ПОЛИМЕРНЫЙ КОНЪЮГАТ, СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ Российский патент 1999 года по МПК C07K5/107 C07D305/14 A61K31/33 A61K47/30 

Изобретение направлено на связанный с полимером паклитаксель и связанные с полимером производные паклитакселя, обладающие противоопухолевой активностью, на способ их получения и на содержащие их фармацевтические препараты.

Паклитаксель (в некоторых публикациях называемый также таксолом) принадлежит к таксановому семейству дитерпенов, и был выделен с последующей характеристикой из экстракта коры Taxus brevifolia L. Известны также и аналоги паклитакселя, полученные на основе 10-дезацетибаккатина III, экстрагированного из игл Taxus baccata L. (см. Wain и др., IACS, 93, 2325 (1971); Lovelle и др. , Proc. Am. Assoc. Cancer. Res., 31 (1990)). Эти соединения, как показано, обладают ярко выраженной противоопухолевой активностью, но в то же время плохо растворимы в воде, и их введение инъектированием или внутривенным вливанием при использовании в качестве носителя кремофора EL (фирменное название) сопровождается некоторыми токсичными побочными эффектами.

Настоящим изобретением дается полимерный конъюгант формулы I состоящий по существу из:
90 - 99,9% мол. звеньев формулы

0,1 - 5% мол. звеньев формулы:

в которой один из R₁ R₂ представляет собой остаток сополимера формулы

а другой представляет атом водорода;
0-9,9% мол. звеньев формулы:

где R представляет фенил или трет-бутоксигруппу, R₃ представляет водород или ацетил, A и A₁, которые могут быть одинаковыми или различными, представляют простую химическую связь, аминокислотный остаток или пептидный спейсер, выбранный из β-Ala, Gly, Phe-Gly, Phe-Phe, Leu-Gly, Val-Ala, Phe-Ala, Leu-Phe, Leu-Ala, Phe-Leu-Gly, Phe-Phe-Leu, Leu-Leu-Gly, Phe-Tyr-Ala, Phe-Gly-Phe, Phe-Leu-Gly-Phe, Gly-Phe-Leu-Gly-Phe, Gly-β-Ala, Phe-Gly-β-Ala, Phe-Phe-β-Ala, Leu-Gly-β-Ala, Val-Ala-β-Ala, Phe-Ala-β-Ala, Leu-Phe-β-Ala, Leu-Gly-β-Ala, Phe-Leu-Gly-β-Ala, Phe-Phe-Leu-β-Ala, Leu-Leu-Gly-β-Ala, Phe-Tyr-Ala-β-Ala, Phe-Gly-Phe-β-Ala, Phe-Phe-Gly-β-Ala, Phe-Leu-Gly-Phe-β-Ala или Gly-Phe-Leu-Gly-Phe-β-Ala.

Если более конкретно, то настоящим изобретением даются полимерные конъюгаты паклитакселя и производных паклитакселя с улучшенной растворимостью в воде и пониженной токсичностью.

Рекомендуется, чтобы мол. % звеньев, содержащих паклитаксель и производные паклитакселя, составлял 0,5-2, более предпочтительно, если содержание пактилакселя в полимере составляет 2-10% (мас./мас.), и к наиболее предпочтительным относятся те соединения, в которых содержание паклитакселя составляет 4-7% (мас. /мас.). Волнистая линия в формуле означает, что кислород, присоединенный в 7-положении формулы паклитакселя, может находиться в обоих конфигурациях, т.е. иметь β-(природный) или α-конфигурацию.

Рекомендуется, чтобы R представлял фенил, R₃-ацетил, и A остаток Phe-Leu-Gly или Phe-Leu-Gly-β-Ala. Все аминокислотные остатки характеризуются природной 1-конфигурацией. Согласно рекомендуемому воплощению изобретения полимерный конъюгант является сополимером 1-метакрил-иламино-2-гидроксипропана, (метакрилоилглицил-фенилаланил-лейцилглицил)-3-амино-2-гидроксипропана и 2-(метакрилоил)-глицилфенилаланил-лейцилглицил-β-аланил)паклитакселя.

Содержание в % мас./мас. определяют после ферментативного гидролиза с помощью ВЭЖХ по методике, аналогичной методике, приведенной в работе Cancer Treatment Rep. 71, 53-59 (1987).

Ферментативный анализ.

К 1 мл мышиной или человеческой плазмы добавляют в различных концентрациях связанный с полимером паклитаксель и в определенное время (24, 48, 72, 96 ч) отбирают по 100 мкл и хранят при -70^oC до дополнительной обработки.

Методика экстрагирования.

Образцы экстрагируют добавлением 75 мкл 0,5 М тетрабутиламмойфосфата (ТБАФ), 1250 мкл CH₃CN и 150 мкл 5 М NaCl и интенсивным встряхиванием 20' при 4^oC.

По окончании указанного периода образцы центрифугируют 10' при 15000•g, надосадочную жидкость собирают и испаряют в высоковакуумной центрифуге. Образцы восстанавливают добавлением 500 мкл смеси MeOH-вода (75:25 об./об.) и инъектируют в ВЭЖХ колонку для определения полного содержания паклитакселя (в %).

ВЭЖХ система.

Колонка - Нова-Пак C₁₈ (Уотерс) 3,9 • 300 мм.

Скорость потока - 1,5 мл/мин.

Детектор - УФ, 231 нм.

Инъектирование - 20 мкл.

Подвижная фаза - 57,5% H₂O с pH 2+42,5% CH₃CN.

Настоящим изобретением, кроме того, дается способ получения полимерного конъюгата, состоящий в реакции соединения формулы II

в которой один из A₂ и A₃ представляет химическую связь, а другой представляет A, где A, R и R₃ принимают вышеуказанные значения, с активированным полимером, состоящим на 90-99,9 мол.% из звеньев формулы

и на 10-0,1 мол.% из звеньев формулы

где A₁ принимает вышеуказанные значения,
с последующей обработкой полученного полимерного конъюгата 2-гидроксипропиламином.

Реакцию соединений формулы II с активированным полимером рекомендуется проводить в безводном полярном органическом растворителе, таком как диметилсульфоксид или диметилформамид, возможно в присутствии органического или неорганического основания, такого как щелочной карбонат, диметиламинопиридин или триэтиламин. Реакция обычно продолжается 1-24 часа.

Реакцию обычно проводят при температуре 15-40^oC, предпочтительно при комнатной температуре. Примеры щелочного карбоната включают карбонаты щелочных металлов и карбонаты щелочноземельных металлов.

Некоторые из исходных соединений формулы II являются известными соединениями, например: паклитаксель или аналоги паклитакселя, или же могут быть получены на основе известных соединений.

К примеру, 7-эпи-производные могут быть получены кипячением в толуоле паклитакселя или его аналогов в присутствии основания (Na₂CO₃ или диазабициклоундецен).

Другие соединения формулы II являются новыми соединениями, в частности, те соединения, в которых A₃ представляет остаток β- Ala, и те соединения, в которых либо A₂, либо A₃ представляет ди-, три-, или тетрапептидный спейсер согласно вышеприведенному определению A, и такие соединения охватываются объемом изобретения.

Соединения формулы II, в которых A₂ отличен от простой химической связи, могут быть получены реакцией паклитакселя или аналога паклитакселя с защищенной аминокислотой или пептидом в присутствии конденсирующего средства, а также в присутствии или отсутствии катализатора, предпочтительно при комнатной температуре с последующим удалением по известным методикам защитной группы.

Конденсация может быть также осуществлена использованием активных эфиров, например, п-нитрофенилового эфира пептида или аминокислоты. Приемлемые конденсирующие средства включают карбодиимиды, например, дициклогексил-карбодиимид (ДЦК).

Приемлемые катализаторы включают: 4-диметиломинопиридин, (ДМАП), пиридин или триэтиламин.

Для защиты аминогруппы могут быть применены различные известные защитные группы, и в качестве исходных соединений могут быть использованы продажные защищенные пептиды или аминокислоты. Могут быть использованы аминокислоты или пептиды, защищенные трет-ВОС, тритилом, ФМОК или карбобензилоксигруппой (CBZ). Рекомендуются аминокислоты или пептиды, защищенные трет-ВОС, тритилом и ФМОК.

Соединения формулы II, в которых A₃ отличен от простой химической связи, могут быть получены защитой или блокированием 2-гидроксигруппы, затем этерифицированием гидроксила в 7-положении с последующим удалением защитной или блокирующей группы 2-положении.

Соединения формулы II, в которых A₃ представляет остаток Gly или β-Ala, более предпочтительно получать реакцией паклитакселя с 2-3 эквивалентами N-защищенной аминокислоты с образованием 2,7-дизамещенного паклитакселя, отщеплением аминокислоты в 2-положении и затем деблокированием аминокислоты в 7-положении.

Реакцию паклитакселя с защищенной аминокислотой проводят в присутствии конденсирующего средства и катализатора, аналогичных вышеуказанным.

Отщепление 2-аминокислоты осуществляют установлением pH 7-7,4 в растворе 2,7-ди(минокислоты)паклитакселя, например, смешиванием 2,7-ди(минокислоты)паклитакселя с фосфатным буфером (pH 7-7.4) или небольшим избытком NaHCO₃.

Деблокирование аминокислоты проводят по известным методикам деблокирования аминокислот, например, обработкой слабой кислотой, такой как уксусная кислота или восстановлением.

Так, например, паклитаксель оставляет реагировать с 2-3 мол. эквивалентами N-защищенной аминокислотой (трет-ВОС, СВ или ФМОК защищенной) в хлористом метилене в присутствии ДЦК и каталитического количества 4-диметиламинопиридина. Таким путем в 2 и 7-положения вводят защищенную аминокислоту. 2,7-Бисаминокислотное производное паклитакселя оставляет на 2-5 часов в присутствии NaHCO₃ в смеси H₂O-MEOH, в результате чего происходит селективное деблокирование 2-положения с образованием 7-замещенного производного паклитакселя. Защитные группы удаляют с помощью приемлемых деблокирующих агентов (например: кислоты, мягкого основания или гидрогенолизом).

Активированный полимер представляет собой синтетический водорастворимый полимер, полученный монополимеризацией N'(2-гидроксипропил)метакриламида с п-нитрофениловыми эфирами N-метакрилоилолигопептидов согласно патентам США 4062831 и 4097470.

Полимерные конъюгаты формулы I и новые производные паклитакселя формулы II отличаются хорошей растворимостью в воде, биосовместимостью и выделяют паклитаксель или производное паклитакселя в плазму или после попадания вовнутрь в клетки путем отщепления олигопептидных спейсеров.

Биологическая активность.

Анализ на соединение и разъединение микротрубочек.

Тубулин мозга теленка получают в двух циклах соединения-разъединения (Ihelanski M. L. , Caskin F., Cantor C.R., RrOC. hatl. Acad. S ci. США 70, 7665-768, 1973) и хранят в жидком азоте в МАВ (0,1 M MES, 2,5 мМ EGTA, 0,5 мМ MgSO₄, 0,1 мМ EDTA, 0,1 мМ DTT, pH 6,4).

Все опыты проводят на белке, хранившимся менее 4 недель.

Перед каждым опытом тубулин выдерживают 30 мин при 4^oC.

Ансамбли регистрируют по методике Caskin и др. (Caskin F., Cantor C.R., Ihelanski M. L.Y. Molec. Biol. 89, 737-758, 1874). Кювету (толщиной 1 см) с тубулином (1 мг/мл) и 1 мМ ГТФ нагревают до 37^oC и при 340 на двухволновом двухлучевом спектрофотометре Перкин-Эльмер 557, снабженным самописцем и термостатически регулируемой камерой для образца, непрерывно проводят определение мутности.

Через 30 мин добавляют 4 мМ CaCl₂ и в течение 10 мин по уменьшении мутности определяют деполимеризацию. Через регулярные промежутки времени в 15 мин добавляют определенные дозы испытуемых соединений и регистрируют изменение мутности. Данные выражают в виде процента повторной полимеризации, вызываемой испытуемым соединением. Получение результаты приведены в таблице 1.

In vitro анализ чувствительности и лекарственному средству
Экспоненциально растущими клетками мышиной мелономы B16-F10 засевают (2•10⁴ клеток/мл) в RPM1 среде с добавкой 10% дезактивированной нагреванием околоплодной телячьей сыворотки и 2 мМ глютамина в планшеты с 24 ячейками (Костар). Сразу же после высева добавляют в определенных концентрациях испытуемое соединение. Ингибирование роста клеток определяют подсчетом числа клеток с помощью разделяющего счетчика после инкубирования в течение 72 часов. Для каждого испытуемого соединения используют культуры с тремя концентрациями соединения. Антипролиферирующую активность испытуемых соединений подсчитывают по кривым зависимости реакции от дозы и выражают как ИК₅₀ (доза, вызывающая 50%-ное ингибирование роста клеток в обработанных культурах в сравнении с необработанными контрольными культурами). Полученные результаты приведены в табл. 1 (см. в конце описания).

Испытание сополимер-паклитакселя, полученного в примере 6 in vivo против B16-P10 мышиной мелономы в сравнении с паклитакселем.

Мыши.

Самки мышей линии С57В16 получены с фермы Чарльз Ривер, Италия.

В начале опытов возраст животных 8-10 недель.

Лекарственные средства.

Из-за ограниченной растворимости паклитакселя в воде его растворяют в носителе, состоящим из 50% полиоксиэтилированного касторового масла (кремофор EL) и 50% этанола, с последующим разбавлением 5%-тным раствором глюкозы до целевой концентрации. Раствор несколько мутноват и спустя небольшой промежуток времени наблюдается образование осадка.

Соединение примера 6 легко растворяется в 5%-ом растворе глюкозы, и полученный раствор остается прозрачным длительное время (более 2 часов). Конечные концентрации относятся к содержанию паклитакселя в соединении (в общей сложности 4%).

Опухоль.

Используют мышиную мелоному B16-P10. Суспензию 10⁵ клеток опухоли в 0,2 мл инъектируют подкожно в бок мыши.

Циркулем измеряют размер опухоли, массу опухоли подсчитывают по формуле

Введение лекарственного средства.

Паклитаксель вводят внутрибрюшинно, вследствие его плохой растворимости и токсичности носителя.

Соединение примера 6 вводят внутривенно. Оба соединения вводят на 1, 5 и 9 день после имплантации опухоли.

Приведенные в табл. 2 данные показывают большую активность соединения настоящего изобретения по сравнению с паклитакселем (см. в конце описания).

Доза полимерного конъюгата относится к содержанию паклитакселя.

Определение токс. (токс. - число мышей, погибших в начале отравления) проводят, если мышь погибает раньше контрольной или если наблюдаются заметные потери в массе тела и/или уменьшение размера селезенки и/или печени. Из приведенных данных видно, что полимерные конъюгаты настоящего изобретения обладают прекрасной противоопухолевой активностью. Таким образом, эти соединения являются полезными противоопухолевыми средствами вследствие их низкой токсичности и повышенной растворимости в воде по сравнению с паклитакселем и его аналогами. Примеры опухолей, подлежащих лечению, включают: саркомы, карциному, лимфомы, нейробластому, меланому, опухоль Вильса, лейкозы и аденкарционому.

Улучшенная растворимость и пониженная токсичность полимерных конъюгатов настоящего изобретения означает их пригодность для внутривенных инъекций или вливаний. Дозировка зависит от возраста, массы и состояния больного. Дозировки могут находится в интервале от 1 мг/кг массы тела до 1 г/кг массы тела, предпочтительно 4 - 800 мг/кг массы тела. Обычные составы содержат связанный с полимером паклитаксель/производное паклитакселя в количестве, эквивалентном 0,5; 1,5; 10; 20; 25 или 50 мг активного паклитакселя/производного паклитакселя.

Полимерные конъюгаты могут быть приготовлены в виде фармацевтических препаратов с фармацевтическими приемлемыми носителями или разбавителями. Может быть использован любой подходящий носитель или разбавитель. Растворы для внутривенных инъекций или вливаний могут содержать в качестве носителя или разбавителя, например, стерильную воду, или что предпочтительнее, они могут иметь вид стерильных водных или изотонических солевых растворов.

Нижеследующие примеры иллюстрируют настоящее изобретение.

Пример 1. Сополимер 1-метакрилоиламино-2-гидроксипропана, 1-(метакрилоил-глицил-фенилаланил-лейцил-глицил)амино-2-гидроксипропана и 2'-(метакрилоил-глицил-фенилаланил-лейцил-глицил)паклитакселя.

К раствору 1,4 г сополимера 1-метакрилоиламино-2-гидроксипропана и N-(метиленкарбонил-Phe-Leu-Gly-4-нитрофенокси) метакриламида, полученного по методике 1. Коресек и др. (Makzomol Chem. 177, 2833 (1976)), 15 мл безводного диметилформамида добавляют 100 мг паклитакселя и 15 мг диметиламинопиридина.

Желтый раствор перемешивают 8 часов в безводных условиях при комнатной температуре. Затем в реакционную колбу по каплям прибавляют 0,2 мл 2-гидроксипропиламин и содержимое колбы перемешивают 30 минут.

Реакционную смесь нейтрализуют 0,3 мл ледяной уксусной кислотой, концентрируют в вакууме до небольшого объема и затем переносят в 200 мл ацетона
После перемешивания 30 минут осадок отфильтровывают и промывают ацетоном с получением 1,25 г заглавного соединения.

Содержание паклитакселя составляет 4,5% (установлено ферментативным гидролизом и ВЭЖХ анализом).

Из раствора ацетона выделяют непрореагированный паклитаксель.

Пример 2. 2'-(N-Тритил-фенилаланил-лейцил-глицил)паклитаксель.

К раствору 170 мг паклитакселя в 16 мл ацетонитрила добавляют добавляют 24 мг диметиламинопиридина и 150 N-тритил-фенилаланил-лейцил-глицина-4-нитрофенилового эфира.

Желтый раствор перемешивают 20 часов при комнатной температуре, после чего испаряют досуха в вакууме. Остаток хромируют на силикагеле с применением в качестве элюента смеси этилацетат-гексан (35 : 25) и получением 380 мг заглавного соединения.

¹H-ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ : 0,82 (д, J = 6,4 Гц, 3H, δ - Leu), 0,85 (д, J = 6,7 Гц, 3H, δ - Leu), 1,15 (с, 3H, 16), 1,26 (с, 3H, 17), 1,2 - 1,6 (м, 3H, β+β+γ- Leu), 1,69 (с, 3H, 19), 1,85 (с, 1H, OH-1), 1,89 (м, 1H, 6 β ), 1,96 (д, J = 1,2 Гц, 3H, 18), 2,14 (дв. д, J = 5,9 Гц, J = 13,5 Гц, 1H, β - Phe), 2,24 (с, 3H, CH₃CO/10), 2,2 - 2,7 (м, 5H, CH₃-14 + OH-7 + 6α+β - Phe + NH-Phe), 2,47 (с, 3H, CH₃CO-4), 3,5 (м, 1H, α- Phe), 3,74 (дв. д, J = 4,7 Гц, J = 18,2 Гц, 1H, α- Gly), 3,8 (м, 1H, α- Leu), 3,83 (д, J = 7 Гц, 1H, 3), 4,17 (дв. д, J = 7 Гц, J = 18,2 Гц, 1H, α- Gly), 4,22, 4,33 (два д, J = 8,5 Гц, 2H, CH₂-20), 4,46 (м, 1H, 7), 4,97 (дв. д, J = 2,2 Гц, J = 9,9 Гц, 1H, 5), 5,44 (д, J = 2,3 Гц, 1H, 2'), 5,71 (д, J = 7 Гц, 1H, 2), 5,97 (дв. д, J = 4,7 Гц, J = 7 Гц, 1H, NH-Gly), 6,07 (дв. д, J = 2,3 Гц, J = 9,4 Гц, 1H, 3'), 6,2 - 6,3 (м, 2H, 13 + 10), 6,8 - 9,2 (м, 30H, 6-Ph), 6,95 (д, J = 6,7 Гц, 1H, NH-Leu), 8 (д, J = 9,4 Гц, 1H, NH-4').

Пример 3. 2'-(Фенилаланил-лейцил-глицил)паклитаксель.

В смеси ледяной уксусной кислоты (22 мл) и воды (6 мл) растворяют 2'-(N-Trit-Phe-Leu-Gly)паклитаксель (250 мг) и раствор перемешивают 1 час при комнатной температуре.

Растворитель испаряют досуха в вакууме, остаток перемешивают 30 минут в смеси диэтиловый эфир - гексан (1 : 1) и после фильтрования получают 160 мг заглавного соединения.

ББА-МС: m/z 1171/M + H/+, 1112 M-CH₃COOH + 2H, 1051, 1024, 911, 603, 596, 509.

¹H-ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ : 0,88 (д, J = 6,4 Гц, 3H, δ- Leu), 0,92 (д, J = 6,4 Гц, 3H, δ′- Leu), 1,13 (с, 3H, 16), 1,16 (с, 3H, 17), 1,4 - 2 (м, 4H, β+β+γ+ Leu + 6 β ), 1,69 (с, 3H, 19), 1,91 (д, J = 1,2 Гц, 3H, 18), 2,16 (дв. д, J = 6 Гц, J = 13,8 Гц, 1H, 14), 2,23 (с, 3H, COCH₃-10), 2,4 - 2,6 (м, 3H, 6 α + 14 β - Phe), 2,53 (с, 3H, COCH₃-4), 2,9 (дв. д, J = 4,1 Гц, J = 13,5 Гц, 1H, β′- Phe), 3,49 (дв. д, J = 4,1 Гц, J = 9,1 Гц, 1H, α- Phe), 3,82 (д, J = 7,3 Гц, 1H, 3), 3,9 - 4,1 (м, 2H, α+α′- Gly), 4,22, 4,33 (два д, J = 8,7 Гц, 2H, CH₂-20), 4,27 (м, 1H, α- Leu), 4,44 (дв. д, J = 6,4 Гц, J = 10,8 Гц, 7), 4,98 (дв. д, J = 2,4 Гц, J = 9,7 Гц, 5), 5,61 (д, J = 3,2 Гц, 1H, 2'), 5,7 (д, J = 7,3 Гц, 1H, 2), 6,12 (дв.д, J = 3,2 Гц, J = 9,4 Гц, 1H, 3'), 6,21 (м, 2H, 13), 6,28 (c, 1H, 10), 6,8 - 8,2 (м, 21H, 4-Ph + NH Leu), 7,87 (д, J = 9,4 Гц, 1H, NH-4').

Пример 4.

Сополимер 1-метакрилоиламино-2-гидроксипропана, 1-(метакрилоил-глицил)амино-2-гидроксипропана и 2'-(метакрилоил-глицил-фенилаланил-лейцил-глицил)паклитакселя.

К раствору 1 г сополимера 1-метакрилоиламино-2- гидроксипропана и N-(метиленкарбони-4-нитрофенокси)метакриламида, полученного по методике P. Rejmanova и др. (Makromol. Chem. 178, 2159 - 2168), в 10 мл безводного диметилформамида добавляют 100 мг 2'-Phe-Leu-Gly-паклитакселя и 10 мг диметиламинопиридина.

Желтый раствор перемешивают 2 часа в безводных условиях при комнатной температуре. Затем к реакционной смеси добавляют 2-гидроксипропиламин (0,15 мл) и все перемешивают 30 минут. Реакционную смесь нейтрализуют 0,2 мл ледяной уксусной кислоты, концентрируют в вакууме до небольшого объема и переносят в 200 мл ацетона.

Смесь перемешивают 1 час, осадок отфильтровывают и после промывки ацетоном получают 960 мг заглавного соединения.

Содержание паклитакселя составляет 6% (определено ферментативным гидролизом и ВЭЖЗ анализом).

Пример 5.

Сополимер 1-метакрилоиламино-2-гидроксипропана, 1-(метилакрилоилглицил)амино-2-гидроксипропана и 2'-(метакрилоил-глицил)паклитакселя.

К раствору 1,6 г сополимера 1-метакрилоиламино-2-гидроксипропана и N-(метиленкарбонил-4-нитрофенокси)метакриламида в 16 мл безводного диметилформамида добавляют 100 мг паклитакселя и 20 мг диметиламинопиридина. Желтый раствор перемешивают 20 часов при комнатной температуре, затем добавляют 2-гидроксипропиламин (0,2 мл) и смесь перемешивают 30 минут. Реакционную смесь нейтрализуют 0,3 мл ледяной уксусной кислоты, концентрируют в вакууме до небольшого объема и затем переносят в 200 мл ацетона. Смесь перемешивают 1 час, осадок отфильтровывают и после промывки ацетоном получают 1440 мг заглавного соединения.

Содержание паклитакселя составляет 2.65 мас.%.

Пример 6.

Сополимер 1-метакрилоиламино-2-гидроксипропана, 1-(метакрилоилглицил-фенилаланил-лейцил-глицил)амино-2-гидроксипропана и 2'-(метакрилоил-глицил-фенилаланил-лейцил-глицил-β-аланил)паклитакселя.

К раствору 620 мг сополимера 1-метакрилоиламино-2-гидроксипропана и N-(метиленкарбонил-Phe-Leu-Gly-4- нитрофенокси)метакриламида в 6 мл безводного диметилформамида добавляют 62 мг 2'-(β-аланил)паклитакселя, приготовленного по методике N.F. Magr. и др., (J. Nat. Products 51, 298 - 306, 1988), и 10 мл диметиламинопиридина.

Желтый раствор перемешивают 5 часов в безводных условиях при комнатной температуре.

Затем добавляют 2-гидроксипропиламин (0,1 мл) и смесь перемешивают 30 минут.

Реакционную смесь нейтрализуют 0,15 мл ледяной уксусной кислоты, концентрируют в вакууме до небольшого объема и переносят в 150 мл ацетона. Смесь перемешивают 1 час, осадок отфильтровывают и после промывания ацетоном получают 5,85 г заглавного соединения.

Содержание паклитакселя составляет 4% мас./мас.

Пример 7.

2',7-Ди(карбобензилокси-β-аланил)паклитаксель.

К раствору 200 мг паклитакселя в 15 мл ацетонитрила добавляют 400 мг N, N'-дициклогексилкарбодиимида, 200 мг карбобензилокси-β-аланила и 60 мг диметиламинопиридина. Реакционную смесь перемешивают 20 часов, осадок отфильтровывают и растворитель испаряют досуха в вакууме.

Хроматографированием остатка на силикагеле с применением в качестве элюента смеси этилацетат - гексан (1 : 1), получают 300 мг заглавного соединения.

ББА-МС: m/z 1264/M + H/+, 1204, 1130, 1070.

Пример 8.

7-(карбобензилокси-β-аланил)паклитаксель.

К раствору 171 мг 2',7 -ди(карбобензилокси--β--аланил)паклитакселя в 60 мл метанола добавляют 30 мг бикарбоната натрия и 7 мл воды. Реакционную смесь перемешивают 3 часа при комнатной температуре.

Метанол испаряют и продукт экстрагируют этилацетатом.

Испарением растворителя досуха в вакууме получают 134 мг заглавного соединения.

Пример 9.

7-(β-аланил)паклитаксель
К раствору 135 мг 7-(карбобензилокси -β- аланил)паклитакселя в 20 мл метанола и 13 мл муравьиной кислоты добавляют 200 мг 5% Pd/C. Реакционную смесь перемешивают 6 часов при комнатной температуре. Катализатор отфильтровывают, промывают метанолом и растворитель испаряют досуха в вакууме. Остаток растворяют в 8 мл метанола и после осаждения 150 мл диэтилового эфира получают 85 мг заглавного соединения.

ББА-МС: m/z 925/M + H/+, 947/M + 11a/+.

¹H-ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ : 1,14 (с, 3H, CH₃-16), 1,2 (с, 3H, CH₃-17), 1,79 (с, 3H, CH₃-19), 1,85 (с, 3H, CH₃CO-10), 2,2 - 2,6 (м, 6H, CH₂-14 + CH₂-6 + OCOCH₂CH₂NH₂), 2,42 (с, 3H, CH₃CO-4), 3 - 3,2 (м, 2H, OCOCH₂CH₂NH₂), 3,9 (д, J = 6,8 Гц, 1H, 3), 4,18, 4,31 (два д, J = 8,2 Гц, 2H, CH₂-20), 4,8 (д, J = 8,5 Гц, 1H, 2'), 4,91 (д, J = 8,5 Гц, 1H, 5), 5,62 (дв. д, J = 10,2 Гц, J = 7 Гц, 1H, 7), 5,66 (д, J = 6,8 Гц, 1H, 2), 5,81 (дв. д, J = 2,9 Гц, J = 9,1 Гц, 1H, 3'), 6,17 (м, 1H, 13), 6,19 (с, 1H, 10), 7,3 - 8,2 (м, 16H, NH 4'+ 3-Ph).

Пример 10.

Сополимер 1-метакрилоиламино-2-гидроксипропана, 1-(метакрилоил-глицил-фенилаланил-лейцил-глицил)амино-2-гидроксипропана и 7-(метакрилоил-глицил-фенилаланил-лейцил-глицил--β-аланил)паклитакселя.

К раствору 1500 мг сополимера 1-метакрилоиламино-2- гидроксипропана и N-(метиленкарбонил-Phe-Leu-Gly-4- нитрофенокси)метакриламида в 13 мл безводного диметилформамида добавляют 135 мг 7-(β-аланил)паклитакселя и 20 мг диметиламинопирида. Желтый раствор перемешивают 5 часов в безводных условиях при комнатной температуре.

Затем добавляют 2-гидроксипропиламин (0,2 мл) и смесь перемешивают 30 минут.

Реакционную смесь нейтрализуют 0,3 мл ледяной уксусной кислоты, концентрируют в вакууме до небольшого объема и переносят в 250 мл ацетона. Смесь перемешивают 1 час, осадок отфильтровывают и после промывания ацетоном получают 1520 мг заглавного соединения.

Содержание паклитакселя составляет 7,8% мас./мас.

Использование: в медицине. Сущность изобретения: полимерный конъюгат , получаемый путем взаимодействия соединений формулы II

где один из А₂ и А₃ означает химическую связь и другой означает A, R означает фенил или t - бутоксигруппу , R₃ означает водород или ацетильную группу, А означает простую химическую связь, аминокислотный остаток или пептидный спейсер, выбранный из β-Ala, Gly, Phe-Gly, Phe-Phe, Leu-Gly, Val-Ala, Phe-Ala, Leu-Phe, Leu-Ala, Phe-Leu-Gly, Phe-Phe-Leu, Leu-Leu-Gly, Phe-Tyr-Ala, Phe-Gly-Phe, Phe-Phe-Gly, Phe-Leu-Gly-Phe, Gly-Phe-Leu-Gly, Phe, Gly-β-Ala, Phe-Gly-β-Ala, Phe-Phe-β-Ala, Leu-Gly-β-Ala, Val-Ala-β-Ala, Phe-Ala-β-Ala, Leu-Phe-β-Ala, Leu-Gly-β-Ala, Leu-Leu-Gly-β-Ala, Phe-Tyr-Ala-β-Ala, Phe-Gly-Phe-β-Ala, Phe-Phe-Gly-β-Ala, Phe-Leu-Gly-Phe-β-Ala или Gly-Phe-Leu-Gly-Phe-β-Ala, вводят во взаимодействие с активированным полимером, состоящим из 90-90,9 мол.% звеньев формулы

и N10-0,1 мол.% звеньев формулы

процесс ведут в безводном полярном растворителе при температуре от 15 до 40^oC в течение от 1 до 24 ч в присутствии органического или неорганического основания и затем обрабатывают конъюгат 2-гидроксипропиламином. Фармацевтическая композиция, обладающая противоопухолевой активностью, включает в качестве действующего средства полимерный конъюгат в эффективном количестве. Соединения характеризуются улучшенной растворимостью в воде и пониженной токсичностью по сравнению с паклитакселем. 4 с. и 3 з.п.ф-лы, 2 табл.

1. Полимерный конъюгат, состоящий по существу из 90 - 99,9% звеньев формулы

0,1 - 5 мол.% звеньев формулы

в которой один из R₁ и R₂ представляет остаток сополимера формулы

а другой - атом водорода,
не более 9,9 мол.% звеньев формулы

где R представляет фенил или трет-бутоксигруппу;
R₃ представляет водород или ацетил;
А и А₁, которые могут быть одинаковыми или различными, представляют простую химическую связь, аминокислотный остаток или пептидный спейсер, выбранный из: β- Ala, Gly, Phe-Gly, Phe-Phe, Leu-Gly, Val-Ala, Phe-Ala, Leu-Phe, Leu-Ala, Phe-Leu-Gly, Phe-Phe-Leu, Leu-Leu-Gly, Phe-Tyr-Ala, Phe-Gly-Phe, Phe-Phe-Gly, Phe-Leu-Gly-Phe, Gly-Phe-Leu-Gly-Phe, Gly-β-Ala, Phe-Gly-β-Ala, Phe-Phe-β-Ala, Leu-Gly-β-Ala, Val-Ala-β-Ala, Phe-Ala-β-Ala, Leu-Phe-β-Ala, Leu-Gly-β-Ala, Phe-Leu-Gly-β-Ala, Phe-Phe-Leu-β-Ala, Leu-Leu-Gly-β-Ala, Phe-Tyr-Ala-β-Ala, Phe-Gly-Phe-β-Ala, Phe-Phe-Gly-β-Ala, Phe-Leu-Gly-Phe-β-Ala, или Gly-Phe-Leu-Gly-Phe-β-Ala,
полученный путем взаимодействия соединения формулы II

где один из А₂ и А₃ означает химическую связь и другой означает А;
значения R, R₃ и А указаны выше,
с активированным полимером, состоящим по существу из 90 - 99,9 мол.% звеньев формулы

и 10 - 0,1 мол.% звеньев формулы

с последующей обработкой полученного конъюгата, который содержит от 2,65 до 7,8 мас. % звена, образованного из активного соединения формулы II, 2-гидроксипропиламином, причем процесс проводят в безводном полярном растворителе при температуре 15 - 40^oC в течение 1 - 24 ч в присутствии органического или неорганического основания. 2. Конъюгат по п.1, в котором R - фенил, R₃ - ацетил, А - Phe-Leu-Gly или Phe-Leu-Gly-β-Ala. 3. Конъюгат по п.1 или 2, являющийся сополимером 1-метакрилоиламино-2-гидроксипропана, (метакрилоилглицил-фенилаланил-лейцил-глицил)-3-амино-2-гидроксипропана и 2'-(метакрилоилглицил-фенилаланил-лейцил-глицил-β-аланил)паклитакселя. 4. Способ получения полимерного конъюгата по п.1, заключающийся в том, что соединения формулы II

где один из А₂ и А₃ представляет химическую связь, а другой представляет А, где А, R и R₃ принимают значения по п.1,
вводят во взаимодействие с активированным полимером как определено в п. 1, причем реакцию проводят в безводном полярном растворителе при температуре 15 - 40^oC в течение 1 - 24 ч в присутствии органического или неорганического основания и затем обрабатывают полученный конъюгат 2-гидроксипропиламином. 5. Соединение формулы II по п.1, в которых R - фенил, R₃ - ацетил, А₂ = Phe-Leu-Gly, Gly-Phe-Leu-Gly или Phe-Leu-Gly-β-Ala, А₂ - химическая связь. 6. Соединения формулы II по п.1, в которых R - фенил, R₃ - ацетил, А₂ - химическая связь, А₃-β-Ala или Phe-Leu-Gly-β-Ala. 7. Фармацевтическая композиция, обладающая противоопухолевой активностью, включающая действующее средство и разбавитель или носитель, отличающаяся тем, что в качестве действующего средства она содержит соединение по пп.1, 2 или 3 в эффективном количестве.