СПОСОБ ЭКСПРЕССНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИБИОТИКОВ БИОЛОГИЧЕСКИМ МЕТОДОМ Российский патент 2002 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицинской, ветеринарной и сельскохозяйственной микробиологии и касается способа определения концентрации антибиотиков в крови, раневом отделяемом, моче человека и животных, а также в продуктах питания (мясе, молоке и изготовленных из них продуктов).

Антибиотики получили широкое распространение и применяются для лечения людей и животных, а также в качестве добавок в пищу сельскохозяйственных животных и птицы для стимуляции роста и профилактики некоторых инфекций. Такое использование антибиотиков наряду с положительным эффектом приводит к появлению и широкому распространению устойчивых к антибиотикам патогенных микроорганизмов. Это существенно затрудняет лечение вызванных ими инфекционных болезней человека и животных (Навашин С.М., Фомина И.П. "Рациональная антибиотикотерапия". М., "Медицина", 1982, с.4-7, 421-427).

Все это диктует необходимость определения наличия и концентрации антибиотических веществ в различных объектах. Допустимое содержание антибиотиков в продуктах не должно превышать для тетрациклинов 0,01 ЕД, пенициллинов 0,01 ЕД, для стрептомицина 0,5 ЕД на 1 г (мл) продукта ("Методические указания" - МУК 4.2.026-95, с.5-6).

Разработаны способы определения антибиотиков. Среди них самым чувствительным и быстрым является иммуноферментный анализ (ИФА) с присущими ему достоинствами и недостатками. К достоинствам ИФА следует отнести высокую чувствительность и возможность учета результатов через несколько часов от момента начала исследования. К недостаткам метода относятся сложность осуществления самого анализа, трудности с оценкой специфичности полученных результатов и высокая стоимость.

Наиболее близким по техническому решению является способ определения антибиотиков с использованием спорообразующих тест-культур: Bacillus subtilis вар L₂, Bacillus mycoides 537 и Micrococcus lutеum ATCC 9341 - для определения пенициллина и стрептомицина; Bacillus subtilis вар L₂ - для определения тетрациклина ("Экспресс-метод определения антибиотиков в пищевых продуктах", "Методические указания" - МУК 4.2.026-95, с.8). В процессе исследования устанавливают "рабочую дозу" тест-культуры. Для качественного определения антибиотика требуется 4-5 часов, включающих термостатирование при 37^oС - оптимальной температуре роста и размножения тест-культур. В присутствии антибиотика бактерии тест-культуры не растут, индикатор метиленовый синий в питательной среде не восстанавливается и окраска проб не меняется (остаются синими). В отсутствии антибиотика исследуемые пробы обесцвечиваются. Для количественного определения антибиотиков готовят их стандарты с известной активностью, которые исследуют одновременно с пробами. Чувствительность метода для пенициллина - 0,07 ЕД/мл пробы. Недостатком являются возможные ложноотрицательные результаты из-за загрязнения проб бактериями, в том числе спороносными, которые не все погибают при прогревании исследуемых материалов в течение 30 мин при температуре (60±1)^oС (МУК 4.2.026-95, с.7). Поэтому загрязняющие бактерии будут размножаться при последующей инкубации посевов в течение 4-5 часов при 37^oС, что приведет к обесцвечиванию проб за счет восстановления индикатора - метиленового синего. Применение метода возможно только для умеренно обсемененных бактериями проб. Другим недостатком является использование в качестве индикаторов нескольких штаммов тест-культур вегетативных форм бактерий, что ограничивает срок годности материалов до исследования 7 днями.

Целью изобретения является повышение чувствительности, универсальности и надежности определения антибиотиков биологическим методом.

Поставленная цель достигается использованием в качестве тест-культуры Bacillus stearothermophilus КК-ВКМ В-2130Д (Патент 2102475 от 20.01.98 на изобретение "Штамм бактерии культуры Bacillus stearothermophilus КК-ВКМ В-2130Д, используемый для бактериологического контроля эффективности паровой стерилизации") - облигатного термофильного спорообразующего микроорганизма с оптимальной температурой роста 55-60^oС, факультативного анаэроба, высокочувствительного ко всем широко применяемым антибиотикам (Краткий определитель бактерий Берги. М., Изд. "Мир", 1980, с.286-291; Сучков Ю.Г., Леви М.И. , Бессонова В.Я. Новый термофильный штамм для бактериологического контроля паровой стерилизации. Сообщение I. Ж. "Дезинфекционное дело" 3, 1996, с. 28-33). Можно использовать и другой спорообразующий факультативный термофильный вид бактерий - Bacillus licheniformis штамм G (Краткий определитель бактерий Берги. М., Изд. "Мир", 1980, с.288).

Пример 1. Определение антибиотиков в мясе, молоке и молочных продуктах включает этап приготовления проб. Для этого мясо скота и кур измельчают в гомогенизаторе, берут пробу в количестве 9 г и добавляют по 1 мл раствора ампициллина до концентрации 1 ЕД и 10 ЕД антибиотика в 1 г пробы. Смесь дополнительно гомогенизируют пестиком в стерильной ступке, после чего тканевый сок фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Фильтрат исследуют в стандартных стерильных пластинах для иммуноферментного анализа, титруя путем последовательных двукратных разведений в объеме 50 мкл цветной питательной среды с 0,5% глюкозы и 0,002% бромкрезолового синего в качестве индикатора. Среда при рН 7,4-7,7 имеет интенсивный сиреневый цвет. Во все лунки пластины добавляют по 50 мкл суспензии в цветной среде, содержащей 10⁷ спор/мл Bacillus stearothermophilus. Посевы инкубируют при (55±2)^oС, через 5-6 часов учитывают результаты. Изменение цвета питательной среды на желтый указывает на размножение бактерий. Активность антибиотика выражают в минимальной подавляющей концентрации - МПК в 1 мл исследуемой пробы (табл.1). МПК колеблется от 0,0025 до 0,005 мкг/мл. Для исходного препарата ампициллина она составляет 0,0025 мкг/мл.

Стерильную исследуемую кровь донора отделяют от эритроцитов центрифугированием при 2000 об/мин в течение 10 мин. Надосадочную жидкость - плазму крови разводят 1: 10 стерильным 0,85% раствором NaСl и добавляют раствор ампициллина до концентрации 10 ЕД/мл плазмы.

Мочу человека подщелачивают до рН 7,0-7,4 добавлением 0,1% раствора NaOH. К ней добавляют раствор ампициллина до концентрации 10 ЕД/мл.

Пробы исследуют по вышеописанной методике. Результаты представлены в таблице 1. МПК колеблется от 0,0025 до 0,005 ЕД/мл пробы, как и для проб пищевых продуктов (мясо-молочных).

Молоко и кефир перед исследованием створаживают добавлением к 10 мл 1% раствора НСl: 50-100 мкл для молока и 25-50 мкл для кефира. Молочную сыворотку отделяют фильтрованием через стерильный ватно-марлевый фильтр. К 2 мл фильтрата добавляют 10-20 мкл 1% раствора NaOH. Пробы исследуют по вышеописанной методике. Результаты приведены в таблице 1. МПК составляет 0,005 мкг/мл, что в 2 раза выше, чем для исходного антибиотика.

Пример 2. По аналогичной методике исследуют мясо скота и кур с использованием спор Bacillus licheniformis штамм G. В этом случае МПК для ампициллина колеблется от 0,005 до 0,01 мкг/мл.

Пример 3. Пробы из гнойных ран больных через 1-1,5 часа после введения одного из антибиотиков берут ватно-марлевым тампоном, смоченным 0,85% раствором NaCl. При этом раневое отделяемое разводят от 1:2 до 1:3 и через 2 часа подвергают количественному и качественному анализам. Количественное определение антибиотика выполняют описанной в примере 1 методикой. Степень активности антибиотика в раневом отделяемом определяют в сравнении с МПК введенного больному препарата, который служит стандартным образцом при исследовании. У всех 13 больных в раневом отделяемом обнаружен антибиотик, МПК которого всегда достоверно выше, чем у исходного препарата (таблица 2).

Пример 4. Для качественного определения наличия антибиотика на агаровую питательную среду в чашке Петри диаметром 90 мм наносят 2 мл суспензии спор Bacillus stearothermophilus, содержащей 10⁸ КОЕ/мл. Через 10 мин отсасывают остатки жидкости, чашки подсушивают при температуре (22-25)^oС до полного высыхания. На поверхность чашки наносят раневое отделяемое в объеме 5 мкл. Посевы помещают в термостат при (55±2)^oС на 18-22 часа. Отсутствие роста бактерий в местах нанесения раневого отделяемого указывает на наличие антибиотика в исследуемой пробе. При этом в контрольных посевах без тест-культуры роста бактерий из раневого отделяемого при этой же температуре не наблюдают. В гнойном отделяемом больных, не леченных антибиотиками, задержки роста тест-культуры не происходит.

Изобретение относится к области медицины, а также ветеринарной и сельскохозяйственной микробиологии. Способ характеризуется тем, что используют в качестве тест-культуры споры Bacillus stearothermophilus штамма КК-ВКМ В-2130Д - облигатного термофильного спорообразующего микроорганизма с оптимальной температурой роста 55-60^oС, факультативного анаэроба, высокочувствительного ко всем широко применяемым антибиотикам, или споры других термофильных бактерий. Исследуемый материал титруется в пластинах для иммуноферментного анализа в цветной питательной среде с индикатором. В лунки добавляют споры тест-культуры, содержащей 10⁷ спор/мл. Посевы инкубируют при 50-60^oС. Посторонняя микрофлора не растет при этой температуре. Отсутствие изменения цвета среды указывает на наличие антибиотика в исследуемом материале. Способ надежен, обеспечивает повышенную чувствительность определения. 2 табл.

Способ экспрессного определения антибиотиков в различных объектах, включающий инкубацию тест-культуры совместно с пробой исследуемого объекта, отличающийся тем, что в качестве тест-культуры берут высокочувствительные к антибиотикам штаммы термофильных бактерий Bacillus licheniformis или Bacillus stearothermophilus с оптимумом роста при температуре 50-60^oС и по отсутствию роста определяют наличие антибиотика в объекте.