СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БАКТЕРИОСТАТИЧЕСКОГО И БАКТЕРИЦИДНОГО ДЕЙСТВИЯ АНТИБИОТИКА Российский патент 2003 года по МПК C12Q1/04 C12N1/20 

Изобретение относится к медицинской и ветеринарной микробиологии и касается способа определения бактерицидного и бактериостатического действия антибиотиков.

Одним из важнейших признаков для антибиотиков является тип их действия на микроорганизмы - бактериостатический и бактерицидный (Навашин С.М., Фомина И.П. Рациональная антибиотикотерапия. М., "Медицина", 1982, с.15-17).

Такое деление антибиотиков в значительной мере определяет тактику их применения для лечения больных (доза, способ введения, продолжительность лечения, сочетанная антибиотикотерапия и другие показатели). Определенное влияние на тип действия антибиотиков оказывают микроорганизм, свойства антибиотика, а также их концентрация.

Для отличия типов действия антибиотиков до настоящего времени используют установление жизнеспособности клеток чаще всего посевами в жидкие или агаровые питательные среды с определением числа бактерий до и после контакта с антибиотиком (Сазыкин Ю. О. Биохимические основы действия антибиотиков на микробную клетку. М., "Наука", 1965, с.11-13). В специальных целях применяют и другие методики, например способность бактерий к синтезу белка, дыханию клеток, ферментации углеводов и другие показатели их жизнедеятельности, а также регистрируемое приборами нарушение морфологии клетки (Сидоренко С.В., Федорович В.Ю. Ускоренный метод определения минимальной подавляющей концентрации антибиотиков на планшетных спектрофотометрах со встроенным термостатом. Тезисы 11-й Российской научно-практической конференции, 7-9.12.99 г. "Внутрибольничные инфекции - проблемы эпидемиологии, клиники, диагностики, лечения и профилактики". М., 1999, с.220-221). Однако наиболее доступным и доказательным бактерицидным типом действия является отсутствие способности клеток к росту и размножению после удаления антибиотика.

Известно, что существуют бактериальные ферменты, вырабатываемые микроорганизмами семейства Еnterobacteriасеае, которые инактивируют беталактамные антибиотики различных классов, в том числе цефалоспорины I-IV поколений, кроме цефаломицинов. Эти ферменты получили название беталактамазы расширенного спектра действия. По субстратной специфичности выделяют пенициллиназу - фермент, разрушающий пенициллины ("Антибактериальная терапия" под ред. Страчунского Л.С. и др. М., 2000, с.ХШ). Фермент инактивирует чувствительные к нему антибиотики.

Наиболее близким по техническому решению и достигаемому положительному эффекту к предлагаемому способу определения бактериостатического и бактерицидного действия антибиотиков является метод серийных разведений суспензии смеси бактерий и раствора антибиотика (Навашин С.М., Фомина И.П. Рациональная антибиотикотерапия. М., "Медицина", 1982, с.72). Однако этот метод выполняют в пробирках и в объеме до 500 мкл. Результаты учитывают через 16-18 ч инкубации посевов при 37^oС по изменению цвета и помутнению среды. При этом определяют задержку роста бактерий без дифференциации бактерицидного и бактериостатического действия антибиотика. Прототипом является способ определения чувствительности бактерий к антибиотикам с применением индикатора фенолрот в средах Хэнкса с сывороткой и гидролизатом лактальбумина, входящих в состав синтетической среды 199 для культуры тканей, что позволяет учитывать результаты через 5-6 ч по изменению цвета среды после посева стафилококков, кишечной палочки, синегнойной палочки, протея, стрептококка и других (более 12 видов) бактерий семейства Еnterobacteriасеае, что не всегда к этому времени сопровождается помутнением питательной среды (Леви М.И., Горожанкина И. А., Сагатовская Л.А. Быстрый метод определения чувствительности культур к различным антибиотикам в жидкой среде. Антибиотики, 1, 1967, с.57-60). В указанном способе-прототипе не предусмотрена возможность дифференцировать бактериостатический и бактерицидный тип действия антибиотиков.

Целью изобретения является повышение надежности метода и ускорение определения с разграничением типа бактериостатического и бактерицидного действия антибиотиков.

Поставленную цель достигают использованием очищенных препаратов беталактамаз для инактивации чувствительных к ним беталактамных антибиотиков и последующего беспрепятственного роста выживших бактерий в пробах. Это определяют по изменению окраски и (или) мутности среды. Ферментирующие глюкозу бактерии окисляют ее, что регистрирует индикатор в жидкой среде, изменяя цвет. При этом некоторые бактерии могут подщелачивать ее. Не ферментирующие глюкозу бактерии не меняют рН, но рост сопровождается помутнением среды.

Предлагаемый способ выполняют в три этапа. Исследование проводят в стерильных 96-луночных планшетах, предназначенных для иммуноферментного анализа однократного применения (ТУ 64-2-375-86. "Медполимер", Санкт-Петербург) или других подобных планшетах.

Первый этап - последовательное двукратное (или с другим интервалом) разведение исследуемого антибиотика в двух параллельных рядах в 8 или 12 лунках планшета в объеме 50 мкл цветной питательной среды с 0,5% глюкозы и 0,002% бромкрезолового пурпурового в качестве индикатора. Среда при рН 7,4-7,7 имеет интенсивный сиреневый цвет.

Второй этап - добавление во все лунки с антибиотиком по 50 мкл суспензии исследуемых бактерий в указанной цветной среде, содержащей 2•10⁷ микробных клеток (м. к.) 1 мл по оптическому стандарту мутности. После ручного встряхивания пластины помещают в термостат при 37^oС, где инкубируют в течение времени, необходимого для появления роста бактерий в контроле (без антибиотика). Для большинства бактерий семейства Enterobacteriaceae требуется для этого 3-6 ч. При отсутствии изменения цвета в контроле пластины оставляют в термостате, продолжая наблюдение. После инкубации регистрируют результаты. Ускорение роста бактерий достигается уменьшением объема питательной среды, как это было установлено ранее (Патент на изобретение 2151187: Способ определения эффективности паровой стерилизации бактериологическим методом. Ю.Г. Сучков, М. И. Леви. 20.06.2000 г.), и необходимой концентрацией бактерий в ней (до 10⁵ м.к.). Дальнейшее повышение концентрации не целесообразно, так как результат может искажаться за счет появления спонтанных мутантов с устойчивостью к антибиотикам, которые могут появляться с частотой 1•10^-6-1•10^-13 (Навашин С.М., Фомина И.П. Рациональная антибиотикотерапия. М., "Медицина", 1982, с.26).

Третий этап исследования. После регистрации роста бактерий добавляют в один ряд 50 мкл раствора беталактамазы в цветной среде в избыточной дозе, в 3-6 раз превышающей минимальную, для надежной нейтрализации наибольшей концентрации антибиотика, что выясняют эмпирически до проведения исследования или исходят из определения 1 ЕД беталактамазы. За 1 ЕД принимается наименьшее количество препарата фермента, способное инактивировать 60 ЕД бензилпенициллина в течение 1 ч при 37^oС (Машковский М.Д. Лекарственные средства. М., 1978, ч. II, с. 35-36). В другой параллельный ряд добавляют 50 мкл цветной среды. Пластины вновь помещают на 3-5 или до 18-24 ч в термостат при температуре 37^oС. Результаты регистрации роста бактерий после второго этапа сравнивают с ростом после добавления фермента. При бактериостатическом действии антибиотика на бактерии после добавления пенициллиназы появляется рост бактерий в тех лунках, где его не обнаружили после второго этапа исследования. При бактерицидном действии антибиотика рост бактерий не возобновляется.

Способом разграничения бактериостатического и бактерицидного действия антибиотиков, не входящих в группу беталактамных, является использование разведения смеси антибиотика и бактерий до таких концентраций, когда становится возможным размножение бактерий и регистрация этого размножения. В этом способе была использована способность бактерий (в присутствии подпороговых концентраций антибиотика) размножаться, что документируется ростом колоний на агаре, помутнением жидкой питательной среды или изменением ее цвета в результате утилизации глюкозы.

Способы исследованы в сравнении со способом-протопипом по критериям изменения окраски и (или) помутнению среды при плановом бактериологическом исследовании материала от гнойно-септических больных в лечебно-профилактических учреждениях Москвы. Применение в исследовании небольших объемов ингредиентов наряду с ускорением получения результатов приносит экономический эффект. Использование предлагаемого способа разграничения бактериостатического и бактерицидного эффекта действия антибиотиков основывалось на "Методических рекомендациях по ускоренному отбору эффективных антибиотиков для лечения больных госпитальными инфекциями", утвержденными МЗ РФ 10.01.2000 г., 1100/26-0-117.

Пример 1. Определение бактерицидного и бактериостатического действия натриевой соли бензилпенициллина на музейные культуры бактерий.

В экспериментальных исследованиях использовали музейные бактериальные штаммы Е. соli К-12, Stahylococcus aureus Wood, Yersinia реstis ЕV (вакцина), Yersinia рsеudotuberculosis 1985 III серовара, Васillus аnthracis СТИ (вакцина), Васillus сеrеus 96, Васillus subtilis 168, Васillus stearothermophilus ВКМ-718. Все культуры бактерий выращивали при температуре 37^oС, кроме Yersinia реstis ЕV (26^oС) и Васillus stearothermophilus (55^oС). В качестве основы жидкой питательной среды применяли питательный бульон для культивирования микроорганизмов, сухой, НПО "Питательные среды" (г. Махачкала), в который добавляли 0,5% глюкозы и 0,002% индикатора бромтимолового синего или бромкрезолового пурпурового (цветная среда). Раствор натриевой соли бензилпенициллина 1000 мкг/мл титровали в двух параллельных рядах для каждой культуры цветной среды двукратным последовательным разведением в объеме 50 мкл. В оба ряда добавляли по 50 мкл суспензии бактерий в цветной среде из концентрации 2•10⁷ м.к. в 1 мл. Пластины с посевами после ручного встряхивания помещали в термостат при оптимальной для каждого микроорганизма температуре. В контрольных лунках находились бактерии без антибиотика.

После пожелтения среды в контрольных посевах регистрировали результаты, а затем в один ряд добавляли по 50 мкл раствора пенициллиназы с исходной концентрацией 1000 БД в 1 мл цветной среды, в другой ряд добавляли по 50 мкл той же среды без фермента. Через 11-12 ч дополнительной инкубации при оптимальных для бактерий температурах вновь регистрировали рост бактерий и сравнивали с первым результатом (табл. 1). По этим данным видно, что учет роста бактерий в испытанных средах возможен через 3-5 ч. Добавление пенициллиназы с последующим инкубированием посевов в ряде случаев приводит к появлению роста бактерий в тех лунках, где ранее цвет среды не изменился. Однако для St. аureus, Y. рsеudotuberculosis и В. сеrеus - высокочувствительных к антибиотику, эта разница не превышала двукратного значения. В то же время МЗК после добавления пенициллиназы для других бактерий возрастала более чем в 40-80 раз.

В способе последовательного двукратного разведения антибиотика с использованием автоматических пипеток со съемными наконечниками разница в одно разведение (в 2 раза) не является доказательной. Поэтому результаты, полученные в питательных средах с двумя испытанными индикаторами, следует признать идентичными и считать, что в данных условиях постановки опыта пенициллин оказывает бактерицидное действие на St. аurеus, Y. рseudotuberculosis и В. сеrеus, а для других видов при данных условиях опыта пенициллин оказывает бактериостатический тип действия.

Пример 2. Определение бактерицидного и бактериостатического действия натриевой соли бензилпенициллина на Staphylococcus аurеus.

Смешивали суспензию Staphylococcus аurеus, штамм Wood с раствором пенициллина и после экспозиции при 37^oС готовили последовательные разведения смеси в цветной питательной среде, как указано в табл. 2. После 24-часового термостатирования при 37^oС учитывали результаты.

Задержка роста бактерий с пенициллином происходит до разведения смеси 1: 64 тыс. при росте бактерий в разведениях с 1:128 тыс. до 1:1 млн., как и в контроле, при отсутствии роста в последующих разведениях, где и теоретически не было бактерий.

Появление роста в разведениях 1:128 тыс. - 1:1 млн. произошло за счет снижения содержания антибиотика ниже минимальной задерживающей концентрации. В параллельном ряду с добавленной пенициллиназой во всех лунках, в том числе при максимальной концентрации антибиотика, наблюдали рост бактерий (пожелтение и помутнение среды). Наличие бактерий в этих лунках подтвердили посевами из них на питательный агар.

Пример 3. Определение бактерицидного и бактериостатического действия небеталактамного антибиотика - ципрофлоксацина.

Приводятся результаты опыта с раневым отделяемым больного Т-ва. В лунках планшета антибиотик протитрован с 4-кратным интервалом, после чего высушен. Во все лунки добавлено отделяемое 6-го Т-ва. Через 6 ч обнаружили задержку роста бактерий в первых трех лунках при концентрации антибиотика. Из этих лунок сделали ряды последовательных двукратных разведений ("вертикальное титрование") в цветной среде в объеме 50 мкл. Посевы в планшете инкубировали при 37^oС в течение 14 ч. Результаты приведены в табл.3. В контроле и низких концентрациях антибиотика рост бактерий обнаружили в тех же разведениях, что и в рядах, где в исходных лунках планшета была задержка размножения бактерий за счет высокой концентрации ципрофлоксацина. При снижении концентрации разведением ниже 6,2 мкг/мл обнаружили рост бактерий. Следовательно, как в примерах 1 и 2 с пенициллином, так и примере 3, но методом серийных разведений, доказали не бактерицидное, а бактериостатическое действие небеталактамного антибиотика - ципрофлоксацина.

Изобретение относится к медицинской и ветеринарной бактериологии и может быть использовано для дифференциации антибиотиков по бактерицидному бактериостатическому действию. Способ включает следующие операции: готовят последовательные разведения исследуемого антибиотика в питательной среде с индикатором в лунках планшеты, затем добавляют в лунки с антибиотиком (опыт) и лунки с питательной средой (контроль) исследуемый материал, содержащий бактерии. Планшету инкубируют в течение 3-6 ч и регистрируют наличие роста бактерий по помутнению и/или изменению окраски среды. При наличии роста в контроле и отсутствии роста в опытных лунках с малым разведением антибиотика в последних снижают концентрацию антибиотика и продолжают инкубирование до 11-24 ч. Затем повторно регистрируют наличие роста бактерий по тем же показателям и при его наличии определяют бактериостатическое действие, а при его отсутствии - бактерицидное действие антибиотика. Снижение концентрации антибиотика осуществляют с помощью бета-лактамазы в случае дифференциации бета-лактамных антибиотиков или методом серийных разведений для остальных классов антибиотиков. 2 з.п. ф-лы, 3 табл.

1. Способ определения бактериостатического и бактерицидного действия антибиотика, отличающийся тем, что готовят последовательные разведения исследуемого антибиотика в питательной среде с индикатором в лунках планшеты, затем добавляют в лунки с антибиотиком (опыт) и лунки с питательной средой (контроль) исследуемый материал, содержащий бактерии, планшету инкубируют в течение 3-6 ч, затем регистрируют наличие роста бактерий по помутнению и/или изменению окраски среды и при наличии роста в контроле и отсутствии роста в опытных лунках с малым разведением антибиотика в последних снижают концентрацию антибиотика и продолжают инкубирование до 11-24 ч, после инкубирования повторно регистрируют наличие роста бактерий по тем же показателям и при его наличии определяют бактериостатическое действие, а при его отсутствии - бактерицидное действие антибиотика. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что концентрацию антибиотика снижают добавлением бета-лактамазы. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что концентрацию антибиотика снижают методом серийных разведений.