СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ПАРОВОЙ СТЕРИЛИЗАЦИИ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИМ МЕТОДОМ Российский патент 2000 года по МПК C12Q1/22 C12Q1/22 C12R1/07 

Изобретение относится к медицинской и ветеринарной микробиологии и касается способа контроля эффективности стерилизации изделий медицинского и ветеринарного назначения термическим методом, а именно стерилизации нагретым насыщенным водяным паром.

Наиболее устойчивыми к стерилизующим воздействиям теплом являются споры бактерий (Санитарные правила СП 1.2.011-94. 1.2. Эпидемиология. Госкомсанэпиднадзора РФ. М. , 1994, с. 74-77). Споры бактерий могут стать причиной тяжелых заболеваний. Из патогенных аэробных бактерий - Bacillus anthracis, из патогенных анаэробных бактерий - Clostridium tetani и группа возбудителей газовой гангрены (так называемые раневые инфекции) вызывают не только заболевания людей и животных, но и на долгие годы загрязняют окружающую среду. Из токсигенных сапрофитов к таким бактериям относится Clostridium botulinum, представляющий большую угрозу для пищевой промышленности из-за смертельного для человека ботулинического токсина.

Разработан способ контроля эффективности тепловой стерилизации водяным паром с использованием спор штамма Bacillus stearothermophilus ВКМ B-718 (Санитарные правила СП 1.2.011-94. Госкомсанэпиднадзора РФ. М., 1994, с. 138), обладающего высокой устойчивостью к указанному способу стерилизации.

Прорастание спор этого вида бактерий после стерилизации зависит от состава питательных сред и содержания в них некоторых веществ - герминантов, способствующих этому процессу. К ним относится DL-аланин. Известны импортные питательные среды - Soybean Casein Medium (Graham G.S. Biological Indicators for Hospital and Yndustrial Sterilization. In: Sterilization of Medical Products. V. 5, p. 56. Canada) - аналог, который применяется в ряде стран (Sterilization of Medical devices - Microbiological methods. - Part 2: Tests of steriliti performed in the validation of a sterilization process. Draft International Standard ISO/DIS 11737-2, 1995, p. 10). Гибель спор после теплового воздействия зависит также от вида их носителя - алюминиевая фольга, фильтровальная бумага, уголь активированный, силикагель, стекловолокно (Гутерман Р.Л. "Средства контроля термической стерилизации изделий медицинского назначения". Дисс. канд. мед. наук. М., 1993, с. 139-142) - аналогов, на которые наносят споры Bacillus stearothermophilus.

Наиболее близким по техническому решению и достигаемому положительному эффекту к предлагаемому способу контроля эффективности паровой стерилизации является инсулиновый флакон из нейтрального стекла в качестве носителя спор и жидкая полусинтетическая питательная среда с индикатором феноловым красным и 0,5%-ной глюкозы - прототипы. Пожелтение среды после стерилизации спор указывает на неблагоприятный результат (Методические указания по контролю работы паровых и воздушных стерилизаторов. Утверждены 28.02.91, N 15/6-5. М. , 1991, с. 17, 51).

Однако способ применения этого носителя спор и добавление питательного бульона в прототипе в объеме 1 мл не гарантирует максимального проявления терморезистентности спор и их прорастания после тепловой стерилизации водяным паром.

Целью изобретения является повышение надежности бактериологического контроля эффективности стерилизации паровым методом.

Поставленная цель достигается использованием в качестве носителя спор пробирок Эппендорфа объемом 1,0-2 мл, имеющих на себе плотно закрывающиеся крышки. На дно пробирки наносят 0,02 мл дистиллированной воды с нужным числом спор (от 5• 10⁵ до 5 • 10⁶). Высушивание производят при температуре 37^oC в течение 18-20 ч. После стерилизации в пробирку добавляют уменьшенный в 2 раза по сравнению с прототипом объем жидкой питательной среды (0,5 ± 0,05 мл), обогащенной DL-аланином до 0,1%-ной концентрации. Питательной основой жидкой среды является сухой питательный бульон Дагестанского НИИ питательных сред с добавлением глюкозы (до 0,5%) и индикатора бромкрезолового красного (0,00002%).

Пробирку плотно закрывают крышкой и помещают в термостат при (55±2)^oC. Результаты учитывают в течение 2 суток. Изменение цвета окраски среды от красного к желтому указывает на наличие жизнеспособных спор.

Способ исследован в сравнении со способом-прототипом и испытан при плановом бактериологическом контроле паровой стерилизации в Московском городском центре дезинфекции и лечебно-профилактических учреждениях.

Пример 1. Влияние объема питательной среды на рост спор Bacillus stearothermophilus ВКМ В-718 определили в специальном опыте. Для этого взяли сухой питательный бульон Дагестанского НИИ питательных сред, в который добавили 0,1% DL-аланина, приготовили жидкую питательную среду. В этой среде прорастали споры, засеянные в количестве 1, 10 и более клеток. В инсулиновые флаконы и пробирки Эппендорфа внесли по 0,02 мл дистиллированной воды со спорами Bacillus stearothermophilus в количестве 10±2. После высушивания спор при 37^oC в течение 18-20 ч в инсулиновые флаконы и пробирки Эппендорфа добавили разные объемы питательной среды (см. чертеж, где по оси ординат - число биотестов; закрашенная серым цветом часть столбиков - число биотестов, изменивших цвет питательной среды после культивирования в термостате). Посевы поместили при (55±2)^oC и наблюдали в течение 3 суток, регистрируя помутнение среды и изменение окраски от красной до желтой, что указывало на рост бактерий. Отчетливо видно, что оптимальным по числу проросших биотестов был объем среды, равный 0,5 мл.

Пример 2. Ростовые свойства питательного бульона Дагестанского института питательных сред проверили в сравнении с добавленной в него аминокислотой - DL-аланином в количестве 0,1% и в сравнении со средой-прототипом. В опыт были взяты биотесты - пробирки Эппендорфа с высушенными спорами в количестве (1±0,2) • 10⁵, (1±0,2) • 10⁶ и (1±0,2) • 10⁷ Bacillus stearothermophilus ВКМ В-718 серии 70 (1998 г.). После стерилизации в автоклаве марки ВК-75 при 120^oC в течение 15 мин в биотесты добавили по 0,5 мл жидких питательных сред (таблица). Число проросших тестов в питательном бульоне с аланином было достоверно больше, чем в той же среде без аминокислоты. Еще большими были различия по сравнению со средой-прототипом (полусинтетическая среда с индикатором феноловым красным).

Пример 3. Питательные среды подвергаются стерилизации паром в основном при двух режимах - (121±1)^oC в течение 45 мин и (132±1)^oC в течение 20 мин. Мы проверили влияние этой процедуры на ростовые качестве предлагаемой питательной среды. Для этого из сухого питательного бульона Дагестанского НИИ питательных сред приготовили по прописи жидкую среду, добавили в нее DL-аланин до 0,1%-ной концентрации, 0,5% глюкозы и 0,00002% индикатора бромкрезолового красного. Среду разлили по 100 мл в 2 флакона и стерилизовали один - при 121^oC в течение 45 мин, другой - при 132^oC 20 мин. После этого по 0,5 мл разлили в инсулиновые флаконы и пробирки Эппендорфа и внесли в них по 1, 10 и 100 спор в 0,05 мл дистиллированной воды. Посевы инкубировали при (55±2)^oC в течение 3 суток, регистрируя наличие роста по мутности и пожелтению среды. Питательная среда при обоих режимах стерилизации в пробирках Эппендорфа значительно лучше поддерживала рост единичных спор Bacillus stearothermophilus ВКМ В-718, чем та же питательная среда, помещенная после стерилизации в инсулиновые флаконы.

Изобретение относится к медицинской и ветеринарной микробиологии и касается способа контроля эффективности стерилизации изделий медицинского и ветеринарного назначения термическим методом, а именно стерилизации нагретым насыщенным водяным паром. Целью изобретения является повышение надежности бактериологического контроля эффективности стерилизации паровым методом. Поставленная цель достигается использованием в качестве носителей спор пробирок Эппендорфа, уменьшением объема вносимой питательной среды и изменением ее состава. 1 ил., 1 табл.

Способ определения эффективности паровой стерилизации биологическим методом для обнаружения жизнеспособных спор Bacillus stearothermophilus в биотестах, отличающийся тем, что для повышения надежности контроля в качестве носителей спор применяются пробирки Эппендорфа, в которые добавляют уменьшенный объем питательного бульона с 0,1% DL-аланина.