СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ МУКОВИСЦИДОЗА Российский патент 2000 года по МПК C12Q1/68 C12N15/11 G01N33/48 

Изобретение относится к молекулярной биологии и медицине и может быть использовано для быстрого обнаружения аллеля с мутацией ΔF508 в гене трансмембранного регуляторного белка муковисцидоза (ТРБМ) при массовом скрининге образцов.

Патогенез муковисцидоза, одного из самых распространенных наследственных заболеваний человека, связан с наличием мутаций в гене ТРБМ. Наиболее часто встречающаяся мутация в гене муковисцидоза - делеция тринуклеотида CTT в 10 экзоне (ΔF508) составляет в России 56% от всех обнаруженных мутаций в этом гене. Отсутствие тринуклеотида приводит к экспрессии короткого варианта белка с измененными функциональными свойствами. Носители двух аллелей с мутацией больны муковисцидозом. Индивидуумы, гетерозиготные по ΔF508, часто страдают бронхо-легочными патологиями, бесплодием и имеют большой риск рождения больного ребенка. Частота гетерозигот среди здорового населения России составляет 4-5%.

Известны способы диагностики муковисцидоза, заключающиеся в амплификации фрагмента гена ТРБМ, который потенциально может содержать мутацию ΔF508, с последующим анализом ПЦР-продуктов посредством:
1) аллельспецифической гибридизации с мечеными ДНК-зондами (Kerem et al. , Identification of the cystic fibrosis gene: genetic analysis. Science, 1989, v. 245, p. 1073-1080);
2) определением размеров продуктов амплификации методом электрофореза в полиакриламидном геле (Kerem et al., Identification of mutations in regions corresponding to the two putative nucleotide (ATP)-binding folds of the cystic fibrosis gene. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, v. 87, p. 8447-8451).

Однако широкое внедрение этих способов в практику здравоохранения для массовой лабораторной диагностики муковисцидоза сопряжено с рядом трудностей.

К недостаткам первого способа аллельспецифической гибридизации относятся значительные затраты на приобретение меченых ДНК-зондов, мембран и других дорогостоящих реактивов. Второй способ определения размера амплифицированного участка ДНК, содержащего потенциальную делецию, достаточно продолжителен по времени и требует высокой воспроизводимости амплификационного процесса в пробе, что вряд ли достижимо при наличии вариабельных количеств ДНК в ней. Кроме того, некачественное разделение продуктов реакции в геле может приводить к ошибкам при генотипировании.

Наиболее ближайшим к заявляемому способу - прототипом является способ диагностики муковисцидоза путем выявления мутации ΔF508, основанный на двухэтапной процедуре прямой амплификации ДНК из пятен крови с последующей идентификацией мутации методом оценки наличия гетеродуплексов (Гусак Н.М., Горовенко Н.Г, Хоменко Н.Л., Бужиевская Т.И. "Методологические подходы к упрощению и ускорению процедуры идентификации мутации ΔF508 в гене трансмембранного регуляторного белка муковисцидоза", Биополимеры и клетка, 1994, т. 10, N 3-4, стр. 58-62).

Способ заключается в выявлении образующихся в ходе полимеразной цепной реакции гетеродуплексов от двух аллелей, отличающихся по длине на 1-4 нуклеотида. Такой гетеродуплекс имеет отличную от гомодуплекса конформацию и благодаря этому заметно менее подвижен при электрофорезе в 10% полиакриламидном геле. Для увеличения надежности выявления гетеродуплексов ПЦР-продукты каждой пробы смешивают с ранее полученными амплификатами контрольной ДНК: гомозиготной по нормальному аллелю (N/N) и отдельно с гомозиготной ДНК по мутированному аллелю (ΔF508/ΔF508).
К недостаткам данного способа следует отнести процедуру добавления ДНК с известным генотипом после амплификации, что существенно осложняет диагностику муковисцидоза при массовом скрининге. Кроме того, в условиях неконтролируемости количеств ДНК, взятых исходно для амплификации, концентрации ее могут быть низкими и выявление гетеродуплексов будет затруднено даже при добавлении соответствующих контрольных проб ДНК.

Технической задачей предлагаемого изобретения является повышение точности и надежности диагностики муковисцидоза, упрощение и удешевление способа для целей массового скриннинга в условиях лечебных учреждений.

Предлагаемый способ заключается в следующем. Геномную ДНК выделяют из 5-10 мл периферической крови по стандартной методике с использованием протеиназы K с последующей экстракцией фенол/хлороформом. Для амплификации нормального аллеля используют прямой праймер 5'-GGCAC-CATTA-AAGAA-AATAT-CATCT-T-3' (поз. 413-438 в экзоне 10 гена ТРБМ), оканчивающийся на 3'-конце тринуклеотидом CTT, отсутствующем в мутантном аллеле. Для амплификации аллеля с делецией используют прямой праймер 5'-GGCAC-CATTA-AAGAA-AATAT-CATTG-G-3' (поз. 413-441), без CTT, оканчивающийся последующим за ним тринуклеотидом TGG на 3' конце. В качестве обратного праймера для амплификации обоих аллелей используют праймер 5'-CATTC-ACAGT-AGCTT-ACCCA-3' (поз. 634-615).

При этом используют следующий режим амплификации: денатурация при 95^o - 4 мин, затем 35 циклов, каждый из которых состоит из денатурации - 0,8 мин при 95^o; отжига - 1 мин при 52-58^o и синтеза - 1 мин при 72^o. Продукты ПЦР анализируют с помощью электрофореза в 4% полиакриламидном геле с последующим окрашиванием бромистым этидием.

Диагностику проводят по наличию продуктов амплификации ДНК, которые соответствуют нормальному или мутантному аллелям. Так, наличие одной полосы в геле размером 222 п.н. указывает на присутствие только нормального аллеля и, следовательно, о том, что носитель образца ДНК - гомозиготен по нормальному аллелю. Выявление одной полосы размером 219 п.н. в геле свидетельствует о наличии только мутантного аллеля и, как следствие, о гомозиготности по мутантному аллелю индивидуума, от которого получена ДНК. Наличие полос как нормального, так и мутантного аллелей указывает на гетерозиготность носителя.

При клинических испытаниях предлагаемого способа выявления мутации было обследовано 17 пациентов с клиническим диагнозом муковисцидоза, 18 здоровых родственников и по 6 здоровых алтайцев и эскимосов. В результате 2 больных оказались гомозиготами, 6 - гетерозиготами по делеции ΔF508. Среди родственников выявлено 13 гетерозигот - носителей мутации. У здоровых индивидуумов мутантный аллель не выявлен.

Определяющими существенными отличиями заявляемого способа по сравнению с прототипом являются:
1. На стадии забора анализируемого материала и подготовки ДНК для амплификации в прототипе используют прямую амплификацию ДНК, без предварительного выделения ДНК, из высушенных пятен крови. В предлагаемом способе в качестве анализируемого материала используют периферическую кровь пациента, из которой выделяют ДНК, что позволяет повысить точность и надежность диагностики.

2. На стадии амплификации в прототипе проводят стандартную амплификацию с использованием пары праймеров, фланкирующих делецию ΔF508. В заявляемом способе используют принципиально новый подход - метод аллельспецифической ПЦР с использованием двух пар праймеров на нормальный и мутантный аллели. Для амплификации нормального аллеля используют прямой праймер 5'-GGCAC-CATTA-AAGAA-AATAT-CATCT-T-3', оканчивающийся на 3'-конце тринуклеотидом CTT, отсутствующем в мутантном аллеле. Для амплификации аллеля с делецией используют прямой праймер 5'-GGCAC-CATTA-AAGAA-AATAT-CATTG-G-3'', без CTT, оканчивающийся последующим за ним тринуклеотидом TGG на 3'-конце, что позволяет увеличить точность и надежность диагностики и упростить процедуру анализа продуктов амплификации. В заявляемом способе отсутствует этап смешивания амплификата с ДНК известного генотипа для надежного образования гетеродуплексов. Продукты амплификации анализируют в полиакриламидном геле, но в отличие от прототипа фиксируют конкретную полосу, размеры фрагментов ДНК в которой определяются условиями праймирования. Это снижает вероятность субъективной ошибки при интерпретации результатов генотипирования.

3. Для элекрофоретического разделения продуктов амплификации используют не 10%-ный полиакриламидный гель, а 4%-ный, что дополнительно упрощает и ускоряет процедуру анализа.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.

Пример 1.

Геномную ДНК пяти больных муковисцидозом выделяли из периферической крови с использованием протеиназы K и экстракции фенол/хлороформом. Смесь для амплификации объемом 25 мкл содержала 67 мМ трис-HCl, pH 8.4, 10 мМ бета-меркаптоэтанол, 0,01% твин-20, 1 мкг геномной ДНК, по 0.25 мкМ прямого и обратного праймера, по 0.2 мкМ четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов, 1.8 мМ MgCl₂ и 1 е. а. Taq-полимеразы. Для идентификации нормального аллеля использовали прямой праймер 5'-GGCAC-CATTA-AAGAA-AATAT-CATCT-T-3'. Для идентификации аллеля с делецией использовали прямой праймер 5'-GGCAC-CATTA-AAGAA-AATAT-CATTG-G-3', без CTT, строго гомологичный соответствующему участку мутантного аллеля. В качестве обратного праймера для амплификации обоих аллелей использовали олигонуклеотид 5'-CATTC-ACAGT-AGCTT-ACCCA-3'. Режим амплификации: денатурация при 95^o - 4 мин, затем 35 циклов, каждый из которых состоял из денатурации - 0,8 мин при 95^o; отжига - 1 мин при 58^o и синтеза - 1 мин при 72^o. Продукты ПЦР анализировали с помощью электрофореза в 4% полиакриламидном геле с последующим окрашиванием бромистым этидием. На гель наносили 5 мкл амплификата. Электрофорез проводили в течение 30 мин при напряжении 300 В.

Электрофореграмма приведена на фиг. 1. Больной под N 1 оказался гомозиготой по делеции ΔF508 (наличие одной полосы размером 219 п.н. - дорожки 1 и 2). Больной под N 3 оказался гетерозиготой по делеции ΔF508 (наличие полос на нормальный и на мутантный аллели - дорожки 5 и 6). У больных N 2, 4 и 5 мутантный аллель не был выявлен (наличие одной полосы размером 222 п.н. - дорожки 3, 4, 7, 8, 9 и 10).

Пример 2.

Геномную ДНК десяти больных муковисцидозом и их родственников выделяли из периферической крови с использованием протеиназы K и экстракции фенол/хлороформом. Смесь для амплификации объемом 25 мкл содержала 67 мМ трис-HCl, pH 8.4, 10 мМ бета-меркаптоэтанол, 0.01% твин-20, 1 мкг геномной ДНК, по 0.25 мкМ прямого и обратного праймера, по 0.2 мкМ четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов, 1.2 мМ MgCl₂ и 1 е.а. Taq-полимеразы. Для идентификации аллеля ΔF508 использовали прямой праймер 5'-GGCAC-CATTA-AAGAA-AATAT-CATTG-G-3' строго гомологичный соответствующему участку мутантного аллеля. В качестве обратного праймера использовали олигонуклеотид 5'-CATTC-ACAGT-AGCTT-ACCCA-3'. Режим амплификации: денатурация при 95^o - 4 мин, затем 35 циклов, каждый из которых состоял из денатурации - 0,8 мин при 95^o; отжига - 1 мин при 52^o и синтеза - 1 мин при 72^o. Продукты ПЦР анализировали с помощью электрофореза в 4% полиакриламидном геле с последующим окрашиванием бромистым этидием. На гель наносили 5 мкл амплификата. Электрофорез проводили в течение 30 мин при напряжении 300 В. Делеция ΔF508 была обнаружена в 7 образцах, что полностью совпадает с клиническим диагнозом и родословными пациентов.

Использование заявленного способа позволит по сравнению с прототипом:
- повысить точность и надежность диагностики муковисцидоза за счет использования аллельспецифической амплификации геномной ДНК пациента;
- упростить и удешевить известный способ за счет исключения этапа образования гетеродуплексов и применения для анализа продуктов амплификации электрофореза в 4%-ном полиакриламидном геле.

Настоящее изобретение относится к молекулярной биологии и медицине. Предложенный способ заключается в следующем: геномную ДНК выделяют из 5-10 мл периферической крови по стандартной методике с использованием протеиназы К с последующей экстракцией фенол/хлороформом. Для амплификации нормального аллеля используют прямой праймер 5'-GGCAC-CATTA-AAGAA-AATAT-CATCTT-3', оканчивающийся на 3'-конце тринуклеотидом CTT, отсутствующем в мутантном аллеле. Для амплификации аллеля с делецией используют прямой праймер 5'-GGCAC-CATTA-AAGAA-AATAT-CATTG-G-3', без CTT, оканчивающийся последующим за ним тринуклеотидом TGG на 3'-конце. В качестве обратного праймера для амплификации обоих аллелей используют праймер 5'-CATTC-ACAGT-AGCTT-ACCCA-3'. Способ отличается простотой, точностью и повышенной надежностью диагностики. 1 з.п. ф-лы, 1 ил.

1. Способ диагностики муковисцидоза, включающий забор материала от пациента, амплификацию участка гена трансмембранного регуляторного белка муковисцидоза с использованием специфических праймеров, содержащих делецию ΔF508 с последующим анализом продуктов амплификации электрофорезом в полиакриламидном геле, отличающийся тем, что в качестве анализируемого материала используют периферическую кровь пациента, амплификацию осуществляют методом аллельспецифической ПЦР с использованием двух пар праймеров на нормальный и мутантный аллели, при этом для идентификации нормального аллеля используют прямой праймер 5'-GGCAC-CATTA-AAGAA-AATAT-CATCT-T-3', для идентификации мутантного аллеля используют прямой праймер 5'-GGCAC-CATTA-AAGAA-AATAT-CATTG-G-3', а в качестве обратного праймера для идентификации обоих аллелей используют праймер 5'-CATTC-ACAGT-AGCTT-ACCCA-3'. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что для электрофоретического разделения продуктов амплификации используют 4%-ный полиакриламидный гель.