20-O-(L-фенилаланил-L-лейцилглицил)камптотецин (7b).

N-тритил-L-фенилаланил-L-лейцилглицил-п-нитрофениловый эфир (8a, 1,4 г, 2 миллимоля), полученный, как было ранее описано в заявке Великобритании N 9309663.4, камптотецин (6a, R₁=H, 0,35 г, 1 миллимоль) и 4-диметиламинопиридин (0,12 г, 1 миллимоль) растворили сухим диметилсульфоксидом (50 мл) и перемешали при комнатной температуре в течение 20 часов. После этого реакционную смесь разбавили хлороформом (400 мл) и промыли водой (3х100 мл). Органическую фазу отделили, сушили над безводным сульфатом натрия и концентрировали до маленького объема под пониженным давлением. Необработанный продукт подвергли мгновенной хроматографии на колонке с кремниевой кислотой при элюировании смесью хлороформа и метанола (99,5/0,5 по объему). Собрали фракции, содержащие N-защищенную производную названного соединения, концентрировали до остаточного влагосодержания, растворили в 75% водном растворе уксусной кислоты (30 мл) и поддерживали при комнатной температуре в течение 1 часа. Реакционную смесь обработали твердым кислым углекислым натрием до pH 7 и экстрагировали хлороформом (400 мл). После удаления органического растворителя названное соединение 7b выкристаллизовали из этилового эфира. Выход составил 0,16 г. Осуществили тонкослойную хроматографию на пластинах Kieselgel F₂₄₅(Merck) при элюировании системы хлороформом/метанолом (9:1 по объему) R_f = 0,35
FD-MS: m/z /M+H/⁺ 667
¹Н-ЯМР (400 MHz, CDCl₃) δ:
0,81 (g, J=6,5 Hz, 3H, δ-Leu), 0,82 (g, J=6,6 Hz, 3H, δ′-Leu), 0,98 (т, J=7,6 Hz, 3H, CH₃-CH₂), 1,25 (м, 1H, β-Leu), 1,39 (м, 1H,-Leu), 1,56 (м, 1H, β′-Leu), 1,98 (gg, J=6,4 Hz, J=13,5 Hz, 1H, β-Phe), 2,1-2,4 (м, 2H, CH₂CH₃), 2,48 (g, J=7,0 Hz, 1H, NH-Phe), 2,77 (gg, J=4,7 Hz, J=13,5 Hz, 1H, β′-Phe), 3,41 (м, 1H, α-Phe), 4,0-4,3 (м, 3H, α-Gly + α′-Gly + α-Leu), 5,20 - 5,27 (gg, J=19,9 Hz, 2H, 5-CH₂), 5,41-5,68 (gg, J=17,3 Hz, 2H, 17-CH₂), 6,35 (т, J= 5,3 Hz, 1H, NH-Gly), 6,76 (g, J=7,6 Hz, 1H, NH-Leu), 6,8-7,3 (м, 21H, 4x(C₆H₅)+14-H).

Пример 4.

9-Амино-20-O-(L-фенилаланил-L-лейцилглицил)камптотецин (7c).

N-Тритил-L-фенилаланил-L-лейцилглицин-п-нитрофениловый эфир (8a, 1,14 г, 2 миллимоля), 9-аминокампотецин (6b, R=NH₂, 0,363 г, 1 миллимоль), 4-диметиламинопиридин (0,12 г, 1 миллимоль) провзаимодействовали в сухом диметилсульфоксиде (20 мл) при комнатной температуре, как описано в примере 3, до получения названного соединения 7c (0,31 г). Осуществили тонкослойную хроматографию на пластинах Kieselgel F₂₄₅(Merck), систему элюировали хлороформом/метанолом (9:1 по объему) R_f = 0,2
FD-MS: m/z /M+H/⁺ 682, ¹H-ЯМР (400 MHz, CDCl₃) δ:
0,82 (g, J=6,5 Hz, 6H, δ-Leu + δ′-Leu), 1,00 (т, J=7,6 Hz, 3H, CH₂CH₃), 1,25 (м, 1H, β-Leu), 1,41 (м, 1H,-Leu), 1,59 (м, 1H, β-Leu), 1,99 (gg, J=6,2 Hz, J= 13,5 Hz, 1H, β=Phe), 2,1-2,4 (м, 2H, CH₂CH₃), 2,47 (g, J=6,5 Hz, 1H, Nh-Phe), 2,79 (gg, J= 4,7 Hz, J=13,5 Hz, 1H, β-Phe), 3,43 (м, 1H, α-Phe), 4,04 - 4,3 (м, 5H, 9-NH₂+ α-Leu + α′-Gly + α′-Gly), 5,04 -5,15 (gg, J=19,9 Hz, 2H, CH₂), 5,39 - 5,66 (gg, J=17,0 Hz, 2H, 17-CH₂), 6,44 (т, J=5,3 Hz, 1H, NH-Gly), 6,81 (g, J=7,7 H, 1H, Nh-Leu), 6,85 (м, 3H, 10-H ), 7,04 - 7,4 (м, 19H, 3x(C₆H₅) +14-H), 7,51 (м, 1H, 11-H).

Пример 5.

Сополимер N-(2-гидроксипропил)метакриламида, 20-O/N-метакрилоилглицил-(6-аминогексаноил/камптотецина и N-(2-гидроксипропил)метакрилоилглицинамида.

(Al: x=96, y=3, z=1)

Сополимер N-(2-гидроксипропил)метакриламида и N-метакрилоилглицин-п-нитрофенилового эфира (0,15 г), полученного, как описано в Makromol. Chem., 178, 2159 (1977), и содержащего 2,7•10³ эквивалентов п-нитрофенилового эфира, провзаимодействовал с 20-O-(6-аминогексаноил)камптотецином (7c, 18 мг), полученным, как описано в примере 2, в сухом диметилсульфоксиде (1 мл) при комнатной температуре в течение 18 часов, затем с 1-амино-2-пропанолом (2 мл) в течение 1 часа при комнатной температуре. После этого реакционную смесь обработали ацетоном (70 мл). Осадок собрали, опять растворили в безводном этаноле (5 мл) и повторно осадили ацетоном (50 мл) до получения названного конъюгата А1 (0,14 г), содержащего 5% (вес/вес) камптотецина. После инкубации плазмы конъюгат А1 выделил через 120 часов 10% камптотецина.

Пример 6.

Сополимер N-(2-гидроксипропил)метакриламида, 20-O-/N-метакрилоилглицил-L-фенилаланил-L-лейцилглицил/камптотецина и N-(2-гидроксипропил)метакрилоилглицинамида.

(A2: x=96, y=2,2, z=1,8)

Сополимер N-(2-гидроксипропил)метилакриламида и N-метакрилоилглицин-п-нитрофенилового эфира (0,15 г, содержащий 2,7•10³ эквивалентов п-нитрофенилового эфира) и 20-O-(глицил-L-лейцил-L-фенилаланил)камптотецин (7b, 20 мг), полученный, как описано в примере 3, провзаимодействовали в сухом диметилсульфоксиде (1 мл), затем с 1-амино-2-пропанолом, как описано в примере 6, до получения названного конъюгата А2 (0,14 г), содержащего 4,8% вес. камптотецина. После инкубации плазмы конъюгат А2 через 60 часов выделил 100% камптотецина.

Пример 7.

Сополимер N-(2-гидроксипропил)метакриламида, 9-амино-20-O-/N-метакрилоилглицил-L-фенилаланил-L-лейцилглицил/камптотецина и N-(2-гидроксипропил)метакрилоилглицинамида.

(A3: x=96, y=3, z=1)

Названный конъюгат получили путем взаимодействия сополимера N-(2-гидроксипропил)метакриламида и N-метакрилоилглицин-п-нитрофенилового эфира (0,15 г, содержащий 2,7•10³ эквивалентов п-нитрофенилового эфира) и 9-амино-20-O-(глицил-L-лейцил-L-фенилаланил)камптотецина (7c, 20 мг, полученного, как описано в примере 4, в сухом диметилсульфоксиде (1 мл), затем с 1-амино-2-пропанолом, как описано в примере 5.

Выход продукта, содержащего 6,3% вес/вес 9-аминокамптотецина, составил 0,14 г. После инкубации плазмы конъюгат А3 через 50 часов выделил 100% камптотецина.

Пример 8. Композиция.

Композиции на основе полимерного конъюгата, содержащего камптотецин, готовили с помощью следующей нижеописываемой процедуры.

Соответствующие соотношения компонентов, используемые в композиции, были такими, как указано ниже (количества приведены в расчете на флакон):
A2 - 1000 мг (эквивалентно приблизительно 50 мг камптотецина)
Лактоза - 500 мг
Полисорбат 80 - 10 мг
Вода для инъекций (W.F.I.) - До 20,0 мл
Лактозу, полисорбат 80 и A2 последовательно растворяли при перемешивании в W. F.I., деаэрировали, барботируя азот (около 80% от конечного требуемого объема воды). Полученный раствор затем доводили до конечного объема оставшимся количеством W.F.I.

Затем раствор фильтровали в стерильных условиях через 0,22 μм микропористую мембрану. Дозы раствора объемом по 20 мл были стерильно разлиты в стерильные флаконы типа 1 из бесцветного стекла емкостью 50-57 мл.

Растворы во флаконах замораживали при температуре -40 - -45^oC в течение 4-5 часов.

Затем проводили лиофилизацию, сушку продукта на конечной стадии при ~ 40^oC в течение 5-6 часов.

Флаконы закрывали и запаивали, а высушенные замораживанием осадки восстанавливали свой состав при введении стерильной воды или раствора хлорида натрия.

Аналогично готовят идентичные композиции на основе содержащих камптотецин полимерных конъюгатов A1 и A3.

Описывается полимерный конъюгат камптотецина, состоящий в основном из (i) от 60 до 99 мол.% N-(2-гидроксипропил)метакрилоиламидных звеньев, представленных формулой 1

(ii) от 1 до 40 мол.% 20-О-(N-метакрилоилглициламиноацил)-камптотециновых звеньев, представленных формулой 2

в которой SРA является пространственной группой, имеющей соответствующие концевые амино- и карбонильные группы, которые разделены, по крайней мере, тремя атомами, и О-СРТ представляет остаток камптотецина, при этом С-20-гидроксигруппа камптотецина связана с концевой карбонильной группой пространственной группы (А); (iii) от 0 до 10 мол.% N-метакрилоилглицина или N-(2- гидроксипропил)метакрилоилглицинамидных звеньев, представленных формулой 3

в которой Z представляет гидрокси или остаток формулы -NH-CH₂-СН(ОН)-СН₃. Технический результат - получение водорастворимого полимерносвязанного камптотецина, обладающего противоопухолевой активностью. 2 с. и 5 з.п.ф-лы, 3 табл.

1. Полимерный конъюгат камптотецина, который является растворимым и обладает противоопухолевой активностью, отличающийся тем, что состоит в основном из: (i) 60 - 99 мол.% N-(2-гидроксипропил)метакрилоиламидных звеньев, представленных формулой 1

(ii) 1 - 40 мол.% 20-О-(N-метакрилоилглициламиноацил)камптотециновых звеньев, представленных формулой 2

в которой группа [SPA] является пространственной группой, имеющей соответствующие концевые амино- и карбонильные группы, которые разделены, по крайней мере, тремя атомами;
O-CPT представляет собой остаток камптотецина формулы 6

в которой R представляет собой водород или NH₂ в положении 9 молекулы камптотецина, при этом C-20-гидроксигруппа камптотецина связана с концевой карбонильной группой пространственной группы [SPA];
* отмечена связь C-20-гидроксильной группы камптотецина с концевой карбонильной группой пространственной группы [SPA],
(iii) 0 - 10 мол.% N-метакрилоилглицина или N-(2-гидроксипропил)метакрилоилглицинамидных звеньев, представленных формулой 3

в которой Z представляет собой гидрокси или остаток формулы -NH-CH₂-CH(OH)-CH₃. 2. Конъюгат по п.1, отличающийся тем, что пространственную группу [SPA] выбирают из: Ala-Gly, Phe-Gly, Phe-Phe, Leu-Gly, Val-Ala, Phe-Ala, Leu-Phe, Leu-Ala, Phe-Leu-Gly, Phe-Phe-Leu, Leu-Leu-Gly, Phe-Tyr-Ala, Phe-Gly-Phe, Phe-Phe-Gly и Phe-Leu-Gly-Phe. 3. Конъюгат по п.1, отличающийся тем, что пространственная группа [SPA] представляет собой группу формулы -HN-Y-CO-, в которой Y является C₃ - C₆ линейной или разветвленной алкильной группой или Ala-Gly-NH-Y-CO-, Phe-Gly-NH-Y-CO, Phe-Phe-NH-Y-CO-, Leu-Gly-NH-Y-CO-, Val-Ala-NH-Y-CO, Phe-Ala-NH-Y-CO-, Leu-Phe-NH-Y-CO, Leu-Ala-NH-Y-CO-, Phe-Leu-Gly-NH-Y-CO, Phe-Phe-Leu-NH-Y-CO-, Leu-Leu-Gly-NH-Y-CO, Phe-Tyr-Ala-NH-Y-CO, Phe-Gly-Phe-NH-Y-CO-, Phe-Phe-Gly-NH-Y-CO или Phe-Leu-Gly-Phe-NH-Y-CO-, в которой Y имеет те же значения, которые указаны выше. 4. Конъюгат по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что O-CPT представляет собой камптотециновый остаток формулы 6

в которой R представляет собой водород или NH₂ в положении 9 молекулы камптотецина;
* отмечена связь C-20-гидроксильной группы камптотецина с концевой карбонильной группой пространственной группы [SPA]. 5. Конъюгат по одному любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что в нем присутствует 1 - 10 мол.% звеньев формулы 2. 6. Конъюгат по одному из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что содержание камптотецина составляет 1 - 10% (вес/вес). 7. Фармацевтическая композиция, обладающая противоопухолевой активностью, содержащая активный ингредиент и фармацевтический приемлемый разбавитель или носитель, отличающаяся тем, что в качестве активного ингредиента содержит эффективное количество полимерного конъюгата камптотецина по любому из пп.1 - 6.