СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ К ГЕМОХРОМАТОЗУ Российский патент 2000 года по МПК C12Q1/68 C12N15/00 C12P19/34 A61K49/00 

Изобретение относится к молекулярной биологии и медицине и может быть использовано для идентификации полиморфных вариантов (мутаций) гена HLA-H (Cys282Tyr и His63Asp), связанных с предрасположенностью человека к гемохроматозу.

Диагностика мутаций до клинических проявлений гемохроматоза позволяет предотвратить развитие заболевания и как следствие цирроза и рака печени. Наибольшую вероятность заболеть гемохроматозом имеют носители мутации Cys282Tyr в гомозиготном состоянии и смешанные гетерозиготы по мутациям Cys282Tyr и His63Asp. Частота данных вариантов гена HLA-H в различных популяциях европеоидов составляет 3-10% для Cys282Tyr и 8-23% для His63Asp, что свидетельствует о необходимости массового обследования населения, относящегося к группам риска по заболеваниям печени.

Известные способы диагностики предрасположенности к гемохроматозу состоят в амплификации участков гена, содержащих места возможного нахождения мутаций, гидролизе амплифицированной ДНК нуклеазой, сайт рестрикции которой совмещен с местом расположения конкретной мутации, и в последующем электрофорезе гидролизованной ДНК. Иными словами, детекция полиморфных вариантов включает анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) продуктов полимеразной цепной реакции (ПЦР) двух участков ДНК гена HLA-H, содержащих места возможного нахождения мутаций Cys282Tyr и His63Asp.

Известные способы различаются наборами пар праймеров к двум амплифицируемым участкам гена HLA-H, используемыми в анализе рестриктазами и условиями проведения электрофореза. От подбора праймеров, рестриктаз и условий проведения ПЦР и электрофореза зависит однозначность трактовки данных ПДРФ-анализа.

Известен, например, способ диагностики гемохроматоза с использованием для гидролиза амплификатов рестриктаз SnaBI и BclI с последующим электрофорезом в агарозном геле (J.Hepatol., 1997 27(5): 773-779). При использовании данного способа невозможно четко различить гетерозигот и гомозигот по мутации Cys282Tyr, а также гетерозигот и носителей нормального аллеля по мутации His63Asp в случае неполного гидролиза амплификатов рестриктазами. Это может привести к неверному определению генотипа пациента и как следствие к неправильной постановке диагноза. Поэтому при использовании данного способа необходима дополнительная проверка сомнительных случаев (повторное проведение анализов).

Наиболее близким к заявляемому способу является способ диагностики гемохроматоза путем гидролиза амплификатов двумя рестриктазами: RsaI и SnaBI для мутации Cys282Tyr, BclI и MboI - для мутации His63Asp - прототип (Tissue Antigens 1998 51(3) 270-275). Это снижает вероятность ошибки, но делает способ более громоздким и дорогостоящим.

Технической задачей изобретения является упрощение способа и повышение точности диагностики.

Поставленная техническая задача достигается предлагаемым способом, заключающемся в следующем.

Для выявления мутации Cys282Tyr проводят амплификацию соответствующего участка ДНК с парой праймеров: 5'-CTACC-CCCAG-AACAT-CACCA-3' и 5'CTCCA-ATGAC-TAGGG-TGCCA-3', комплиментарных последовательностям ДНК анализируемого гена в позициях 6586-6567 и 6941-6960 в режиме 95^oC - 3 мин, затем в течение 35 циклов: 94^oC - 1 мин, 50^oC - 1 мин, 72^oC - 1,1 мин. Амплифицированную ДНК размером 394 н.п. гидролизуют рестриктазой RsaI. Наиболее распространенный аллель гена HLA-H в связи с присутствием единственного сайта рестрикции RsaI расщепляется на два фрагмента длиной 126 и 268 н.п. Редкий аллель с мутацией Cys282Tyr имеет дополнительный сайт рестрикции и расщепляется поэтому на три фрагмента: 29, 126 и 239 н.п. Существенные различия в длинах рестрикционных фрагментов позволяют четко дифференцировать все аллельные состояния гена HLA-H по этому участку.

Для выявления мутации His63Asp амплификацию соответствующего фрагмента проводят с парой праймеров: 5'-CCCTC-TCCAC-ATACC-CTTGC-TG-3' и 5'-AAGCT-TTGGG-CTACG-TGGAT-GATCA-G-3', комплиментарных участкам 4929-4907 и 4717-4743 гена HLA-H с неспаренным нуклеотидом в позиции 4740 в режиме 95^oC - 3 мин, затем в течение 35 циклов: 94^oC - 1 мин, 55^oC - 1 мин, 72^oC - 1 мин. Во второй из вышеназванных праймеров введена замена C на T в позиции 4740 для формирования дополнительного сайта рестрикции Ksp221. Далее амплифицированную ДНК размером 212 н.п. гидролизуют рестриктазой Ksp221. Наиболее распространенный аллель гена HLA-H содержит два сайта рестрикции и расщепляется на фрагменты длиной 20, 21 и 171 н.п. Аллель, несущий мутацию His63Asp, имеет только один сайт рестрикции за счет искусственной замены в позиции 4740 в праймере и расщепляется на фрагменты 20 и 192 н.п., что позволяет выявить его электрофоретически. Наличие при электрофорезе полос ДНК большего размера говорит о неполном расщеплении фрагмента рестриктазой.

Определяющим существенным отличием заявляемого способа по сравнению с прототипом является следующее:
- для выявления мутации Cys282Tyr проводят амплификацию соответствующего участка ДНК с использованием праймеров 5'-CTACC-CCCAG-AACAT-CACCA-3' и 5'-CTCCA-ATGAC-TAGGG-TGCCA-3' с последующим гидролизом амплифицированной ДНК рестриктазой RsaI, а для выявления мутации His63Asp проводят амплификацию соответствующего участка ДНК с использованием праймеров 5'-CCCTC-TCCAC-ATACC-CTTGC-TG-3' и 5'-AAGCT-TTGGG-CTACG-TGGAT- GATCA-G-3' с последующим гидролизом амплифицированной ДНК рестриктазой Ksp221, что позволяет упростить способ и одновременно повысить точность диагностики за счет четкой дифференцировки аллельных состояний гена HLA-H;
- анализ продуктов гидролиза амплификатов проводят в полиакриламидном геле, что позволяет получать четкую картину разделения фрагментов ДНК, образующихся после рестрикции.

При таком способе выявления мутации Cys282Tyr после обработки рестриктазой в случае гомозиготы по нормальному аллелю получаются два фрагмента ДНК длиной 126 и 268 н.п., в случае гомозиготы по мутации - три фрагмента длиной 29, 126 и 239 н.п., а в случае гетерозиготы - четыре фрагмента длиной 29, 126, 239 и 268 н.п. В случае неполного расщепления первоначального фрагмента ДНК рестриктазой возникают фрагменты большей длины.

При выявлении мутации His63Asp после обработки рестриктазой в случае гомозиготы по нормальному аллелю возникают три фрагмента ДНК длиной 20, 21 и 171 н.п., в случае гомозиготы по мутации - два фрагмента длиной 20 и 192 н. п. , а в случае гетерозиготы по данной мутации - четыре фрагмента длиной 20, 21, 171 и 192 н.п. В случае неполного расщепления первоначального фрагмента ДНК рестриктазой возникают фрагменты большей длины.

Таким образом, большую вероятность заболеть гемохроматозом имеют пациенты, при анализе ДНК которых на мутацию Cys282Tyr в картине электрофореза присутствуют только полосы длиной 29 (возможно невидимая), 126 и 239 н.п. (четко различаемые) при любом результате анализа на мутацию His63Asp, и пациенты, при анализе ДНК которых на мутацию Cys282Tyr в картине электрофореза присутствуют полосы 29 (возможно невидимая), 126, 239 и 268 н.п. (четко различаемые), а при анализе ДНК на мутацию His63Asp - полосы 20, 21 (возможно невидимые), 171 и 192 н.п. (четко различаемые).

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.

Для выявления мутации Cys282Tyr гена HLA-H проводят ПЦР с 1 мкг геномной ДНК в режиме 95^oC - 3 мин, затем в течение 35 циклов: 94^oC - 1 мин, 50^oC - 1 мин, 72^oC - 1,1 мин в буфере, содержащем 0,067М трис-HCl, 1,8 мМ MgCl₂, β-меркаптоэтанол, 0,01% твин 20, в присутствии 0,2 мМ дезоксинуклеозидтрифосфатов и 1 ед. Taq- полимеразы с использованием пары праймеров 5'-CTACC-CCCAG-AACAT-CACCA-3' и 5'CTCCA-ATGAC-TAGGG-TGCCA-3' в концентрации 0,6 мкМ. Амплифицированные фрагменты ДНК длиной 394 н.п. осаждают с помощью равного объема раствора полиэтиленгликоля 6000 в 2,5М NaCl, собирают центрифугированием, промывают 75%-ным этиловым спиртом, растворяют в воде и гидролизуют ферментом рестрикции RsaI. Длину продуктов рестрикции оценивают после электрофореза в 4%-ном полиакриламидном геле с последующей окраской бромистым этидием и фотографированием в ультрафиолете. Фрагменты длиной 29 н.п. в рассмотрение не принимают из-за небольшой величины. В результате этого в случае гомозиготы по нормальному аллелю были четко видны полосы ДНК длиной 126 и 268 н.п. (фиг. 1, б), в случае гомозиготы по мутации Cys282Tyr - 126 и 239 н.п. (фиг. 1, в), а в случае гетерозиготы по данной мутации - 126, 239 и 268 н. п. (фиг. 1, а). Отсутствие полос ДНК большей длины служило контролем полноты расщепления фрагмента рестриктазой.

Для выявления мутации His63Asp используют 1 мкг геномной ДНК. Реакционную смесь, содержащую 0,067М трис-HCl, 1,8 мМ MgCl₂, 10 мМ β-меркаптоэтанол, 0,01% твин 20, 0,2 мМ дезоксинуклеозидтрифосфаты, 0,6 мкМ праймеры 5'-CCCTC-TCCAC-ATACC-CTTGC-TG-3' и 5'-AAGCT-TTGGG-CTACG-TGGAT-GATCA-G-3', прогревают при 95^oC в течение 3 мин, в процессе этого в раствор добавляют 1 ед. Taq-полимеразы, после чего сразу же проводят ПЦР в режиме 94^oC - 1 мин, 55^oC - 1 мин, 72^oC - 1 мин в течение 35 циклов. Продукт ПЦР длиной 212 н.п. осаждают с помощью равного объема раствора полиэтиленгликоля 6000 в 2,5М NaCl, собирают центрифугированием, промывают 75%-ным этиловым спиртом, растворяют в воде и обрабатывают ферментом рестрикции Ksp221. Длину продуктов рестрикции оценивают после электрофореза в 4%-ном полиакриламидном геле с последующей окраской бромистым этидием и фотографированием в ультрафиолете. Фрагменты длиной 20 и 21 н.п. в рассмотрение не принимают из-за небольшой величины. В результате этого гомозиготы по нормальному аллелю четко идентифицировались по полосе длиной 171 н.п. (фиг.2, а), гомозиготы по мутации His63Asp - по полосе 192 н.п. (фиг.2, в). Гетерозиготы характеризовались наличием двух полос - 171 и 192 н.п. (фиг.2, б). Отсутствие полос ДНК большей длины служит контролем полноты расщепления фрагмента рестриктазой.

При клинических испытаниях предлагаемого способа диагностики были обследованы 32 здоровых человека и 5 пациентов с клиническими признаками гемохроматоза. В результате этого среди пациентов с гемохроматозом был обнаружен один носитель мутации Cys282Tyr в гомозиготном состоянии и две смешанные гетерозиготы по мутациям Cys282Tyr и His63Asp, среди здоровых ни одного носителя таких генотипов выявлено не было.

Использование предлагаемого способа позволит по сравнению с прототипом:
- повысить точность диагностики за счет однозначной дифференцировки различных аллельных состояний гена HLA-H,
- упростить способ за счет использования меньшего количества ферментов рестрикции, и, следовательно, меньшего количества стадий в анализе.

Изобретение относится к биотехнологии, молекулярной биологии и медицине. Способ заключается в детекции полиморфных вариантов гена HLA-H (Cys282Tyr и His63Asp) методом полиморфизма длины рестрикционных фрагментов с использованием праймеров, фланкирующих участки гена, где локализованы соответствующие мутации с интродукцией в случае мутации His63Asp в один из праймеров сайта рестрикции нуклеазы Ksp221 для четкой дифференциации гомо- и гетерозиготных генотипов. Способ состоит в амплификации участков ДНК гена HLA-H, содержащих места возможного нахождения мутаций Cys282Tyr и His63Asp, с праймерами 5'CTACC-CCCAG-AACAT-CACCA-3' и 5'CTCCA-ATGAC-TAGGG-TGCCA-3' в случае мутации Cys282Tyr и праймерами 5'-CCCTC-TCCAC-ATACC-CTTGC-TG-3- и 5'-AAGCT-TTGGG-CTACG-TGGAT-GATCA-G-3' в случае мутации His63Asp с последующим гидролизом первого из вышеназванных амплификатов рестриктазой Rsal, а второго - рестриктазой Ksp221, при этом анализ продуктов гидролиза амплификатов проводят в полиакриламидном геле. Способ отличается простотой и точностью диагностики и позволяет подвергать скринингу большие массивы образцов ДНК для распознавания лиц, предрасположенных к гемохроматозу. Диагностика данного заболевания до органического поражения внутренних органов позволяет успешно его лечить, предотвращая таким образом развитие цирроза и рака печени. 2 ил.

Способ диагностики предрасположенности к гемохроматозу путем электрофоретического анализа длин рестрикционных фрагментов продуктов амплификации двух участков ДНК гена HLA-H, содержащих места возможного нахождения мутаций Cys282Tyr и His63Asp, отличающийся тем, что при амплификации участка, содержащего место возможного нахождения мутации Cys282Tyr, используют праймеры- 5'-CTACC-CCCAG-AACAT-CACCA-3' и 5'CTCCA-ATGAC-TAGGG-TGCCA-3', а при амплификации участка, содержащего место возможного нахождения мутации His63Asp-праймеры- 5'- CCCTC-TCCAC-ATACC-CTTGC-TG-3' и 5'-AAGCT-TTGGG-CTACG-TGGAT-GATCA-G-3' с интродуцированным в одном из них сайтом рестрикции Rsp221, с последующим гидролизом первого из вышеназванных амплификатов рестриктазой Rsal, а второго - рестриктазой Ksp221, при этом анализ продуктов гидролиза амплификатов проводят в полиакриламидном геле.