СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АЛЛЕЛЕЙ ГЕНА ХЕМОКИНОВОГО РЕЦЕПТОРА CCR2 ПО ПОЛИМОРФНОМУ САЙТУ V64I Российский патент 2002 года по МПК C12Q1/68 

Изобретение относится к молекулярной биологии и медицине и может быть использовано для быстрого и массового определения аллелей и генотипов гена хемокинового рецептора CCR2 по полиморфизму V64I.

Полиморфизм гена хемокинового рецептора CCR2, обусловленный заменой G на А в 190-й позиции кодирующей части, приводящей соответственно к замене валина (V) на изолейцин (I) в 64-й позиции полипептида (обозначаемый как CCR2 64I), широко изучен в связи с генетически обусловленными различиями в развитии симптомов СПИД после заражения вирусом ВИЧ. Популяционная частота более редкого аллеля CCR2 64I для европеоидов составляет 9,8%, афроамериканцев - 15,1%, монголоидов - 25% (Smith et al., Science, 1997, v.277, p.959-964). Анализ генетических ассоциаций показал, что у ВИЧ-инфицированных индивидуумов, несущих аллель CCR2 64I, развитие симптомов СПИД задерживается на 2-4 года по сравнению с нормой. Имеются работы по ассоциации этого аллеля с сахарным диабетом (Szalai С et al., Pediatr Res, 1999, v.46(1), р.82-4) и астмой (Romano-Spica et al., Amer J Hum Genet., 2000, v.67(4), p.238).

Все известные способы выявления аллелей гена CCR2 основаны на использовании ПЦР в сочетании с анализом полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (Michael et al., Nature Med, 1997, v.3(10), р.1160-1162; Smith et al., Nature Med, 1997, v.3, p.1052-1053) либо на использовании анализа конформационного полиморфизма одноцепочечной ДНК (SSCP) или секвенирования (Smith et al., Science, 1997, v.277, р.959-964).

Наиболее близким к заявляемому способу (прототипом) является способ, основанный на двухэтапной процедуре амплификации ДНК с последующим расщеплением амплифицированного фрагмента рестриктазой BsaBI (Michael et al., Nature Med, 1997, v.3(10), p.1160-1162). В данном способе используют праймер, содержащий замену для генерации искусственного сайта рестрикции, отсутствующего в нуклеотидной последовательности гена CCR2.

Режим амплификации в прототипе: 94^oС в течение 4 мин, затем 5 циклов 30 с при 94^oС, 30 с при 65^oС, 30 с при 72^oС, затем 21 цикл 30 с при 94^oС, 30 с при 65^oС с последующим понижением температуры на 0,5^oС в каждом цикле до 55^oС, 30 с при 72^oС, затем 15 циклов 30 с при 94^oС, 30 с при 55^oС, 30 с при 72^oС, затем прогрев 10 мин при 72^oС. Амплификация с праймерами CCR2B-forward 5'-TTGTGGGCAACATGaTGG-3' (позиции 170-187) и CCR2B-reverse 5'-GAGCCCACAATGGGAGAGTA-3' (позиции 335-352) приводит к наработке фрагмента размером 183 п. н. Здесь и далее нумерация соответствует последовательности кДНК CCR2 из GenBank ( U03882), в которой отсчет идет от аденина инициирующего кодона трансляции. Выделенный аденин в первом праймере (см. выше) указывает на произведенную искусственную замену С на А (поз. 184 в кДНК), что в случае редкого аллеля, у которого в поз. 190 вместо G находится А, ведет к синтезу и амплификации фрагмента ДНК с сайтом рестрикции для эндонуклеазы BsaBI (GA¹⁸⁴TNN^ NNA¹⁹⁰TC). При добавлении рестриктазы BsaBI к ПЦР-продукту в случае аллеля CCR2 64I происходит расщепление ДНК с образованием двух фрагментов различной длины, 165 и 18 п.н., а в случае распространенного аллеля CCR2 64V этого не наблюдается. Таким образом, в результате электрофоретического анализа ДНК в 4% агарозе от генотипов, гомозиготных по распространенному аллелю (CCR2 64V), идентифицируется только полоса, соответствующая фрагменту ДНК длиной 183 п.н.; от гомозигот по редкому аллелю (CCR2 64I) - две полосы - 165 и 18 п.н., а от гетерозигот - три полосы - 183, 165 и 18 п.н.

К недостаткам метода следует отнести: возможность ошибочного генотипирования гомозигот и гетерозигот по редкому аллелю CCR2 64I в случае неполного расщепления амплифицированного фрагмента ДНК рестриктазой BsaBI; необходимость проведения большого числа циклов амплификации для визуализации при электрофорезе фрагментов ДНК; усложненный температурный профиль ПЦР, обусловленный неполным соответствием структуры праймера нуклеотидной последовательности гена; относительная трудоемкость анализа и, наконец, необходимость применения рестриктазы, что существенно удорожает анализ.

Технической задачей предлагаемого изобретения является повышение точности и надежности выявления аллельных вариантов и генотипов CCR2, упрощение и удешевление анализа для массового использования в клинических лабораториях.

Предлагаемый способ заключается в следующем:
Геномную ДНК из крови выделяют из 5-10 мл периферической крови по стандартной методике с использованием протеиназы К с последующей экстракцией фенол/хлороформом (Смит К., Клко С., Кантор Ч. В сб. Анализ генома. Под ред. К. Дейвиса. , М. : Мир, 1990. С.58-94). Для амплификации распространенного аллеля (CCR2 64V) с G в 190-й позиции используют прямой праймер 5'-TGCGCAGTTTATTAAGATGAGGTC-3' (позиции 213-190) с цитозином на 3' конце. Для амплификации более редкого аллеля (CCR2 64I) с А в 190-й позиции прямой праймер имеет структуру 5'-TGCGCAGTTTATTAAGATGAGGCT-3' (позиции 213-190) с тимином на 3' конце. В качестве обратного праймера для амплификации обоих аллелей используют праймер 5'-GTGTGGTCATCATTTTGTTCTTTG-3'.

Используемый режим амплификации включает стадии: начальную денатурацию при 95^oС в течение 5 мин, затем 32 цикла - с денатурацией в течение 1 мин при 95^oС; отжигом в течение 0,9 мин при 55^oС и синтезом в течение 1,2 мин при 72^oС. Продукты ПЦР анализируют электрофорезом в 4% полиакриламидном геле с последующим окрашиванием бромистым этидием.

Определение аллелей гена CCR2 проводят по наличию или отсутствию в геле фрагмента размером 296 п.н. В случае, если фрагмент выявляется при амплификации ДНК с обеими парами праймеров, это свидетельствует о присутствии обеих аллелей в генотипе индивида. Следовательно, носитель образца ДНК - гетерозигота. Амплификация фрагмента только с одной парой праймеров и отсутствие амплификата при использовании другой пары свидетельствует о гомозиготном состоянии по соответствующему аллелю.

С помощью предлагаемого способа обследованы 93 русских и 20 якутов. В результате среди русских выявлены 19 гетерозиготных и 1 гомозиготный по аллелю CCR2 64I индивидуум. У якутов число гетеро- и гомозигот составляет 9 и 1 соответственно. Частота редкого аллеля для европеоидов (русские) составляет 11,3%, для монголоидов (якуты) - 27,5%.

Определяющим существенным отличием заявляемого способа по сравнению с прототипом является то, что в прототипе проводят стандартную амплификацию ДНК с использованием пары праймеров, фланкирующих интересующий фрагмент. В заявляемом способе используют другой подход - аллель-специфическую амплификацию. При таком анализе амплификацию проводят в двух параллельных пробах: в одной - в качестве прямого праймера используют олигонуклеотид с концевым нуклеотидом (Т), комплиментарным аденину (А) в 190 позиции редкого аллеля гена (CCR2 64I), а в другой - праймер с концевой дезоксицитидиловой кислотой (С), комплиментарной гуанину (G) в 190 позиции распространенного аллеля (CCR2 64V). Такой подход позволяет значительно увеличить точность и надежность выявления соответствующих аллелей гена CCR2 и упростить процедуру анализа продуктов амплификации. Кроме того, в заявляемом способе отсутствует этап обработки рестриктазой амплифицированного фрагмента ДНК. Это снижает вероятность субъективной ошибки при интерпретации результатов генотипирования, поскольку идентификации подлежит одна полоса, а не несколько, как имеет место быть в случае прототипа.

Изобретение иллюстрируется следующим примером конкретного выполнения.

Геномную ДНК трех индивидуумов выделяли из периферической крови с использованием протеиназы К и экстракции фенол/хлороформом. Смесь для амплификации объемом 25 мкл содержала: 67мМ Трис-HCl, рН 8,8, 50 мМ КСl, 98мМ β-меркаптоэтанол, 0,01% Tween-20, 0,5 мкг тотальной ДНК, по 0,5 мкМ прямого и обратного праймера, 0,2 мМ каждого из четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов, 1,5мМ MgCl₂, 10% глицерин и 1,25 е.а. Taq-полимеразы. Для идентификации распространенного аллеля (CCR2 64V) использовали прямой праймер 5'-TGCGCAGTTTATTAAGATGAGGTC-3'. Для идентификации редкого аллеля (CCR2 64I) использовали прямой праймер 5'-TGCGCAGTTTATTAAGATGAGGCT-3'. В качестве обратного праймера для амплификации обоих аллелей использовали олигонуклеотид 5'-GTGTGGTCATCATTTTGTTCTTTG-3'. Режим амплификации: начальная денатурация при 95^oС - 5 мин, затем 32 цикла, каждый из которых состоял из денатурации - 1 мин при 95^oС; отжига - 0,9 мин при 55^oС и синтеза - 1,2 мин при 72^oС. Продукты ПЦР анализировали с помощью электрофореза в 4% полиакриламидном геле с последующим окрашиванием бромистым этидием. На гель наносили 5 мкл амплификата. Электрофорез проводили в течение 30 мин при напряжении 300 В.

Электрофореграмма приведена на фиг. 1. Образец 1 взят от индивидуума, гомозиготного по аллелю 64V/64V. На это указывает наличие фрагмента ДНК размером 296 п.н. только на одной из пары дорожек в случае амплификации фрагмента ДНК CCR2 с парой праймеров, один из которых имеет 3'-концевой нуклеотид, комплиментарный гуанину в поз.190 распространенного аллеля (CCR2 64V) - (дорожки 1 и 2). Образец 2 принадлежит индивидууму с гетерозиготным генотипом 64V/64I (фрагмент размером 296 п.н. выявляется при амплификации с обоими парами праймеров - дорожки 3 и 4 соответственно). Образец 3 получен от индивидуума, гомозиготного по аллелю 64I/64I. На это указывает наличие фрагмента только при амплификации с той парой праймеров, где прямой имеет 3'-концевой нуклеотид, комплиментарный аденину в позиции 190 редкого аллеля (CCR2 64I) (дорожки 5 и 6).

Правильность определения генотипов заявляемым способом была подтверждена независимо с помощью полимеразной цепной реакции и гидролиза продукта ПЦР рестриктазой Bse8 I (СибЭнзим, Новосибирск, изошизомер рестриктазы BsaBI) по способу, взятому в качестве прототипа (Smith et al., Science 1997, v.277, р. 959-965), а также с помощью прямого секвенирования (фиг.2). Из фиг.2 видно, что результаты анализа, выполненного заявляемым способом и с помощью прямого секвенирования, полностью совпадают.

Изобретение относится к области молекулярной биологии и может быть использовано в медицине при диагностике ряда заболеваний. Для определения полиморфизма гена хемокинового рецептора из исследуемого образца выделяют ДНК, которую затем подвергают амплификации методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием аллельспецифических праймеров. Для идентификации распространенного аллеля CCR2 64V используют прямой праймер 5'-TGCGCATTTATTAAGATGAGGTC-3'; для идентификации редкого аллеля CCR2 64I применяют прямой праймер 5'-TGCGCAGTTTATTAAGATGAGGCT-3'; обратным праймером в обоих случаях служит последовательность 5'-GTGTGGTCATCATTTTGTTCTTTG-3'. О наличии в образце аллелей гена CCR2 судят по появлению в геле после электрофореза амплифицированной ДНК фрагмента размером 296 п.н.; при этом выявление названного фрагмента после амплификации ДНК с обеими парами праймеров свидетельствует о присутствии обоих аллелей, тогда как амплификация фрагмента только с одной из пар праймеров - о наличии одного соответствующего ей аллеля CCR2. Изобретение обеспечивает возможность налаживания высокоточного, простого и дешевого анализа вариантов гена хемокинового рецептора, пригодного для массового использования в клинической лаборатории. 2 ил.

Способ определения аллелей гена хемокинового рецептора CCR2 по полиморфному сайту V64I, включающий забор материала от пациента, амплификацию фрагмента гена CCR2 с использованием пары праймеров, отличающийся тем, что амплификацию осуществляют методом аллельспецифической ПЦР с использованием двух пар праймеров, при этом для идентификации распространенного аллеля CCR2 64V используют прямой праймер 5'-TGCGCAGTTTATTAAGATGAGGTC-3', для идентификации редкого аллеля CCR2 64I используют прямой праймер 5'-TGCGCAGTTTATTAAGATGAGGCT-3', а в качестве обратного праймера для идентификации обоих аллелей используют праймер 5'-GTGTGGTCATCATTTTGTTCTTTG-3'.