КОМПОЗИЦИЯ АМИНОКИСЛОТ С МИКРОЭЛЕМЕНТАМИ И КАЛЬЦИЕМ, ОБЛАДАЮЩАЯ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ, АНТИДЕПРЕССИВНОЙ И ПРОТИВОАРИТМИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 2000 года по МПК A61K31/197 A61K33/24 

Изобретение относится к новым составам химических композиций, а именно композиции десяти природных аминокислот с четырьмя микроэлементами и кальцием, которая обладает противоопухолевой, антидепрессивной и антиаритмической активностью и может найти применение в медицине.

Сведения о противоопухолевой, антиаритмической и антидепрессивной активности композиций природных аминокислот с микроэлементами и кальцием в доступной литературе отсутствуют. Нами получено решение о выдаче патента на изобретение по заявке N 94025068/14 "Композиция аминокислот с микроэлементами, обладающая противоопухолевой и антигипоксической активностью" с приоритетом от 04.07.1994 г.

Цель изобретения - изыскание новых малотоксичных композиций природных аминокислот с микроэлементами и кальцием, обладающих противоопухолевой, антидепрессивной и противоаритмической активностью.

Цель достигается разработкой оптимальных составов и методики приготовления водных растворов природных аминокислот с микроэлементами и кальцием, проявляющих противоопухолевую, антидепрессивную и антиаритмическую активность.

Состав композиции представлен в табл. 1.

Пример 1. В стерилизованную мерную колбу помещают навески десяти аминокислот: 1.00 г/л валина, 4.40 г/л лейцина, 2.90 г/л изолейцина, 4.40 г/л фенилаланина, 1.00 г/л триптофана, 1.25 г/л лизина гидрохлорида, 4.40 г/л метионина, 14.2 г/л гистидина, 28.6 г/л серина, 28.6 г/л глутаминовой кислоты, а также навеску 8.40 г/л моногидрата гидроксида лития как первого микроэлемента. Навески растворяют в добавленной дистиллированной воде при нагревании. После охлаждения прибавляют растворы солей трех микроэлементов: 1.6•10^-3 моль/л марганца(II) дихлорида, 1.5•10^-5 моль/л кобальта(II) дихлорида, 3.7•10^-4 моль/л меди(II) дихлорида, - а также 2.1•10^-3 моль/л кальция дихлорида. Значения pH среды поддерживают в диапазоне 6.7-7.0 добавками растворов HCl или LiOH. Объем полученного раствора доводят до метки дистиллированной водой. Приготовленный раствор фильтруют в стерилизованную посуду. Композиция стабильна при хранении в герметичных условиях.

В ходе фармако-токсикологических исследований определены параметры острой токсичности предлагаемой композиции аминокислот с микроэлементами и кальцием, ее острое цитотоксическое и антипролиферативное действие на опухолевые клетки в опытах in vitro, оценена противоопухолевая, антидепрессивная и антиаритмическая активность в опытах in vivo.

Пример 2. Параметры острой токсичности предлагаемой композиции аминокислот с микроэлементами и кальцием определяли при однократном внутрибрюшинном введении водных растворов на 50 белых нелинейных мышах обоего пола средней массой 23±2 г. Наблюдение за животными вели в течение двух недель. Средняя смертельная доза DL₅₀ устанавливалась методом Беренса, ее средняя ошибка - по формуле Геддама [1].

Введение мышам токсико-летальных доз композиции аминокислот с микроэлементами и кальцием вызывало общее угнетение, снижение двигательной активности, гипотермию, птоз, усиление диуреза и дефекации, нарушение дыхания и гиперкинезы. Гибель наступала в течение первых суток от угнетения дыхания. Параметры острой токсичности для мышей представлены в табл. 2.

По классификации Сидорова [5] композиция аминокислот с микроэлементами и кальцием относится к V классу токсичности и практически нетоксична, так как средняя смертельная доза ее при внутрибрюшинном введении составляет 3000 мг/кг. Определить среднюю смертельную дозу композиции для крыс при внутрибрюшинном введении не представлялось возможным, так как введение раствора в максимальном объеме и концентрации, соответствующих дозе 972 мг/кг, вызывало гибель одного животного из шести.

Таким образом, судя по параметрам острой токсичности, композиция аминокислот с микроэлементами и кальцием значительно менее токсична, чем многие противоопухолевые препараты (табл.2).

Пример 3. Оценку цитотоксического действия композиции аминокислот с микроэлементами и кальцием проводили на клетках асцитной опухоли Эрлиха мышей и асцитной опухоли яичника крыс в опытах in vitro [6]. Результаты исследований представлены в табл. 3.

После 4-х часового контакта опухолевых клеток с предлагаемой композиций в концентрации 1.90 мкг/мл индекс поврежденных клеток составил 1.84, в концентрации 0.19 мкг/мл - 1.42 (табл.3). На опухолевые клетки асцита яичника композиция оказывала цитотоксическое воздействие в более высокой концентрации 9.50 мкг/мл (индекс поврежденных клеток составил 1.43). После 9-часового контакта опухолевых клеток с композицией процент поврежденных клеток в опыте статистически не отличался от показателя контроля.

Таким образом, композиция аминокислот с микроэлементами и кальцием оказывает прямое цитотоксическое действие на опухолевые клетки.

Пример 4. Оценку чувствительности опухолевых клеток человека к воздействию предлагаемой композиции проводили по антипролиферативному тесту. Опухолевые клетки, полученные от больной раком яичника IV стадии, инкубировали с предлагаемой композицией в концентрациях от 1000 до 5000 мкг/мл в течение 72 ч и определяли включение в них меченого ³H-тимидина по учету связанной радиоактивности на счетчике Microbeta Plus. 1450 фирмы Wallac (Finland). Результаты представлены в процентах угнетения синтеза ДНК в опухолевых клетках в сравнении с контрольными пробами (см. чертеж). Предлагаемая композиция вызывает нарушения в процессе репликации ДНК в высоких концентрациях.

Пример 5. Противоопухолевая активность композиции аминокислот с микроэлементами и кальцием оценена на 100 мышах линии CBWA обоего пола с перевивной солидной и асцитной опухолью Эрлиха. Лечение животных с солидной опухолью начинали на 5 сутки после перевивки опухоли, а с асцитной - через сутки. Композицию вводили внутрибрюшинно в дозе, соответствующей 1/5 Dl₅₀, так же как и препараты сравнения, за исключением комплексного соединения меди(II), которое вводилось в дозе, соответствующей 1/3 ДМТ, ежедневно в течение 7 дней. Об антибластомной активности судили по проценту торможения роста опухоли. Результаты представлены в табл.4.

Установлено, что предлагаемая композиция аминокислот с микроэлементами и кальцием проявляет противоопухолевую активность в отношении солидной формы штамма опухоли Эрлиха (% торможения - 44). Эта опухоль малочувствительна к цитостатикам и вообще не чувствительна к глицинато-L-серинату меди (II). Пять мышей из 13 с асцитной опухолью Эрлиха, получавших композицию, были излечены, а рост опухоли тормозился на 79.6% (P<0.05, табл.4).

В использованной дозе и режиме введения предлагаемая композиция не оказывала общетоксического действия, коэффициент прироста массы тела леченых животных составил +7.46, тогда как препарат сравнения (N 9, табл.4) проявлял существенное общетоксическое действие, которое выражалось в уменьшении массы тела на 40% (К_p = - 40).

Пример 6. Антидепрессивную активность предлагаемой композиции оценивали по уменьшению времени иммобилизации мышей в поведенческом плавательном тесте Порсолта [7] . Результаты экспериментов представлены в табл.5. Композиция, введенная в дозах, соответствующих 1/50 и 1/5 от DL₅₀, достоверно не влияла на время иммобилизации мышей в течение 6 мин, но активирующий эффект проявлялся при повторном введении в течение 7 дней, при этом время иммобилизации укорачивалось на 63.6%, что сопоставимо с эффектом препарата сравнения имипрамина при пятидневном введении последнего (табл. 5).

Пример 7. Антиаритмическую активность предлагаемой смеси аминокислот с микроэлементами и кальцием исследовали на скрининговой модели нарушений сердечного ритма у кошек, возникающих в результате окклюзии коронарной артерии и последующей ее реперфузии [9,10]. Эксперименты проведены на 42 кошках массой 1.8-4.0 кг, наркотизированных внутрибрюшинно этаминалом натрия в дозе 50 мг/кг. Животных переводили на искусственное дыхание с помощью аппарата РО-2, вскрывали грудную клетку в IV межреберье слева и под нисходящую ветвь левой коронарной артерии в верхней трети подводили лигатуру, концы которой пропускали через полиэтиленовую трубку и подтягивали, вызывая тем самым окклюзию коронарной артерии. Через 30 мин после окклюзии, ослабив лигатуру, восстанавливали кровообращение и продолжали наблюдение в течение 10 мин. ЭКГ регистрировали во II стандартном отведении на протяжении всего опыта. В качестве препаратов сравнения использовали эталонные противоаритмические средства тримекаин и обзидан. Предлагаемая композиция и препараты сравнения вводили внутривенно сразу после окклюзии коронарной артерии.

Антиаритмическую активность оценивали по частоте развития нарушений сердечного ритма, характеру аритмий (желудочковая экстрасистолия, желудочковая тахикардия, фибрилляция желудочков), латентному периоду нарушений сердечного ритма и их длительности, частоте эктопических сокращений.

Как видно из данных, представленных в табл. 6, композиция аминокислот с микроэлементами и кальцием в дозе 150 мг/кг на модели реперфузионных аритмий достоверно снижала частоту развития аритмий на 33% и частоту эктопических сокращений на 62%, а также сокращала продолжительность аритмий. По эффективности композиция аминокислот сопоставима с эталонным антиаритмическим средством тримекаином и превосходит обзидан.

Таким образом, предлагаемая композиция аминокислот с микроэлементами практически нетоксична и проявляет противоопухолевую, антидепрессивную и антиаритмическую активность, сопоставимую или превосходящую эталонные препараты.

Список литературы
1. Беленький М.Л. Элементы количественной оценки фармакологического эффекта. - Л.: Медгиз, 1963, - 152 с.

2. Булкина З.П. Противоопухолевые препараты: Справочник. - Киев: Наукова думка, 1978, - 167 с.

3. Трещалина Е.М., Коновалова А.Л., Преснов М.А. и др. Противоопухолевые свойства смешанных координационных соединений меди (II) с аминокислотами// Докл. АН СССР. - 1979. - Т. 248, N 5. С.1273 - 1276.

4. Мартынова И. Л. , Оборотова Н.Л., Кикоть Б.С. и др. Предклиническое исследование нового противоопухолевого препарата Cu-2// Мат. Российского нац. конгресса "Человек и лекарство". - М., 1995. - С.201.

5. Измеров Н.Ф., Саноцкий И.В., Сидоров К.К. Параметры токсиметрии промышленных ядов при однократном воздействии. - М.: Медицина, 1977. - С.196 - 197.

6. Айземан Б.Е., Мандрик Г.П., Швайгер И.О. и др. Быстрый метод выявления in vitro поврежденных и мертвых клеток карциномы Эрлиха // Антибиотики. - 1960. - N 3. - С.97 - 98.

7. Porsolt P.D., Berlin A., Talere M. Behavioural despair in mice: screening test for antidepressants// Arch. Int. Pharmacodyn. Ther. - 1977. - Vol. 229, No 2. - P.327 - 336.

8. Машковский М.Д., Глушков В.И., Шведов В.И. и др. Новый антидепрессант тетриндол // Эксперим. и клин. фармакол. - 1993. - Т.56. - С.3 - 6.

9. Сторожук Б.Г. Противофибрилляторная активность некоторых противоаритмических средств при максимально высокой перевязке коронарной артерии и ее реперфузии у кошек// Фармакология и токсикология. - 1985. - N 3. - С.47 - 49.

10. Manning A. Reperfusion-induced arrhythmias: the major factor derming// J. Mol. Cell. Card. - 1986. - P.49 - 53.

Изобретение относится к новым составам химических композиций, а именно к композиции десяти природных аминокислот с четырьмя микроэлементами и кальцием, которая обладает противоопухолевой, антидепрессивной и антиаритмической активностью и может найти применение в медицине. Композиция состоит из десяти природных аминокислот с четырьмя микроэлементами и кальцием, обладающей противоопухолевой, антидепрессивной и антиаритмической активностью, содержащей 1,00 г/л валина, 4,40 г/л лейцина, 2,90 г/л изолейцина, 4,40 г/л фенилаланина, 1,00 г/л триптофана, 1,25 г/л лизина гидрохлорида, 4,40 г/л метионина, 14,2 г/л гистидина, 28,6 серина, 29,8 г/л глутамата лития, 1,6•10^-3 моль/л марганца (II) дихлорида, 1,5•10^-5 моль/л кобальта (II) дихлорида, 3,7•10^-4 моль/л меди (II) дихлорида, 2,1•10^-3 моль/л кальция дихлорида и дистиллированную воду. Композиция аминокислот с микроэлементами и кальцием является практически нетоксичной, проявляет антибластомную и антидепрессивную активность и обладает противоаритимическим действием. 6 табл., 1 ил.

Композиция десяти природных аминокислот с четырьмя микроэлементами и кальцием, обладающая противоопухолевой, антидепрессивной и антиаритмической активностью, содержащая 1,00 г/л валина, 4,40 г/л лейцина, 2,90 г/л изолейцина, 4,40 г/л фенилаланина, 1,00 г/л триптофана, 1,25 г/л лизина гидрохлорида, 4,40 г/л метионина, 14,2 г/л гистидина, 28,6 г/л серина, 29,8 г/л глутамата лития, 1,6 • 10^-3 моль/л марганца (II) дихлорида, 1,5 • 10^-5 моль/л кобальта (II) дихлорида, 3,7 • 10^-4 моль/л меди (II) дихлорида, 2,1 • 10^-3 моль/л кальция дихлорида и дистиллированную воду.