БИС-(2-ЭТИЛГЕКСАНОАТО)БИС(ТРИЭТИЛЕНТЕТРАМИН) КОБАЛЬТ (II), ПРОЯВЛЯЮЩИЙ СВОЙСТВА СТИМУЛЯТОРА ГЕМОПОЭЗА Российский патент 1997 года по МПК C07F15/06 

Изобретение относится к координационной химии, конкретно к новому химическому соединению общей формулы:

проявляющему свойства стимулятора гемопоэза. Указанное соединение и его свойства в литературе не описаны.

Известно аналогичного строения

Соединение диакваоксалато(триэтилентетрамин)кобальт (II), образованное взаимодействием кобальта (II) с триэтилентетрамином (ТЭТА) [1]
Известен аналогичного назначения препарат "Коамид", который является комплексным соединением хлористого кобальта с амидом никотиновой кислоты - дихлоробис(никотинамид)кобальт (II) [2]

Он применяется при постгеморрагических, гипохромных анемиях и вызванных лучевым поражением анемиях. Однако эффективность его как стимулятора гемопоэза в ряде случаев недостаточна, а именно:
1. недостаточно быстрая регенерация красного роста костного мозга;
2. в ряде случаев недостаточная степень гемоглобинизации эритроцитов;
3. Слабо выраженное действие при нормализации картины крови после лучевого поражения.

Для решения этой задачи синтезировано новое координационное соединение кобальта бис(2-этилгексаноата)бис(триэтилентетрамин)кобальт (КЭТ-122), общей формулы:

N регистрации 10591294
"КЭТ-122" получают в условиях известного способа [1] путем взаимодействия 2-этилегексаноата кобальта (II) с триэтилентетраамином в среде этанола, после отгонки растворителя, промывки и осушения получают бис(2-этилгексаноато)бис(триэтилентетрамин)кобальт (II) в виде порошка красно-коричневого цвета, с T_пл=84,0^oC, который умеренно растворим в воде, спиртах, ацетоне, плохо в неполярных растворителях. Выход 94,1% Острая токсичность бис(2-этилгексаноато(ди(этилентетрамин) кобальта определялась на крысах по Керберу при внутримышечном введении. (см. табл. 1).

Соединение принадлежат к 3 классу токсичности и является умеренно опасным веществом по классификации К.К.Сидорова [3]
Эритропоэз стимулирующее (ED₅₀) действие соединения КЭТ-122 определялось графически по зависимости "доза-эффект" [4] по изменению количества эритроцитов на 6 и 14 дни после однократного тотального гамма-облучения крыс в дозе 6,0 Гр (⁶⁰Co, мощность дозы 0,45 Гр/мин) (см. табл. 2).

Из данных таблицы следует, что КЭТ-122 вызывает выраженное положение числа эритроцитов уже на 6-ой день (11,9 млн. кл. мм³), тогда как для увеличения данного показателя в группе получавшей "Коамид", требовался более длительный период времени. На 14-ый день число эритроцитов в группе, обработанной "Коамидом", составило 8,5 мол. кл. мм³, в группе, обработанной КЭТ-122 14,1 млн. кл. мм³. В сумме доза введения препаратов "КЭТ-122" и "Коамид" составила 66 и 107 мг/кг, соответственно. При этом соединение КЭТ-122 в 1,7 раз активное коамида, терапевтическая широта более в 3,8.

Влияние соединения КЭТ-122 на течение экспериментальной постгеморрогической анемии исследовалось по изменениям показателей периферической крови: уровню гемоглобина и гематокрита, количеству эритроцитов, ретикулоцитов и лейкоцитов, а также по лейкоцитарной формуле.

Число эритроцитов и лейкоцитов считали в камере Горяева по общепринятой методике. Концентрацию гемоглобина определяли гемоглобин-циамидным методом с помощью стандартных реактивов. Показатель гематокрита определяли в гепаринизированных капиллярах после центрифугирования в МЦГ-8 при 8.000 об/мин 6 мин. Ретикулоциты выявляли в мазках крови, окрашенных суправитально бриллиантовым крезиловым синим, на 1000 эритроцитов. Рассчитывались показатели времени созревания ретикулоцитов в интенсивности эритропоэза [5,6]
Постгеморрагическая анемия воспроизводилась дозированным кровопусканием у крыс из ретроорбительного синуса и подъязычной вены общепринятой методике [7]
Наблюдения велись в 2-х сериях опытов в течение 25 и 35 суток. Сравнения изменения показателей периферической крови проводились относительно значений, наблюдаемых в день после воспроизведения анемии (100%), 1 группа крыс получала соединение КЭТ-122, II-группа препарат коамид, III группа служила контролем. Препараты вводились внутримышечно, через сутки, в течение всего эксперимента в дозах, обозначенных в Примере 3.

Соединение КЭТ-122 способствовало достоверному увеличению уровня гемоглобина во все дни наблюдения относительно влияния коамида и контрольной группы крыс (p<0,001), тогда как в группах 2 и 3 и на 35 сутки данный показатель оставался ниже исходных значений на 15% и 19% соответственно (фиг. 1). Показатель гематокрита под воздействие КЭТ-122 на 7-е (165%) и 15-е (176%) сутки достоверно (p<0,001) превышает значения при введении коамида (149% и 157% на 7-и и 15 сутки, соответственно) и у нелеченных крыс (152% и 168% на 7 и 15 сутки, соответственно). Характер изменения численности эритроидных клеток в кровяном русле после кровопотери соответствует течению данного рода анемий, а именно: снижение числа эритроцитов с последующим их восстановлением и, одновременно, всплеск численности ретикулоцитов со снижением к 14 суткам после анемизации (фиг. 2).

Интенсивность эритропоэза (табл. 3) при введении КЭТ-122 оставалось выше исходного показателя на 7 и 14 дни. Во всех группах отмечалось замедление созревания ретикулоцитов.

Изменение числа лейкоцитов (фиг. 3) носит волнообразный характер с пиком на 14 и 35 сутки эксперимента. Соединение КЭТ-122 способствует достоверному увеличению числа лейкоцитов и содержания нейтрофилов и моноцитов на протяжении всего опыта.

Резкое уменьшение времени созревания ретикулоцитов и повышение интенсивности эритропоэза в группах 2 и 3 к 25-му дню опыта (табл. 3) в сочетании с соответствующими данными по содержанию гемоглобина (фиг. 1), свидетельствуют о неэффективности эритропоэза у животных данных групп, о преобладании незрелых форм клеток красной крови. В то же время, в 1-й группе активизация эритропоэза сопровождается интенсификацией процесса поступления в кровяное русло жизнеспособных эритроцитов (табл. 4).

Таким образом, соединение КЭТ-12 на фоне острой кровопотери стимулирует процесс регенерации кроветворения в более ранние сроки по отношению к коамиду и нелеченной группе крыс.

Влияние соединения КЭТ-122 на стимуляцию эритропоэза исследовалось на модели воспроизведения острой лучевой болезни у крыс при однократном тотальном гамма-облучении в дозе 6,0 Гр (⁶⁰Co, мощность дозы 0,45 Гр/мин) на аппарате "РОКУС-М".

Эффект соединения КЭТ-122 относительно коамида на кроветворение оценивали по изменению показателей периферической крови (уровень гемоглобина, гемотокрит, количество эритроцитов/ ретикулоцитов, лейкоцитов) и костного мозга (эритробластические островки) на 3, 7, 14, 21 и 30 сутки после облучения. Определение вышеобозначенных показателей проводилось по общепринятым методикам, описанным в примере 4.

Количество и морфологическую идентификацию эритробластических островков (ЭО) проводили по методу изолированных ЭО [8, 9, 10]
Соединения вводились в лечебном режиме внутримышечно через день в дозе, равной ЕД₅₀ при однократном введении. Группе 1 животных вводили испытуемое соединение КЭТ-122, группе 2 коамид, 3-я группа крыс служила контролем.

Воздействие ионизирующей радиации на 3-и сутки после облучения вызывала снижение количества лейкоцитов до 2,5 и 3 тыс. кл./мкл в 3-ей и 2-й группах крыс соответственно. Число лейкоцитов в 1 группе составляет 5,5 тыс. кл./мкл (p<0,001). К 30 суткам этот показатель постепенно приближался к исходным значениям (13,9 тыс. кл/мкл) при этом в 1-й группе он был равен 12,1 тыс. кл/мкл, что достоверно выше показателей в сравниваемых группах (p<0,02), во 2-й группе 10,9 тыс. кл/мкл (p>0,5), а в 3-ей группе 8,2 тыс. кл/мкл. При этом действие соединения КЭТ-122 сдерживало снижение лейкоцитов и стимулировало быстрое их восстановление до нормальных показателей. Все показатели красной крови при лечении крыс соединением КЭТ-122 во все сроки наблюдения достоверно превышали таковые во 2-й и 3-й группах животных (p<0,001). При этом в 1-й группе прирост гемоглобина проходил более высокими темпами и уровень его полностью восстанавливался до исходных данных (144 г/л) к 30 суткам (p<0,01), тогда как на этот срок значения во 2-й и 3-ей группах, соответственно, составляют 108 (p<0,02) и 100 г/л. КЭТ-122 предотвращая также падение гематокрита (47%) (p<0,01), относительно исходных значений (44,2%) (3-и сутки). Значения этого показателя во 2-й и 3-й группах на это время составляли соответственно 43 и 41% В течение эксперимента прирост гематокрита в 1 группе превосходил таковой в сравниваемых группах, а на 30 сутки в 1, 2, 3 группах составлял соответственно 54, 52, 3 и 45% Различия в группах 1 и 2 по отношению к контролю достоверны.

Испытуемое соединение предотвращало также снижение числа эритроцитов и ретикулоцитов (фиг. 4, 5) после облучения и способствовало их увеличению в течение наблюдаемого периода. Прирост клеток сопровождался соответствующим увеличением гемоглобина.

Активация эритропоэза при введении соединения КЭТ-122 подтверждалась изменениями, наблюдаемыми в костном мозге крыс. Уже на 3 день после облучения количество эритробластических островков (ЭО) костного мозга в 1-й группе было значительно выше показателя у интактных крыс и достоверно выше такового (p<0,001) у животных 2 и 3 групп (фиг. 6). В контроле отмечалось значительное и стойкое угнетение эритропоэза в течение всего периода наблюдений. Введение коамида сдерживало снижение числа ЭО в первые дни (фиг. 6), но на 30 сутки их число так и не восстановилось.

Сущность поясняется примерами конкретного выполнения.

Пример 1. Получение бис(2-этилгексаноато) бис(триэтилентетрамин)кобальта (II). К раствору в этаноле 3,47 г (0,01 моле) 2-этилгексаноата кобальта (II) добавляют при перемешивании 2,92 г (0,02 моле) триэтилентетрамина, затем при пониж. давлении и t 50 60^oC удаляют растворитель, промывают и сушат полученное вещество. Выход целевого продукта 5,84 г (91,4%) порошка красно-коричневого цвета. Температура плавления 84^oC. Умеренно растворим в воде, спиртах, ацетоне. Плохо в неполярных растворителях.

По данным элементного анализа
Найдено: C 53,01; H 10,24; N 17,42; O не определено, Cо 9,02.

Вычислено, C 52,89; H 10,15; N 17,63; O 10,07; Cо 9,27.

В ИК-спектре синтезированного соединением по сравнению со свободным лигандом наблюдается смещение полосы валентных колебаний аминогруппы с 3300 см^-1 до 3200 см^-1, что подтверждает их участие в образовании комплексного соединения данного лиганда с 2-этилгексаноатом кобальта.

Пример 2. Определение острой токсичности соединения бис-(2-этилгексаноато)ди(этилентетрамин)кобальт (КЭТ-122). Токсичность определялась на крысах по Керберу при внутримышечном введении (табл. 1). Соединение принадлежит к 3-ему классу токсичности и является умеренно опасным веществом.

Пример 3. Определение единицы действия (ЕД₅₀) препарата Величина ЕД₅₀ эритропоэз-стимулирующего действия соединения КЭТ-122 определялась графически по зависимости "доза-эффект" [3] по изменению количества эритроцитов на 6 и 14 дни после однократного тотального гамма-облучения крыс в дозе 6,0 Гр (⁶⁰Co, мощность дозы 0,45 Гр/мин). Подсчет величины ЕД₅₀ проводился по методу Личфильда и Уилкоксона [II] Соединение КЭТ-122 вызывает выраженное повышение числа эритроцитов уже на 6 день (11,9 млн. кл. мм³), на 14 день число эритроцитов составило 14,1 мол. кл. мм³. В сумме доза введения препаратов составила 66 мг/кг.

Пример 4. Определение эффективности КЭТ-122 при постгеморрагической анемии. Исследовалось по изменениям показателей периферической крови: уровнем гемоглобина и гематокрита, количеству эритроцитов, ретикулоцитов, а также лейкоцитов. Постгеморрагическая анемия воспроизводилась дозированным кровопусканием у крыс из ретроорбитального синуса и подъязычной вены. КЭТ-122 вводится внутримышечно, через сутки в течение всего эксперимента в дозах обозначенных в Примере 3. Наблюдение в течение 25 и 35 суток показало достоверное увеличение уровня гемоглобина во все дни наблюдения от 100 до 137 (p<0,001). Показатель гематокрита на 7-е сутки (165%), на 15-е (176%) достоверность (p<0,001).

Характер изменения численности эритроцитарных клеток в кровяном русле после кровопотери соответствует течению данного рода анемии, снижение числа эритроцитов с последующим их восстановлением и одновременный всплеск численности ретикуляцитов со снижением к 14-ым суткам после анемизации.

Интенсивность эритропоэза при введении КЭТ-122 оставалась выше исходного значение (9,0±0,3 г/л сут) на протяжении всего опыта (11,8 г/л сут на 7-ой день 18,1 г/л сут на 25-й день), процесс сопровождался замедлением созревания ретикулоцитов (табл. 3)
От уровня анемизации (129%) возрастание количества эритроцитов к 25-м суткам составило 167% Степень гемоглобинизации их на данные сутки составила 153% по отношению к контролю и 126,6% по отношению к коамиду (табл. 4).

Соединение КЭТ-122 способствует достоверному увеличению числа лейкоцитов.

Пример 5. Определение действия КЭТ-122 на восстановлении кроветворения при остром лучевом поражении. Влияние соединение КЭТ-122 на стимуляцию эритропоэза исследовалось на модели острой лучевой болезни у крыс облучением в дозе 6,0 Гр. Определение показателей периферической крови уровня гемоглобина, гематокрита, количество эритроцитов, ретикулоцитов, лейкоцитов, - проводилось по общепринятым методикам. Состояние костного мозга после облучения количество и морфологическую идентификацию эритробластических островков, проводили по [7, 8, 9]
Соединение вводилось в лечебном режиме внутримышечно через день в дозе, равной ЕД₅₀, при однократном введении. Воздействие ионизирующей радиации вызывает снижение количества лейкоцитов на 3-и сутки после облучения 5,5 тыс. кл/мл. Данный показатель при введении КЭТ-122 к 30-м суткам восстанавливается до 12,1 тыс. кл/мл при его исходном значении (до анемизации) 13,9 тыс. кл/мл. Прирост гемоглобина проходил хорошими темпами и уровень его полностью восстанавливался до исходных данных (144 г/л) к 30-м суткам КЭТ-122, предотвращая падение гематокрита (47%) относительно исходного значение (44,2%) 3-и сутки. К 30-м суткам он составил 54%
Испытуемое соединение предотвращало также снижение числа эритроцитов и ретикулоцитов (фиг. 4, 5) после облучения и способствовало их увеличению в течение наблюдаемого периода. Количество эритроцитов на 3-и сутки составлял 8,2 млн кл/мкл при исходном уровне 6,9 млн. кл/мкл и возрастало к 30-м суткам до 8,8 млн кл/мкл. Количество ретикулоцитов уже на 7-е сутки превышало исходный уровень (39%) 56% и увеличивалось к 30-м суткам до 93% Прирост клеток сопровождался соответствующим увеличением гемоглобина.

Активация эритропоэза при введении КЭТ-122 подтверждалась изменениями, наблюдаемыми в костном мозге. Уже на 3-й день после облучения количество эритробластических островков костного мозга составлял 123•10³/бедро при исходном уровне 97•10³/бедро (фиг. 6). К 30-м суткам данный показатель возрастал до 138•10³/бедро.

Предлагаемое соединение имеет следующие преимущества:
1. Обладает меньшей токсичностью, LD₅₀ 250 мг/кг для КЭТ-122 и 125 мг/кг для коамида;
2. обладает большей активностью ЕД₅₀ 66,0 мг/кг для КЭТ-122 и 107,0 мг/кг для коамида;
3. способствует более высокой степени гемоглобинизации эритроцитов при постгеморрагических анемиях на 53% по сравнению с контролем и на 26,6% по сравнению с коамидом;
4. предотвращает развитие эритропении при облучении животных γ -источником в сублетальных дозах количество эритроцитов на всем протяжении опыта не снижалось ниже исходного уровня, в то время как для коамида снижение на 14-е сутки составило 17,4% (в контроле 20,3%) и количество данных клеток не восстановилось до конца опыта (30-е сутки) (фиг. 4), причем уровень гемоглобина при использовании КЭТ-122 восстанавливался полностью к 30-м суткам (144 г/л), в то время как при использовании коамида восстановление не наступало уровень гемоглобина к концу опыта составил 108 г/л (контроль 100 г/л).

5. Способствует регенерации красного ростка костного мозга при облучении животных g -источником в сублетальных дозах количество эритробластических островков в группе с использованием КЭТ-122 на всем протяжении опыта не снижалось ниже исходного уровня, в то время как при использовании коамида снижение к 7-м суткам составило 40% (контроль 60%) и данный показатель не восстановился до конца опыта на 30-е сутки он был на 34% ниже исходного (в контроле на 58%).

Таким образом, соединение КЭТ-122 обладает выраженным действием на кроветворение на фоне воздействия ионизирующей радиации при сублетальной дозе облучения. По своему действию оно превосходит эффект коамида. Соединение активно стимулирует костномозговой эритропоэз и способствует более раннему процессу регенерации элементов красной и белой крови.

Изобретение относится к координационной химии, конкретно к новому химическому соединению Би c(2-этилгексаноато(бис(триэтилентетрамин)кобальт (II), общей формулы:

проявляющему свойства стимулятора гемопоэза КЭТ-122) Кэт -122 по своему действию превосходит эффект коамида. Активно стимулирует костно-мозговой эритропоэз и способствует более раннему процессу регенерации элементов красной и белой крови. 6 ил.

1. Бис(2-этилгексаноато)бис(триэтилентетрамин)кобальт (II) общей формулы
проявляющий свойства стимулятора гемопоэза.