СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ ЛЕЙКОПОЭЗСТИМУЛИРУЮЩИМ, ИММУНОМОДУЛИРУЮЩИМ И АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫМ ДЕЙСТВИЕМ Российский патент 2000 года по МПК C07F15/06 A61K31/4164 A61P7/06 A61P37/02 A61P31/04 

Предлагаемое изобретение относится к медицине и касается применения нового лекарственного средства тетра-(1-винилимидазол)кобальтдихлорида (кобазол) в медицинской практике в качестве гемостимулятора широкого спектра действия. Название "кобазол" присвоено в соответствии ВФС на субстанцию (N 42-28-86-97) и лекформу (N 42-28-87-97) препарата.

Известны стимуляторы кроветворения природного происхождения - цианокобаламин (витамин B₁₂), фолиевая кислота (витамин B_C) (В.Г. Беликов "Фармацевтическая химия", М., 1985), а также различные препараты на их основе - витогепат, кобамамид, гемостимулин (М.Д. Машковский "Лекарственные средства", Вильнюс, 1993). Однако получение цианокобаламина из печени животных трудоемко и неэкономично. В то же время химический синтез фолиевой кислоты и микробиологический метод получения витамина B₁₂ являются многостадийными дорогостоящими процессами.

Широко используются синтетические лекарственные препараты, способствующие купированию анемии. Это прежде всего препараты, содержащие железо, которые применяются в виде солей и комплексов органических и неорганических кислот (М.Д. Машковский "Лекарственные средства", Вильнюс, 1993). Среди препаратов, в состав которых входит кобальт, наиболее известен коамид (там же). Основными недостатками синтетических противоанемических препаратов являются побочные реакции, плохая растворимость в воде, высокая токсичность, биологически неактивные лиганды (в случае комплексных соединений), а также многостадийный, трудоемкий и экономически невыгодный синтез.

Целью предлагаемого изобретения является создание и применение лекарственного средства, являющегося эффективным стимулятором кроветворения широкого спектра действия, повышающим общую неспецифическую сопротивляемость организма человека и животных.

Поставленная цель достигается с учетом того факта, что кобазол в дозе 1-2 мл 2%-ного водного раствора, обладая хорошей переносимостью, является эффективным стимулятором кроветворения.

Сущность предлагаемого изобретения в том, что новый лекарственный препарат - кобазол - в дозе 20-40 мг (1-2 мл 2%-ного водного раствора) обладает высокой активностью для купирования постгеморрагических, гипохромных, гипотактических анемий, в том числе анемий, резистентных к препаратам железа, а также лейкопений различного генеза при общих лучевых и химических поражениях. Кроме того, кобазол обладает иммуномодулирующим действием и выраженными антибактериальными свойствами.

В качестве субстанции для лекарственного средства предлагается использовать кобазол тетра-(1-винилимидазол)кобальтдихлорид следующей формулы:

где четыре молекулы 1-винилимидазола соединены с одной молекулой дихлорида кобальта донорно-акцепторными связями. Кобазол легко растворяется в воде, умеренно токсичен. Способ получения кобазола (с выходом до 99%) прост, одностадиен и основан на взаимодействии 1-винилимидазола с дихлоридом кобальта в среде органического растворителя при комнатной температуре

В ИК спектре тетра-(1-винилимидазол)кобальтдихлорида наблюдается смещение частот валентных колебаний гетероцикла в коротковолновую область спектра: 1465 ---> 1500, 1511 ---> 1522 см^-1. Сохраняется поглощение винильной группы с частотой 1650 см^-1.

Пример 1. Способ получения тетра-(1-винилимидазол)кобальт-дихлорида (кобазола).

К раствору 14,3 г (0,11 моль) дихлорида кобальта прибавляют 4 г (0,44 моль) 1-винилимидазола. Выделяют 5,36 г (99%) сиреневого порошка с т. пл. 164^oC.

Найдено, %: C 47,75; H 4,97; Cl 14,10; N 21,93.

C₂₀H₂₄Cl₂CoN₈.

Вычислено, %: C 47,44; H 4,78; Cl 14,02; N 22,14.

Лекарственная форма кобазола (2%-ный водный раствор, ампулы 1 мл) изготовлена по технологии стерильной фильтрации и асептического разлива. Нами разработаны проекты временных фармакопейных статей на субстанцию (ВФС-42-28-86-97) и лекформу (ВФС-42-28-87-97) препарата.

В научно-технической литературе отсутствуют сведения о гемостимулирующем, иммуномодулирующем и антибактериальном действии лекарственного средства кобазол, а также какие-либо сведения о его действии на человека. Препарат по структуре, эффективности и спектру действия не имеет аналогов в отечественной и зарубежной медицине.

По данным полного доклинического изучения безопасности кобазола в медицинских учреждениях Москвы (НПО "Биотехнология", МЦ "Потенциал"), Уфы (Башкирский медицинский институт) установлено, что препарат является умеренно токсичным соединением (LD₅₀ 215 мг/кг). Хронический эксперимент (6 месяцев) токсического действия кобазола на собаках свидетельствует об отсутствии его влияния на функции внутренних органов (печень, почки, селезенка, сердце, легкие, поджелудочная и щитовидная железы), морфологические и гистологические исследования которых не обнаружили отличий от органов животных в контроле. Кобазол не обладает тератогенным и мутагенным эффектами, не кумулируется в организме.

Изучение фармакокинетики кобазола показало, что кобазол, обладая хорошей растворимостью в воде, достаточно быстро проникает в органы и ткани, проходит через гематоэнцефалический барьер, быстро элиминируется из организма, биодоступность его составляет 100%. После одноразового внутримышечного введения в дозе 10 мг/кг препарат быстро проникает в кровь, печень, почки, сердце, селезенку, легкие и костный мозг, при этом максимальная концентрация в этих органах наблюдается через 0,4-1,3 ч после введения. Наибольшая концентрация - в костном мозге (в 1,42 раза выше, чем в крови). В мозге, почках, легких, сердце концентрация кобазола в 1,3-1,8 раза ниже, чем в крови. Время полувыведения кобазола из органов и тканей равно 3,1-4,4 ч, что близко к времени полувыведения из крови (~3,9 ч).

Биологические (доклинические) испытания кобазола как гемостимулятора проводились на белых беспородных крысах самцах массой 170-180 г с анемией, вызванной ежедневным двукратным внутрибрюшинным введением 1%-ного раствора фенилгидразина в дозе 30 мг/кг. В 8-й серии опытов 18 крыс были разбиты на 3 группы по 6 животных. Лечение проводилось в 1-й группе кобазолом в дозе 10 мкг/кг массы, который вводился внутримышечно два раза в неделю, начиная со следующего дня после последнего введения фенилгидразина, всего 6 раз в течение опыта; во второй группе - цианкобаламином в той же дозе 10 мкг/кг, вводимым также 2 раза в неделю в те же сроки. Третья группа была контрольной.

На 4-й день наблюдения число эритроцитов у контрольной группы животных достоверно снизилось (P < 0,001). В группе животных, получавших витамин B₁₂, также наблюдалось снижение числа эритроцитов (P < 0,001). В группе животных, леченных кобазолом, число эритроцитов оставалось аналогичным исходным данным (P > 0,5), и при сравнении с контролем значительно выше (P < 0,05). Уровень гемоглобина по сравнению с исходными данными снизился в контрольной группе животных (P < 0,01). У животных, леченных витамином B₁₂, уровень гемоглобина также снизился (P < 0,05). В группе животных, леченных кобазолом, гемоглобин остался в пределах исходного, значительно выше, чем в контрольной группе (P < 0,01), и выше, чем в группе, леченных витамином B₁₂.

На 7-й день опыта во всех группах наблюдалось снижение количества гемоглобина и числа эритроцитов по сравнению с исходными данными. Число же лейкоцитов было аналогично исходным показателям. В группе животных, леченных кобазолом, количество гемоглобина снизилось на 28% по отношению к исходному, а число эритроцитов - на 37%. Снижение количества гемоглобина и эритроцитов в группе животных, принимавших витамин B₁₂, составило 35 и 49% по отношению к исходному. В контрольной группе - 36 и 47% соответственно. Таким образом, снижение числа эритроцитов в группе животных, леченных кобазолом, было меньше, чем в группе животных, принимавших витамин B₁₂ (P < 0,0001), и у контрольных животных (P < 0,05). Снижение числа эритроцитов в группе животных, леченных витамином B₁₂, аналогично контрольной группе животных (P > 0,5).

На 12-й день наблюдений во всех группах отмечалось повышение уровня гемоглобина и числа эритроцитов. В группе животных, леченных кобазолом, уровень гемоглобина был значительно выше, чем в контрольной группе (P < 0,05), и в группе животных, леченных витамином B₁₂ (P < 0,05). В группе животных, леченных кобазолом, количество гемоглобина на 5% ниже исходного, а в группе животных, принимавших витамин B₁₂, - на 15,4%. Число эритроцитов в крови крыс, леченных кобазолом, было значительно выше, чем в контрольной группе (P < 0,001), и в группе, леченной витамином B₁₂ (P < 0,001), и было ниже исходного на 10,5%. В эти сроки число эритроцитов в группах животных, леченных витамином B₁₂ и контрольной, было ниже исходного на 30%.

На 21-й день наблюдения в группе животных, леченных кобазолом, уровень гемоглобина повысился значительно больше, чем в контрольной (P < 0,05). В эти же сроки у животных, леченных витамином B₁₂, количество гемоглобина также почти достигло исходного уровня и было ниже на 5,6%. Число эритроцитов в крови крыс, получавших кобазол, на 21-й день достигло исходных данных и было выше числа эритроцитов в группе животных, принимавших витамин B₁₂ (P < 0,002) и в контрольной (P < 0,001). В группе животных, леченных витамином B₁₂, число эритроцитов также было выше, чем в контроле (P < 0,05), но не достигло исходных данных на 10%. Влияние кобазола и витамина B₁₂ в дозах 10 мкг/кг на течение анемии, количество гемоглобина и число эритроцитов в периферической крови крыс представлено в табл. 1 и на фиг. 1 и 2.

Изучение влияния кобазола на течение анемии, вызванной облучением, проводилось в опытах на белых крысах при однократном облучении в дозе 800 P. Животные были разбиты на 3 группы. Первая группа - контрольная, животным 2-й группы еженедельно, начиная с 1-го дня облучения, вводился внутримышечно кобазол в дозе 15 мг/кг, всего 5 раз. Третьей группе животных вводился раствор витамина B₁₂ в дозе 10 мкг/кг массы.

Изучение основных гематологических показателей крови животных (табл. 2) показало, что у животных, леченных кобазолом, они падали до менее низких цифр и на протяжении более короткого времени. Возрастание же показателей начиналось раньше и проходило более интенсивно, т.е. их восстановление наступало в более короткие сроки. При анализе изменений количества лейкоцитов (фиг. 3) выяснено, что наибольшее снижение их происходит на 6-е сутки, причем у животных, получавших кобазол, это снижение было достоверно более низким, чем у животных, леченных витамином B₁₂, и в контрольной группе. Возрастание количества лейкоцитов начиналось на 12-е сутки, а на 18-й день в группе, леченной кобазолом, было достоверно выше, чем в других группах. К концу месяца на 19% ниже исходного уровня, тогда как показатели лейкоцитов в крови животных контрольной группы и леченных витамином B₁₂ оставались к аналогичному сроку сравнительно более низкими (на 30-26% соответственно). Уровень гемоглобина (фиг. 4) у облученных животных, получавших кобазол, падал до 12 суток, а в других группах - до 18 суток после облучения. При этом во все сроки количество гемоглобина у животных, леченных кобазолом, оставалось достоверно более высоким, и восстановление показателей гемоглобина шло более интенсивно и на всех сроках, чем у животных других групп. В группе животных, получавших витамин B₁₂, восстановление уровня гемоглобина началось с 24-го дня лечения и к 31-м суткам был ниже исходного уровня на 15%. К этому сроку наблюдения уровень гемоглобина в контрольной группе был ниже исходного на 18%. (У кобазола в аналогичный период - 8%).

Подобные данные получены и при анализе изменений числа эритроцитов после облучения (фиг. 5). Падение числа эритроцитов продолжалось до 18 суток. Но у животных, леченных кобазолом, это падение было сравнительно небольшим, и на 24-e сутки восстанавливалось почти до исходного уровня, тогда как в двух других группах восстановление проходило очень медленно, и через месяц в группе животных, принимавших витамин B₁₂, число эритроцитов было ниже исходного на 13,6%.

Лейкоцитарная формула (табл. 3) изменилась не резко, и изменения ее у всех групп были почти аналогичными, хотя в контрольной группе несколько более резко увеличивалось количество нейтрофилов (и соответственно уменьшались лимфоциты), и к концу месяца до исходного уровня не уменьшалось.

Полученные данные позволяют считать, что при лучевой болезни кобазол более эффективен как стимулятор эритро- и лейкопоэза.

Антибактериальные свойства кобазола определялись при исследовании влияния препарата на рост бактерий: протей, кишечная палочка, клебсиелла пневмонии, стафилококк и синегнойная палочка (15 чашек по 6 дисков). Проводилось сравнение действия кобазола с активностью тетрациклина и стрептомицина. Показано, что кобазол в дозе 10 мкг задерживает рост стафилококка аналогично тетрациклину и в 2 раза активнее стрептомицина (табл. 4). В дозе 30 мкг кобазол задерживает рост протея, клебсиеллы, синегнойной палочки подобно стрептомицину, уступая ему лишь в активности по отношению к кишечной палочке. По действию же на стафилококк кобазол оказывает в 3 раза большую активность, чем стрептомицин. В той же дозе (30 мкг) кобазол превосходит по своему действию тетрациклин по отношению к протею, клебсиелле, синегнойной палочке и в 1,5 раза в действии на стафилококк (табл. 5).

Таким образом, полученные предварительные результаты испытаний явились предпосылкой для дальнейшего изучения препарата. В соответствии с решением Фармакологического комитета МЗ РФ (протокол N 2 от 27.01.94 г.) проведены клинические испытания на переносимость и эффективность препарата кобазол на базах гинекологических отделений Ангарского онкологического диспансера МЗ РФ и Иркутского городского лечебно-диагностического центра акушерства, гинекологии и перинатологии. Препарат исследован в лекарственной форме для инъекций - 2%-ный водный раствор, ампулы по 1 мл.

Пример 2. Изготовление лекарственной формы кобазола.

Лекформа препарата кобазол, субстанция которого получена в ИрИХ СО РАН в соответствии ВФС-42-28-86-97, изготовлена по технологии стерильной фильтрации и асептического разлива. Навеску субстанции препарата кобазол в виде сиреневого порошка для получения 2%-ного раствора растворяют в дистиллированной воде. Приготовленный раствор препарата розового цвета и прозрачный согласно проекту ВФС на лекформу кобазола (ВФС-42-28-87-97). Стерилизующую фильтрацию раствора кобазола проводят через фильтр "Миллипор" (диаметр пор 0,22 мкм), вмонтированный в специальную катушку, подсоединенную к фильтрационной установке под давлением очищенного азота. После тщательной фильтрации (раствор 4 раза профильтровывают) систему шлангов с фильтром отсоединяют от склянки с раствором и присоединяют к стерильной бюретке для разлива. Разлив препарата осуществляется в стерильные и тщательно проверенные на чистоту ампулы объемом 3 мл, которые далее запаиваются. Затем ампулы с лекформой просматриваются на содержание мехпримесей и пригаров на контрольном столе ГФ-42 с целью отбраковки. Паспортизация лекформы кобазола в соответствии ВФС-42-28-87-97 выполнена отделом контроля Иркутского предприятия иммунопрепаратов. Хранение лекарственной формы препарата при 20-30^oC показало, что в течение двух лет она сохраняет все свои физико-химические свойства согласно ВФС на лекформу.

Открытое исследование эффективности кобазола проведено у 50 онкологических и гинекологических больных, имеющих проявления анемии и лейкопении легкой и средней степени тяжести. В исследование включены больные, достигшие возраста 18 лет, давшие устное согласие на участие в клинических испытаниях, не получавшие каких-либо стимуляторов эритро- и лейкопоэза за 7 дней до момента исследования. После включения больного в исследование из схемы лечения полностью исключены гемостимуляторы, препараты железа, преднизалон, препараты крови.

По возрасту больные были распределены следующим образом: от 28 до 30 лет обследованы трое больных (6%); от 31 до 40 лет - 7 (14%); от 42 до 50 лет - 25 (50%); от 51 до 60 лет - 7 (14%); старше 60 лет - 8 (16%).

Изучение эффективности кобазола проведено в следующих группах: 1-я группа - гинекологические больные с постгеморрагической и железодефицитными анемиями, 20 человек; 2-я группа - онкологические больные с лейкопенией различного генеза, 30 человек. Для сравнения эффективности и сроков лечения исследованы контрольные группы: 3-я группа с использованием плацебо, 8 человек, и 4 группа ретроспективных данных при лечении анемии препаратами железа (ферроплекс перроральным, феррумлек - парентеральным путем), 30 человек.

В 1-й группе по степени тяжести анемии (классификация ВОЗ) больные имели: I ст. - у 10 (50%); II ст. - у 9 (45%); III ст. - у 1 (5%). Анемия как осложнение геморрагического синдрома наблюдалась: при миоме матки у 60% больных, при генитальном эндометриозе у 20%, после дисфункциональных маточных кровотечений у 10%, кровотечений при внематочной беременности у 10%.

Во 2-й группе по степени тяжести лейкопении (классификация ВОЗ) больные имели: I ст. - у 17 (56,6%); II ст. - у 10 (33,3%); III ст. - у 3 (10%). Лейкопения как осложнение химиотерапии наблюдалась: при раке яичников - у 50% (I ст. основного заболевания имели 4 больных (13,3%); II ст. - 2 (6,6%); III ст. - 5 (16,6%); IV ст. - 4 (13,3%); при раке молочной железы у - 13,3% (10% больных имели II ст. заболевания, 3,3% - III ст.), при лимфогранулематозе - у 3,3%. Лейкопения как осложнение лучевой терапии установлена при раке шейки матки у 13,3% (6,6% больных имели I ст. заболевания, II и IV ст. - по 3,3%), при раке эндометрия I ст. - у 3,3%. У 6,6% больных кобазол был применен при миоме матки в сочетании с саркомой, у 3,3% - при раке толстого кишечника, у 3,3% - при опухолях серозного гистостроения.

Кобазол применялся в виде 2%-ного водного раствора объемом 2 мл в количестве 5-7 инъекций. Клиническая оценка эффективности кобазола как гемостимулятора проводилась на основании лабораторных данных в течение 72 ч и еженедельно, побочных реакций - с момента инъекций до 2-3-х дней. Лабораторные показатели оценивались по следующим параметрам: полный гематологический анализ (количество эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов, ретикулоцитов, СОЭ, лейкоцитарная формула, уровень гемоглобина, гематокрит), биохимический анализ крови (уровень сывороточного железа, общий билирубин, общий белок, уровни креатинина, мочевины, АЛТ, ACT), показатели гемостаза (фибриноген, протромбиновый индекс), показатели иммунного статуса крови [Т-лимфоциты (хелперы, супрессоры), B-лимфоциты, фагоцитарный индекс, фагоцитарное число, уровни ЦИК, Lg A, М, G].

Пример 3. Исследование эффективности и переносимости препарата кобазол.

Длительность применения препарата составила 1 реже 2 недели в зависимости от исходного уровня гемоглобина во II группе и количества лейкоцитов во II-й. Применение кобазола в течение недели повысило уровень гемоглобина на 5 г/л - у 16,6%, на 10 г/л - у 44,4%, на 15 г/л - у 33,3% больных с анемией. Недельное лечение кобазолом больных с лейкопенией повысило количество лейкоцитов следующим образом: на (1,5-2,0) • 10⁹ - у 13,7% больных; на (2,1-3,0) • 10⁹ - у 55,1%; на (3,1-4,0) • 10⁹ - у 20,6%; на (4,1-5,0%) • 10⁹ - у 10,3%. Таким образом, использование кобазола в течение недели привело к полному выздоровлению 45% больных с анемией и 93,3% с лейкопенией. Для сравнения эффективности и сроков лечения анемического синдрома приведены данные применения препаратов железа (табл. 6). Клинический эффект кобазола получен у 85% больных с анемией и у 96,6% больных лейкопенией. Оценка изменений средних значений гематологических показателей крови в исследуемой и контрольных группах показана в табл. 7.

При анализе недельной динамики изменения уровня гемоглобина в исследуемой группе выявлено увеличение этого показателя на 13 г/л, тогда как в группе больных, пролеченных препаратами железа, уровень гемоглобина возрос на 8 г/л. В группе с плацебо прирост гемоглобина не выявлен (диаграмма).

Данные биохимического анализа показателей крови, а также показателей гемостаза свидетельствуют об отсутствии патологических изменений (колебания находятся в пределах нормальных значений). Изменение уровня сывороточного железа более выражено в контрольной группе (увеличение на 4,32 мкмоль/л), чем в исследуемой - увеличение на 1,13 мкмоль/л (табл. 8). При изучении показателей состояния сердечно-сосудистой системы патологических изменений со стороны артериального давления, частоты сердечных сокращений не выявлено (табл. 9). Побочные реакции средней степени тяжести в виде общей слабости, тошноты, головокружения, локальной гиперемии отмечены у 12% женщин. У одной больной препарат был отменен вследствие индивидуальной непереносимости.

В процессе изучения эффективности кобазола у группы больных (24 человека) проведена оценка иммунологического профиля крови (до и после лечения), так как анемический синдром и неоднократное воздействие на организм цитостатических факторов (химио-, лучевая терапия) приводят к развитию иммунной недостаточности, что подтверждается достоверным уменьшением Т- и В-лимфоцитов.

Пример 4. Исследование иммуномодулирующей активности кобазола.

Применением кобазола было достигнуто сохранение показателей иммунного статуса в пределах нормальных значений, а в ряде случаев отмечено их улучшение (табл. 10). Это подтверждено стойким повышением числа Т-лимфоцитов с 55 до 82-90% у 45,8% больных, В-лимфоцитов с 7,4 до 15% у 37%. У 45,8% женщин отмечено повышение фагоцитарной активности нейтрофилов (ФИ) с 31 до 69%. Применение кобазола сопровождалось снижением уровня циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) на 40% у 50% больных. У 100% женщин отмечено усиление продукции иммуноглобулинов.

Таким образом, результаты испытаний свидетельствуют о ярко выраженной эффективности кобазола в качестве гемостимулятора и позволяют обосновать целесообразность его применения при постгеморрагических, гипохромных анемиях, анемиях, резистентных к препаратам железа, а также при лейкопениях. Иммуномодулирующий эффект и антибактериальные свойства кобазола увеличивают его клиническое значение при лечении анемий и лейкопений.

Средство, содержащее в качестве активного начала кобазол формулы I, обладает лейкопоэзстимулирующим, иммуномодулирующим и антибактериальным действием, является эффективным стимулятором кроветворения широкого спектра действия. 5 ил., 10 табл.

Средство, обладающее лейкопоэзстимулирующим, иммуномодулирующим и антибактериальным действием, содержащее в качестве активного начала тетра-(1-винилимидазол)кобальтдихлорид (кобазол).