Штамм бактерий BacILLUS LIснеNIFоRмIS, используемый для контроля эффективности воздушной стерилизации Советский патент 1992 года по МПК C12N1/20 C12Q1/00 

Изобретение относится к медицинской микробиологии и касается штамма бактерий спорообразующёго микроорганизма для контроля эффективности стерилизации изделий медицинского назначения термическим методом, а именно стерилизаций сухим горячим воздухом.

Известны штаммы микроорганизмов, например спорообразующих бактерий Bacillus subtilis, В. subtllis var. niger (В, gtobigii), нетоксигенный штамм ClOstrldlum tetani, которые используют для бактериологического контроля эффективности стерйлизации-воздушным методом.. :

Однако эти штаммы обладаю т низкой устойчивостью к действию сухого горячего воздуха. Так, например, штамм В. subtllis

van niger имеет показатель устойчивости Д1боо 18с.

Целью изобретения является повышение надежности бактериологического контроля эффективности стерилизации воздушным методом.

Штамм спорообразующёго термоустойчивого микроорганизма выделен с чашки, подвергнутой стерилизации сухим горячим воздухом, при инкубации чашек Петри для контроля стерильности. Микроорганизмы давали сливной рост на дне чашки Петри под слоем агара в виде крупных колоний в диаметре 10 мм со светлым центром и неровным краем.

Штамм характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические принаки.

Вегетативные клетки прямые, палочкоидные, расположены единично, Граммпоожительные. Подвижные,

На пшеничном агаре образует эндоспоры эллиптической формы, расположенные центрально, раздутость спорангия отсутствует.

На мясопептонном бульоне (рН 7,3±0,1) штамм через 48 ч инкубации при 37±1°С образует помутнение питательной среды,. на поверхности образует плёнку.

На мясопептонном агаре (рН 7,3±0,1) через 48 ч инкубации при 37±1°С образует слабо выпуклые сухие колонии вытянутой звездчатой формы с неровными краями диаметром 4-6 мм, врастающие в среду.

Физиолого-биохимические признаки.

Факультативный анаэроб. Максимальная температура роста 55, минимальная 15, оптимальная 37°С. Растет в бульоне с добавлением 7% поваренной соли, при рН 5,6. Продуцирует каталазу. Реакция Фогес-Проскауэра положительная. Отношение к источникам углерода - расщепляет глюкозу с образованием кислоты и газа (слабо). Отношение к источникам азота - редуцирует нитраты, образует газ в анаэробных условиях на среде для денитрификации. Гидролизует крахмал. Утилизирует пропионат. Расщепляет аргинин. Не образует индол, лецитиназу, кислоту в лакмусовом молоке.

Показатели термоустойчивости.

При нагревании в ультратермостате ампул с суспензией плотностью 1 10 спор в 1 мл дистиллированной воды - Дюо о 1,7 мин, Д105 о 1,2 мин и Дюо о 0,9 мин, Z 32°С; при действии сухого горячего воздуха на биотесты с использован1/1ем алюминиевой фольги в качестве носителя Д1бо о 2,8 мин, при действии сухого горячего воздуха с температурой 1бЬ°С в воздушном стерилизаторе ja биотесты, содержащие 5 10-5 10 спор на носитель (инсулиновые флаконы, алюминиевая фольга), время выживания тест-культуры на носителе не менее 4 мин для каждого образца, время гибели не превышает 30 мин для каждого образца.

Штамм назван Bacillus llcheniformfs G, Штамм депонирован в Всесоюзной коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР, коллекционный номер ВКМ В-1711 Д.

Штамм бактерий В. licheniformls G использован для планового бактериологического контроля эффективности воздушной стерилизации в лечебно-профилактических

учреждениях, для испытаний новых типов воздушных стерилизаторов и разработки нового режима стерилизации изделий медицинского назначения сухим горячим воздухом.

Пример 1. Контроль эффективности воздушной стерилизации проводят с использованием биотестов. Биотесты представляют инсулиновые флаконы или чашечки из алюминиевой фольги, содержащие высушенные споры штамма В. licheniformls G в количестве 510 -510 спор на носитель в пакетах из упаковочной бумаги.

Для изготовления биотестов в асептиЧеских условиях вскрывают ампулу с лиофилизированной культурой В. licheniformls штамм G, Суспензию переносят в две пробирки с бульоном Хоттингера, содержащим 0,5% глюкозы (по 1-2 капли). Посевы инкубируютпри 37±1°С в teчeниe/24 ч. При росте культуры отмечают помутнение питательной среды и образование пленки.

Суточную бульонную культуру бактериологической петлей пересевают на скошенную питательную среду в пробирках (мясопептонный агар). Посевы инкубируют при 37±1°С в течение 24 ч, после чего культуру, выращенную на твердой питательной среде, смывают 5 мл стерильной дистиллированной воды.

Для получения спор производят пересев культуры во флаконь, содержащие скошенный пшеничный агар. Взвесь равномерно распределяют по поверхности среды.

Флаконы закрывают ватно-марлевыми пробками с бумажными колпачками и инкубируют при 37±1°С в течение 7-10 сут, в наклонном положении (под углом 45°) агаром вверх. На 5,7 и 10 сут..культуру проверяют на интенсивность спорообразования (выборочно 2-3 флакона).

После завершения споруляции культуру осторожно при помощи шпателя из проволоки смывают с поверхности агара 5 мл стерильной дистиллированной воды.

Для удаления вегетативных клеток полученную суспензию прогревают при 6570°С в течение 30 мин в водяной бане (экспозиция с момента достижения температуры на термометре, опущенном в контрольную емкость с водой), центрифугируют в стерильных центрифужных пробирках, закрытых ватно-марлевыми пробками, с частотой вращения 33,33 с (2000 об/мин)

в течение 15 мин. Далее надосадочную жидкость осторожно удаляют, а осадок трехкратно промывают стерильной дистиллированной водой, чередуя с центрифугированием, после чего суспендируют в

небольшом объеме ctepильнoй дистиллированной воды.

Для определения числа жизнесгюсобных спор в полученной суспензии .готовят десятикратные разведениякультуры. Из трех последовательных десятикратных разведений исходной суспензии (предел piasBeдения зависит от концентрации полученных спор (ориентировочно от 10 до Ю производят высев по 0,1 мл суспензии на поверхность трех чашек Петри с мясопептрнным агаром. Чашки Петри инкубируют при 37 ±1°С в течение 48 ч, после чего производят подсчет выросших колоний. Прибл(1зительную концентрацию спор в, исходной Суспензии определяют с учетом посевной дозы и разведений исходной суспензии.

В качестве носителей используют инсулиновые флаконы или чашечки из алюминиевой фольги, которые стерилизуют пвррвым методом в упаковке из бумаги (чашечки из алюминиевой фольги раскладывают вчашки Петри). Стерильные носители с помощью пипеточного дозатора обсеменяют суспензией спор В. licheniformls штамм G из расчета 5-10 -5-10 спор на носитель, что достигается нанесением на каждый носитель 0.02 мл суспензии спор в дистиллированной воде плотностью 2, спор в 1 мл.

Носители высушивают в термостате при 37±1°С или в эксикаторе над осушителем (силикагель, хлористый кальций) при :комнатной температуре в течение 24 ч, пх)мещают в пакеты из упаковочной бумаги, маркируют и запаивают в полиэтиленовые пакеты. Срок хранения при 4°С 2 года.

Определение устойчивости штамма к действию сухого горячего воздуха проводят при 160±2°С в воздушных стерилизаторах с принудительной циркуляцией и скоростью движения воздуха более 1м/с (ГП-20, ГП-40, ГП-80). Показатели устойчивости биотестов должны быть: время выживания тест-культуры на носителе не менее 4 мин для каждого образца, время гибели не должно пр1евышать 30 мин для каждого образца.

При проведении-контроля биотесты размещают в контрольные точки стерили ационной камеры между издедиямиу, подвергающимися стерилизации. .К личество контрольных точек зависит от размера стерилизационной камеры (от 5 до 15 биотестов).

По окончании времени стерилизацйонной выдёржки биотесты вынммают из стерилизатора и доставляют в бактериологическую лабораторию, где производят посев с соблюдением асептических условий.

Для культивирования биотесТов после стерилизации используют бульон Хоттингера. содержащий 0.5% глюкозы. Биотесты инкубируют при 37±1°С в течение 7 сут. Учет результатов контроля проводят путем ежедневного визуального осмотра биотестов. Биотесты считают стерильными, если помутнение питательной среды отсутствует, что указывает на гибель спор штамма В. llchenlformis G, т.е. на эффективность проведенной стерилизации, Помутнение питательной среды и образование пленки указывает на неэффективность проведенной стерилизации. Окончательный ответ дают после выделения чистой культуры и сравнения ее с контролем.

Дезинфекционная станция г.Москвы провела бактериологический контроль эффективности воздушной стерилизации в-лечебно-профилактических учреждениях (температура стерилизации 180°С, время выдержки 60 мин). Суммированные результаты контроля приведены в табл.1,

В 93 случаях (2,4%) воздушная стерилизация признана неудовлетворительной. Причинами неудовлетворительных результатов контроля были различные нарушения при проведении стерилизации (избыточная загрузка аппаратов, многослойная укладка стерилизуемых изделий, препятствующая циркуляции воздуха, использование в качестве упаковки закрытых металлических пеналов), технические неисправности аппаратов(неисправность нагревательных элементов, дефекты прокладок) и контрольно-измерительной аппаратуры (неисправность термометров).

Проведение организационно методической работы с персоналом лечебнопрофилактических учреждений и введение планового контроля позволило в 4 раза снизить неудовлетворительные результаты бактериологического контроля эффективности воздушной стерилизации.

П р и м е р 2. Для установления бактериологической эффективности воздушной стерилизации в аппаратах нового типа проводят не менее трех опытов с использованием разработанных биотестов на основе штамма В. tlcheniformis G на каждый режим стерилизации при загруженной стерилизационной камере. Биотесты в упаковочной бумаге размещают на загрузочных полках стерилизатора в тех же точках, где располагали датчики температуры. По окончании стерилизации биотесты вынимают и производят посев с соблюдением асептических условий. Результаты испытаний опытных образцов воздушных стерилизаторов представлены в табл.2.

Результаты бактериологического контроля эффективности воздушной стерилизации с использованием биотестов на основе штамма В, llcheniformis G позволяют рекомендовать исследованные аппараты к серийному производству.

Примерз. Штамм бактерий В, llcheniformis G использован для разработки режима стерилизаций изделий медицинского назначения сухим горячим воздухом при 160°С в воздушных стерилизаторах с принудительной {диркуляцией и скоростью движения воздуха в рабочей камере более 1 м/с. Таковыми являются выпускаемые отечественной промышленностью воздушные стерилизаторы ВП-10. ГП-20, ГП-80, ГГ1-320 и ГП-640.

При экспериментальных исследованиях в качестве имитатора загрузки используют упакованные в бумагу чашки Петри как наиболее энергоемкие объекты стерилизации, которые равномерно размещают по объему камеры исследуемых стерилизаторов.

Для определения времени стерилизаЦионной выдержки изделий медицинского назначения в качестве тест-объектов используют чашки Петри, которые обсеменяют суспензией СПОР штамма B. lichenlformis G из расчета 5-10 спор на тест-объект. Чашки Петри упаковывают и размещают на загрузочных полКах стерилизатора в тех же точках, где располагают датчики температуры.

По окончании времени стерилизационной выдержки тест-объекты вынимают из стерилизатора, заливают агаром Хоттингера (содержание аминного азота от 140 до 160 мг%) и инкубируют при 37±1°С в течение 14 сут. В случае отсутствия роста чашки Петри считают стерильными. При наличии роста сравнивают колонии с колониями в контрольной чашке, которую не подвергают стерилизации. Идентичность колоний свидетельствует о нестерильности тест-объектов.

Результаты бактериологического контроля эффективности стерилизации сухим горячим воздухом при 160°С в зависимости от времени стерилизационной выдержки представлены в табя.З.

Анализ данных, представленных в табл.3, показывает, что стерилизация тестобъектов в стерилизаторе наибольшего объема была достигнута под воздействием сухого горячего воздуха температурой 160°С при времени стерилизационной выдержки 135 мин.

На основании проведенных исследований для воздушных стерилизаторов с принудительной циркуляцией и скоростью движения воздуха более 1 м/с был предложен режим стерилизации сухим горячим воздухом при 160°С втечение 150 мин.

Штамм бактерий В. licheniformls G обладает характерными морфологическим,и, биохимическими и культуральными свойствами, растет на общепринятых питательных 5 средах, образуя термоустойчивые споры, и может быть рекомендован для бактериологического контроля эффективности воздушной стерилизации, оценки новых типов воздушных стерилизаторов и разработки режимов стерилизации сухим горячим воздухом.

. Использование предлагаемого штамма обуславливает социальный эффект, так как позволяет повысить эффективность бактериологического контроля воздушной стерилизации в лечебно-прО|филактических учреждениях, что будет способствовать повышению эффективности профилактики внутрибольничных инфекций.

Формул а изобретения

Штамм бактерий Bacillus licheniformis ВКМ В-1711Д, используемый для контроля эффективности воздушной стерилизации.

/

Таблица 1

Изобретение относится к медицинской микробиологии и касается штамма бактерий спорообразующёго "микроорганизма для контроля эффективности стерилизации изделий медицинского назначения термическим методом,' а именно стерилизации сухим горячим воздухом. Целью изобретения является повышение надежности бактериологического контроля эффективности стерилизации воздушным методом. Штамм Bacillus llchenlformis выделен с чашки Петри, подвергнутой стерилизации горячим воздухом, и депонирован под номером ВКМ В-171 ID. Штамм обладает характерными морфологическими, биохимическими и куяь- туральными свойствами и может быть рекомендован для бактериологического контроля эффективности воздушной стерилизации, оценки новых типов воздушных стерилизаторов и разработки новых режимов стерилизации сухим горячим воздухом. 3 табл.уё

Примечание. Числитель - число исследованных аппаратов. Знаменатель аппаратов, где биотесты дали рост штамма В. llcheniformis G.

число

Примечание. Числитель - число исследованных тест-объектов. Знаменатель - число тест-объектов, давших рост штамма В. llchenlformls G.

Таблица 2

Таблица 3