СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ К ИНФАРКТУ МИОКАРДА У МУЖЧИН Российский патент 2002 года по МПК C12Q1/68 

Изобретение относится к молекулярной биологии и медицине и может быть использовано для выявления лиц с генетически детерминированным высоким риском развития инфаркта миокарда в европеоидной популяции.

Инфаркт миокарда является одним из наиболее распространенных сердечно-сосудистых заболеваний в промышленно-развитых странах, характеризующимся высокими уровнями смертности и инвалидизации населения. По данным эпидемиологических обследований на каждую 1000 мужчин в возрасте старше 40 лет возникают от 2.6 до 15.9 случаев инфаркта миокарда в течение одного года. В г. Новосибирске (Россия) по данным регистра инфаркта миокарда (программа ВОЗ МОНИКА) в 1996 г. заболеваемость инфарктом миокарда у мужчин в возрасте 55-64 лет составила 16.9 случаев на 1000 человек, а смертность 526.1 на 100 000 человек (Гафаров В. В. Терапевтический архив, 2000, т.72, стр.15-21). Повышенный риск развития инфаркта миокарда связывают с высокими уровнями общего холестерина, холестерина липопротеидов низкой плотности, низким уровнем холестерина липопротеидов высокой плотности, систолической артериальной гипертензией, наличием сахарного диабета, избыточной массой тела, курением, системной воспалительной реакцией и целым рядом других факторов (Wood D. European Heart Journal, 1998, v.19 (Supplement А), р.А12-А19; Ross R. N. Engl. J. Med., 1998, v.340, p.115-126). Обнаружена также независимая связь риска развития заболевания с наследственной отягощенностью по ишемической болезни сердца. Известные биохимические, физиологические, клинические, антропологические и в том числе молекулярно-генетические маркеры наследственной предрасположенности к сердечно-сосудистым заболеваниям оказываются недостаточно эффективными для оценки индивидуального риска возникновения данного заболевания и адресного применения профилактических мер.

Известен, например, способ выявления наследственной предрасположенности к инфаркту миокарда, основанный на генотипировании инсерционно-делеционного полиморфизма в гене ангиотензинпревращающего фермента (АСЕ). Относительный риск развития заболевания при обнаружении генотипа DD составляет 1.34 (95% доверительный интервал - 1.05-1.70) (Cambien F. et al. Nature, 1992, v.359, p.641-644). Другой известный способ заключается в выявлении аллельных вариантов гена АпоЕ. Для индивидов, в генотипе которых содержится аллель АпоЕ4, риск развития заболевания составляет 1.33 после стандартизации на возраст и биохимические показатели (Luc G. et al. Arteriosclerosis and Thrombosis, 1994, v.14, р.1412-1418).

Основным недостатком известных способов является низкая корреляция наличия полиморфного маркера с риском развития инфаркта миокарда и как следствие низкая точность анализа. Так, в результате обследования больших выборок ассоциация полиморфизма гена АСЕ с инфарктом миокарда вообще не выявляется (Keanvey В. et al. The Lancet, 2000, v.355, р.434-442).

Наиболее близким к заявляемому способу - прототипом является способ диагностики генетической предрасположенности к инфаркту миокарда на основе определения генотипов гена активатора плазминогена тканевого типа t-PA (Патент WO 9707240, кл. C 12 Q 1/68, опубл. 27.02.97). Способ апробирован на 162 пациентах, перенесших инфаркт миокарда, и контрольной группе из 258 здоровых людей. Обнаружено, что относительный риск развития заболевания в случае гомозиготного генотипа по инсерционному аллелю гена возрастает в 2.04 раза по сравнению с гомозиготами по делеционному аллелю.

Недостатком способа является низкая величина оценки относительного риска для разных генотипов гена t-PA и, следовательно, недостаточная точность диагностики генетической предрасположенности к инфаркту миокарда. Это ограничивает возможности его использования в клинической и профилактической медицине.

Технической задачей изобретения является повышение точности диагностики наследственной предрасположенности к инфаркту миокарда.

Сущность предлагаемого изобретения состоит в выявлении генотипов геномного локуса 3q21, содержащего аллель гена CCR2 с заменой G на А в 190-й позиции кодирующей части, приводящей, соответственно, к замене V на I в 64-й позиции аминокислотной последовательности белка (CCR2 64I) и оценке на этой основе риска возникновения инфаркта миокарда у индивида. Для этого на первом этапе выделяют ДНК индивида с помощью любой из известных методик. Далее проводят выявление генотипов гена CCR2 по полиморфизму V64I с помощью любого из известных методов анализа вариабельности структуры нуклеиновых кислот - рестрикционного анализа, секвенирования, анализа SSCP, гибридизации с олигонуклеотидами и др. В зависимости от результата молекулярно-генетического анализа оценивают относительный риск заболевания у индивида. Определение генетически детерминированного риска возникновения инфаркта миокарда, обусловленного наличием в генотипе аллеля CCR2 64I, может быть выполнено в любом возрасте, начиная с пренатального периода.

Апробацию предлагаемого способа проводили на мужчинах с острым инфарктом миокарда (n=69 человек) и нестабильной стенокардией (n=3) из трех кардиологических отделений муниципальных стационаров г. Новосибирска. Для сопоставления была сформирована контрольная группа мужчин (n=113) без инфаркта миокарда в анамнезе и не имеющих изменений ЭКГ-покоя, соответствующих категории I Миннессотского кода, или стенокардии напряжения по анкете Роуза. Частоты генотипов в контрольной группе составили 87.6% (n=99), 12.4% (n=14) и 0% для генотипов 64V/64V, 64V/64I и 64I/64I соответственно (частота аллеля CCR2 64I - 6.2%). В группе лиц, перенесших инфаркт миокарда, частоты генотипов составили 44.4% (n=32), 52.8% (n=38) и 2.8% (n=2) соответственно (частота аллеля CCR2 64I - 29.2%). У лиц мужского пола, имеющих в генотипе аллель CCR2 64I, относительный риск возникновения инфаркта миокарда выше, чем у индивидов, у которых данный аллель отсутствует, приблизительно в 8.8 раза (95% CI - 4.3-18.3).

Определяющим отличием представленного на рассмотрение способа по сравнению с прототипом является то, что предлагается оценивать риск развития инфаркта миокарда в связи с полиморфизмом гена CCR2 V64I, который ранее не рассматривался в качестве гена-кандидата для этого заболевания. Ни в прототипе, ни в работах, посвященных изучению роли гена CCR2 в патогенезе сосудистых заболеваний, ни в исследованиях его полиморфизма, не рассматривалась ассоциация полиморфизма V64I гена CCR2 с инфарктом миокарда и, соответственно, не предлагалось его использование для выявления наследственной предрасположенности к этому заболеванию. Величина относительного риска инфаркта миокарда, определяемая в случае наличия в генотипе аллеля 64I гена CCR2 (8.8), существенно выше, чем приводимая в прототипе для различных генотипов гена t-PA (2.04). Данная оценка относительного риска является одной из самых высоких для полиморфизма всех известных генов, участвующих в формировании предрасположенности к мультифакториальным заболеваниям. Преимуществом заявляемого способа является также то обстоятельство, что наличие аллеля 64I гена хемокинового рецептора CCR2 в генотипе в гетеро- или гомозиготном состоянии регистрируется более чем у 55.6% больных. Это обстоятельство свидетельствует о том, что с помощью предложенного способа можно выявить значительную часть мужчин, предрасположенных к заболеванию инфарктом миокарда до развития заболевания.

Обнаруженная ассоциация согласуется с известными литературными данными об участии хемокинового рецептора CCR2 в патогенезе атеросклероза. Известно, что отсутствие функционально активного гена CCR2 приводит к снижению выраженности экспериментально индуцированного атеросклероза у мышей, дефицитных по апопротеину Е, что свидетельствует о важной роли гена CCR2 в формировании и эволюции атеросклеротических поражений сосудистой стенки (Boring L. et al. Nature, 1998, v.394, р.894-897). Анализируемый полиморфизм гена CCR2 V64I, широко изучен только в связи с генетически обусловленными различиями в скорости развития AIDS (Smith М. W. et al. Science, 1997, v.277, р.959-964), а также в связи с предрасположенностью к сахарному диабету (Szalai С. et al. Pediatr Res, 1999, v.46(1), р.82-4) и бронхиальной астме (Romano-Spica et al. Amer J Hum Genet., 2000, v.67(4), p.238). Ни в одной из этих работ не упоминается, что аллель CCR2 64I может быть ассоциирован с развитием инфаркта миокарда у человека.

Изобретение иллюстрируется следующим примером конкретного выполнения.

Определение частот генотипов гена CCR2 по полиморфизму V64I проводили в группе мужчин с инфарктом миокарда и нестабильной стенокардией и выборке мужчин из открытой популяции г. Новосибирска. Диагноз острого инфаркта миокарда ставился на основе типичной клинической картины, характеристических изменений ЭКГ-покоя и диагностического повышения уровня креатинфосфокиназы сыворотки крови. Нестабильную стенокардию диагностировали на основании типичной клинической картины. Всего было обследовано 173 мужчины с инфарктом миокарда и с нестабильной стенокардией. Для сопоставления была использована описанная выше контрольная группа мужчин (n=113) без инфаркта миокарда в анамнезе и не имеющих изменений ЭКГ-покоя, соответствующих категории I Миннессотского кода, или стенокардии напряжения по анкете Роуза.

Генотипирование гена CCR2 по полиморфизму V64I проводили с помощью полимеразной цепной реакции и гидролиза продукта ПЦР рестриктазой Bse8 I (Smith et al. Science, 1997, v. 277, p. 959-965). Геномную ДНК выделяли из периферической крови с использованием протеиназы К и экстракции фенол/хлороформом (Смит К., Клко С., Кантор Ч. В сб. Анализ генома. Под ред. К. Дейвиса., М.: Мир, 1990, стр.58-94). Смесь для амплификации объемом 25 мкл содержала: 67мМ трис-HCl, рН 8.8, 98мМ β-меркаптоэтанол, 0,01% Tween-20, 0.5 мкг тотальной ДНК, 0.6 мкМ каждого праймера, 100 мкМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата, 3.0 мМ MgCl₂ и 1 е.а. Taq-полимеразы. В качестве прямого праймера использовали олигонуклеотид 5'-TTGTGGGCAACATGATGG-3', в качестве обратного 5'-GAGCCCACAATGGGAGAGTA-3'.

Режим амплификации: 94^oС в течение 4 мин, затем 5 циклов 30 сек при 94^oС, 30 сек при 65^oС, 30 сек при 72^oС, затем 21 цикл 30 сек при 94^oС, 30 сек при 65^oС с последующим понижением температуры на 0.5^oС в каждом цикле до 55^oС, 30 сек при 72^oС, затем 15 циклов 30 сек при 94^oС, 30 сек при 55^oС, 30 сек при 72^oС, затем прогрев 10 мин при 72^oС. После амплификации реакционную смесь обрабатывали 3 ед. рестриктазы Bse8 I (СибЭнзим, Новосибирск) (изошизомер рестриктазы BsaBI) 4 часа при 60^oС. Продукты рестрикции анализировали с помощью электрофореза в 4% полиакриламидном геле с последующим окрашиванием бромистым этидием. На гель наносили 5 мкл амплификата. Электрофорез проводили в течение 30 мин при напряжении 300 В. В случае гомозиготного генотипа 64V/64V наблюдали один фрагмент размером 183 п.н. В случае гомозиготного генотипа 64I/64I наблюдали один фрагмент размером 165 п.н. (фрагмент размером 18 п.н. не выявляли). При гетерозиготном генотипе 64V/64I наблюдали два фрагмента размером 183 и 165 п.н. Данные генотипирования подтверждали прямым секвенированием нескольких образцов.

Оценки различий частот генотипов по критерию хи-квадрат и определение относительного риска инфаркта миокарда для разных генотипических классов в рамках бинарной логистической регрессионной модели проводили с помощью пакета программ прикладного статистического анализа SPSS 9.0. Результаты представлены в таблице.

Из таблицы следует, что в контрольной группе частота аллеля 64I составила 6.2%. У мужчин с инфарктом миокарда или нестабильной стенокардией отмечается резкое увеличение частоты редкого аллеля CCR2 64I по сравнению с контролем. Гетеро- или гомозиготный генотип по аллелю 64I имели 67.1% больных мужчин, в то время как в контрольной группе мужчины с этими генотипами составили только 12.4%. Различия в частотах генотипов между группой больных и контролем статистически высоко достоверны (χ²=81,7, р<0.0001). Относительное увеличение частот генотипов, содержащих аллель 64I, у больных инфарктом миокарда по сравнению с популяционной выборкой старшего возраста и контролем составляет 5.12. Формальная оценка относительного риска инфаркта миокарда и нестабильной стенокардии для генотипов с аллелем 64I по сравнению с гомозиготным генотипом V64/V64 составила 14.4 (дов. интервал - 7.6-27.4).

Итак, предложенный способ позволяет значительно увеличить точность диагностики генетической предрасположенности к инфаркту миокарда у мужчин. Заявленный способ распространяется также на другие аллели, генотипы и гаплотипы локуса 3q21, сцепленные с аллелем 64I гена CCR2.

Изобретение относится к области медицины, в частности к кардиологии. Способ обеспечивает повышение точности диагностики генетической предрасположенности к инфаркту миокарда у мужчин. Выявляют генотипы геномного локуса, содержащего аллель гена, при этом у исследуемых пациентов проводят генотипирование полиморфизма V64I гена CCR2 и при выявлении генотипа геномного локуса 3q21, содержащего аллель гена хемокинового рецептора CCR2 с заменой G наА в 190-й позиции кодирующей части, приводящей к замене V на I в 64-й позиции аминокислотной последовательности белка CCR2 641, диагностируют генетическую предрасположенность к инфаркту миокарда у мужчин. 1 табл.

Способ диагностики генетической предрасположенности к инфаркту миокарда у мужчин, включающий выявление генотипов геномного локуса, содержащего аллель гена, отличающийся тем, что у исследуемых пациентов проводят генотипирование полиморфизма V64I гена CCR2 и при выявлении генотипа геномного локуса 3q21, содержащего аллель гена хемокинового рецептора CCR2 с заменой G на А в 190-й позиции кодирующей части, приводящей к замене V на I в 64-й позиции аминокислотной последовательности белка CCR2 641, диагностируют генетическую предрасположенность к инфаркту миокарда у мужчин.