СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ ПРОТИВОАНЕМИЧЕСКОЙ И ИММУНОМОДУЛЯТОРНОЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 2003 года по МПК A61K31/715 A61K33/26 

Изобретение относится к медицине и фармакологии, а именно к клинической гематологии, и может быть использовано для профилактики и лечения железодефицитной анемии.

Биологическая потребность в железе обусловлена его ролью в процессах кроветворения, дыхания и окислительно-восстановительных реакций. Дефицит железа в человеческом организме вызывает патологию, в частности железодефицитные анемии, которые характеризуются снижением количества эритроцитов и гемоглобина в крови. Следствием последнего является обеднение тканей организма кислородом и появление специфических симптомов болезни.

Известные противоанемические препараты в качестве лекарственной субстанции содержат в основном сульфат железа. Современные препараты, обеспечивающие коррекцию дефицита железа, не лишены недостатков. Они требуют длительного приема в избыточном количестве из-за низкой усваиваемости. Так при оральном применении соединений железа ассимилируется только 10% введенного металла. Кроме того, при приеме железосодержащих препаратов (сульфата железа) внутрь часто возникают нежелательные побочные явления: потемнение зубов, нарушение перистальтики кишечника. Увеличения усвоения железа можно достичь за счет комплексной терапии с восстанавливающими (аскорбиновая кислота - тардиферон, актиферрин, антианемия) или хелатирующими (янтарная кислота или серосодержащие аминокислоты - ферронат, ферромакс) агентами.

Для улучшения состава препарата в качестве сопутствующего компонента используют низкомолекулярные углеводы: глюконат железа - тотема, железомальтозолат - феррум лек, железосорбитолат - фербитол, железосахарат - ферковен (М. Д. Машковский. Лекарственные средства. - М.: Новая волна, 2000, т. 2, с. 150-155). Кроме того, используют иммобилизацию солей железа на полимерной углеводной матрице, например на декстранах (имферон) (D.A. Brown, M.V. Chidambaram. Iron containing drugs. Metal ions biol. syst., 1982, 14, р. 125-178). Эти препараты эффективны и используются для парентерального введения при тяжелых формах анемии. Однако при этом могут наблюдаться аллергические явления на коже, болезненность при введении.

Наиболее близким к предлагаемому по назначению препаратом является железопроизводное арабиногалактана. Полисахарид арабиногалактан был выделен из древесины лиственницы американской (Larix occidentalis) и предварительно очищен от низко- и высокомолекулярных составляющих (L. Josephson, E.V. Groman, С. Jung, J.M. Lewis. Targeting of therapeutic agents using polysaccharides. Patent USA 5336506. Aug.9, 1994). Для синтеза железопроизводного арабиногалактана равные объемы водных растворов хлорида железа двухвалентного (58,5 моль) и трехвалентного (31,6 моль) и раствора арабиногалактана (60 г в 120 мл воды) сливали при энергичном перемешивании. Затем медленно добавляли 30% водный раствор гидроксида аммония до рН 10, Смесь нагревали при 90^oС в течение 15 мин, после охлаждения отфильтровывали раствор железопроизводного арабиногалактана. Транспорт железа из железопроизводного арабиногалактана в клетку был подтвержден обнаружением изотопа ⁵⁹Fe в гемоглобине. Это свидетельствует об активности полученного продукта при железодефицитной анемии.

Целью предполагаемого изобретения является создание и применение средства на основе арабиногалактана из древесины лиственницы сибирской, обладающего противоанемическим и иммуномодулирующим действием.

Поставленная цель достигается синтезом на основе арабиногалактана, выделенного из древесины лиственницы сибирской, препарата, содержащего железо, и использованием его для купирования анемий различной этиологии, а также исследования его противоанемического и иммуномодуляторного действия.

Сущность предлагаемого изобретения в том, что синтезированное железосодержащее производное арабиногалактана обладает противоанемической и иммуномодуляторной активностями.

Для синтеза железосодержащего препарата мы использовали арабиногалактан лиственницы сибирской (Larix sibiricd). Арабиногалактан извлекали из древесины лиственницы сибирской водной экстракцией при температуре 90-100^oС и очищали двухкратным переосаждением в спирт. Макромолекула арабиногалактана лиственницы имеет галактановый кор, в котором звенья D-галактопиранозы связаны β-1,3-О-гликозидными связями. Боковые цепи, представленные β-D-галактопиранозой, α-L-арабинофуранозой, β-L-арабинопиранозой, β-D-галактуроновой и β-D-глюкуроновой кислотой, присоединяются по 6 положению к галактозе основной цепи связями 1,3 и 1,6. Количественное отношение арабинозы к галактозе (Ара: Гал) варьирует от 1:6 до 1:8. Молекулярная масса полимера лежит в интервале от 5000 до 40000. Среднемассовая молекулярная масса арабиногалактана составляет 10000-12000, Этот препарат не требует фракционирования для удаления низко- и высокомолекулярной части. Наличие в структуре арабиногалактана звеньев галактозы, способных связываться с рецепторами клеточной стенки, обеспечивает ему мембранотропные свойства. Благодаря своей полимерной основе и мембранотропным свойствам арабиногалактан, в отличие от декстранов, может выполнять роль матрицы для направленного транспорта лекарственных препаратов и биологически важных микроэлементов, в частности железа.

В качестве субстанции для средства предлагается использовать производное арабиногалактана, содержащее железо в количестве 0,1-5,5%. Это производное легко растворяется в воде и нетоксично. Способ его получения с выходом 85-95% прост и основан на взаимодействии солей железа с арабиногалактаном в среде гидроксида аммония.

Пример 1. Способ получения железосодержащего производного арабиногалактана.

Синтез осуществляли следующим образом. Водный раствор солей железа (смесь FeSО₄•7H₂О и FеСl₃•5Н₂O в соотношении 1:2), содержащий железо в количестве 0,75 ммоль в расчете на 1 г арабиногалактана, добавляли к водному (40%) раствору арабиногалактана при интенсивном перемешивании и оставляли при комнатной температуре в течение 30 мин. После этого проводили обработку полученной смеси 20% гидроксидом аммония до рН 12. Полученную смесь кипятили на водяной бане в течение 30 мин и после охлаждения фильтровали. Выделение целевого продукта из раствора и очистку от низкомолекулярных примесей проводили двукратным переосаждением в этиловый спирт. Выход целевого продукта 89%. Элементный состав, %: С 37,44; Н 6,72; содержание золы 4,9%, что соответствует содержанию железа 3,5%.

Содержание железа в полимере определяли спектрофотометрически на СФ-26 с трилоном Б в качестве комплексообразователя и методом атомно-абсорбционной спектроскопии. Некоторые характеристики препарата приведены в таблице 1.

Образовавшаяся система металлополимера однородна и агрегативно устойчива в нейтральной среде. В кислой среде она разрушается: в интервале рН 1-3 наблюдается линейная зависимость выхода железа из матрицы арабиногалактана от кислотности среды, при рН 1 выделение железа из препаратов происходит в течение 48 часов.

Железосодержащее производное арабиногалактана не обладает токсическим действием при парентеральном введении в организм.

Острая токсичность железосодержащего производного арабиногалактана исследована на белых мышах. Острую токсичность определяли на 60 животных массой 20,0-22,0 г, поделенных на 5 серий соответственно дозе вводимого препарата. Апробировали дозы от 1000 до 5000 мг/кг. Подсчет средней смертельной дозы производили по методу Кербера. В нашем эксперименте ни в одном опыте гибели животных не наблюдалось, т.е. в дозе 5000 мг/кг железосодержащее производное арабиногалактана не проявляло острой токсичности.

Противоанемическая активность железосодержащего производного арабиногалактана изучена на животных с экспериментальной железодефицитной и токсической анемией.

Пример 2. Исследование противоанемической активности железосодержащего производного арабиногалактана на модели экспериментальной железодефицитной анемии,
Железодефицитная анемия моделировалась ежедневным внутримышечным введением десферала в дозе 150 мг/кг с пролонгированием сроков инъекций до 8 недель.

Биологические исследования антианемической активности железосодержащего производного арабиногалактана были выполнены на 48 белых беспородных крысах-самках массой 150-180 г, прошедших двухнедельный карантин и находившихся на обычном рационе питания. По окончании 8-й недели животные, получавшие десферал, были разделены на 3 группы, которым проведена терапия предлагаемым препаратом - железосодержащим производным арабиногалактана и препаратом Феррум Лек (для сравнения активности) в одинаковой дозировке по железу.

12-и животным опытной группы в течение 60 дней вводилось железосодержащее производное арабиногалактана, растворенное в физиологическом растворе хлорида натрия в дозе 0,01 мг железа/кг; 12 крысам группы сравнения по аналогичной схеме инъецировался Феррум Лек в дозе 0,01 мг железа/кг; 12 животных группы контроля получали ежедневно внутримышечно физиологический раствор в таком же объеме; 12 интактных животных не получали никаких препаратов и содержались в аналогичных условиях.

У всех животных определялось содержание гемоглобина, эритроцитов в периферической крови, концентрация железа в моче до проведения экспериментов, на 8-й неделе после начала исследований и спустя 4 и 8 недель после начала лечения. Параллельно изучались мазки периферической крови и костного мозга, содержание железа в сыворотке крови. Статистическая обработка результатов выполнена методом вариационной статистики с использованием критерия Стьюдента (с доверительной вероятностью р<0,001 по сравнению с исходным уровнем). Исходные показатели крови: содержание гемоглобина 146±2,2 г/л, эритроцитов (4,02±0,18)•10¹²/л, сывороточного железа - 47,2±4,45 мкмоль/л.

В группе интактных животных не обнаружено никаких отклонений показателей системы эритроцитов от исходных значений, У всех животных, получавших десферал, отмечено увеличение выведения железа с мочой. На восьмой неделе выявлена выраженная анемия, характеризующаяся падением уровня гемоглобина на 32% от начальной величины (р<0,001), снижением количества эритроцитов (р<0,001) и цветового показателя (р<0,001), а также качественными изменениями красных клеток крови в виде гипохромии, анизо- и пойкилоцитоза, микроцитоза. Концентрация сывороточного железа составила лишь 28% от такового у контрольных крыс (р<0,001). В костном мозге снижено количество сидеробластов, сидероцитов вплоть до полного их отсутствия.

Через 4 недели ежедневных инъекций (12 недель наблюдения) железосодержащего производного арабиногалактана отмечено повышение концентрации гемоглобина на 20% в сравнении с показателем, регистрируемым во время "пика" анемии (8 неделя), и на 25% в сравнении с показателем у нелеченых животных. На 16 неделе (спустя 8 недель от начала терапии) у крыс, получавших железосодержащее производное арабиногалактана, концентрация гемоглобина достигла исходной величины. К этому же сроку произошло восстановление числа эритроцитов, цветового показателя и концентрации сывороточного железа (табл. 2).

Железосодержащее производное арабиногалактана конкурирует по результативности действия с импортным препаратом феррум Лек: более эффективно, чем феррум Лек, восстанавливает уровень гемоглобина, доводя его до границ исходной величины; при его приеме намечается более быстрая тенденция (уже через месяц после начала лечения) к повышению числа эритроцитов.

Пример 3. Исследование противоанемической активности железосодержащего производного арабиногалактана на модели токсической анемии.

Токсическую анемию вызывали у 36 белых беспородных крыс-самок массой 150-180 г введением 0,1% гидрохлорида фенилгидразина в дозе 3 мг/100 г массы тела внутримышечно в течение 3-х дней. Начиная с пятого дня от первой инъекции фенилгидразина (пик токсической анемии), крыс делили на три группы. Животным первой группы в течение последующих 40 дней вводили железосодержащее производное арабиногалактана, растворенное в физиологическом растворе хлорида натрия в дозе 0,01 мг железа/кг. Крысам второй группы (группа сравнения) по аналогичной схеме вводили феррум Лек. Животные третьей группы (группа контроля) ежедневно внутримышечно получали физиологический раствор. У всех животных до проведения опытов, а затем на пятый и 40-й день определяли количество гемоглобина, эритроцитов, ретикулоцитов в периферической крови, содержание железа в моче, изучали мазки периферической крови.

После трехкратного введения раствора гидрохлорида фенилгидразина наблюдалось развитие анемии с максимальной депрессией изучаемых показателей на пятые сутки эксперимента (пик анемии). К этому сроку произошло снижение концентрации гемоглобина на 54%, числа эритроцитов на 28%, лейкоцитов на 46%, увеличение количества ретикулоцитов в 5 раз и выделение железа с мочой в 14 и более раз. Существенно изменились поведение и внешний вид животных, характеризующиеся ограничением подвижности, отказом от пищи и облысением. У животных контрольной группы положительной динамики гематологических показателей в течение всего периода не наблюдалось. Концентрация гемоглобина, количество эритроцитов, ретикулоцитов, лейкоцитов не восстанавливалось до исходных величин к 1,5 месячному сроку. Более того, эти показатели достоверно не отличались от результатов, полученных на пятые сутки эксперимента, т.е. в период максимального развития анемии.

После введения железопроизводного арабиногалактана и феррум Лек произошло увеличение уровня гемоглобина, числа эритроцитов и лейкоцитов, нормализация содержания ретикулоцитов. К моменту завершения терапии данные параметры крови полностью соответствовали исходным значениям. Количество эритроцитов после проведенного лечения железопроизводным арабиногалактана достоверно превышало их начальные цифровые значения, подобного эффекта при применении феррум Лек не выявлялось (табл. 3). Количество лейкоцитов у опытной группы было выше в 2,5 раза, чем в группе сравнения. Таким образом, оба апробированных препарата оказались достаточно эффективными для коррекции гематологических показателей при экспериментальной токсической анемии.

Примечание к табл. 3: достоверность р - между исходным значением и значением показателя в пике анемии; p_l - между исходным значением и показателем на 40 день; р₂ - между значением показателя в пике анемии и на 40 день; р₃ - между значением показателя контрольной и опытной группы на 40 день; р₄ - между значением показателя контрольной и группы сравнения на 40 день; р₅ - между значением показателя опытной группы и группы сравнения на 40 день.

Железосодержащее производное арабиногалактана было исследовано на иммуномодуляторную активность.

Пример 4. Исследование иммуномодуляторной активности железосодержащего производного арабиногалактана.

Влияние железосодержащего производного арабиногалактана на фагоцитарную активность изучали на модели макрофагов морских свинок. Через 1 ч, 1, 3, 5 сут после подкожного введения железосодержащего производного арабиногалактана в крови животных определяли общее количество лейкоцитов, лимфоцитов, титр иммуноглобулинов М, G, индекс регенерации. Железосодержащее производное арабиногалактана использовали также для коррекции дефектов фагоцитарной системы организма при псевдотуберкулезной инфекции. В качестве экспериментальной модели служили перитонеальные макрофаги морской свинки, инфекционного агента - вирулентный штамм Y. pseudotuberculosis И-716. С учетом внутриклеточного паразитирования Y. pseudotuberculosis исследование проводили in vitro после предварительного (за 1 ч, 1, 3, 6 сут до получения макрофагов) введения животным железосодержащего производного арабиногалактана концентрацией 60 мг/мл (в физиологическом растворе).

Установлено, что после подкожного введения железосодержащего производного арабиногалактана (за 1 ч, 1, 3, 6 сут до получения макрофагов) индекс регенерации фагоцитов в 2,0-3,6 раза выше, чем в контроле. Таким образом, препарат железосодержащего производного арабиногалактана оказывает стимулирующее действие на регенерацию лейкоцитов.

Железосодержащее производное арабиногалактана стимулирует фагоцитарную активность макрофагов в отношении Y. pseudotuberculosis: количество микробов, поглощенных макрофагами морских свинок после введения железосодержащего производного арабиногалактана, в 1,3-2,3 раза выше (р<0,05), чем в контроле. Железосодержащее производное арабиногалактана положительно влияет на завершенность фагоцитоза (табл. 4).

В последующих опытах изучено влияние препарата на кислородзависимый метаболизм макрофагов морской свинки в тесте восстановления нитросинего тетразолия (ЦПА) и по количеству формазанположительных клеток (ФП). Результаты исследования суммированы в таблице 5.

Показатели НСТ-теста свидетельствуют о том, что железосодержащее производное арабиногалактана активирует кислородзависимый метаболизм макрофагов.

Изучение влияния железосодержащего производного арабиногалактана на продукцию метаболитов кислорода в макрофагах, фагоцитирующих псевдотуберкулезные микробы, проводили с использованием монослоя фагоцитов с помощью цитохимического исследования в реакции восстановления нитросинего тетразолия. В качестве объекта фагоцитоза использовали штамм Y. pseudotuberculosis И-716, содержащий плазмиды pYV 48 и pVM 82 (табл. 6).

Полученные экспериментальные данные указывают на то, что железосодержащее производное арабиногалактана повышает продукцию активных форм кислорода в перитонеальных макрофагах при фагоцитозе Y pseudotuberculosis И-716. Высокие показатели НСТ-теста (по сравнению с контролем) в макрофагах, активированных препаратом, наблюдали уже через 30 мин их контакта с псевдотуберкулезным микробом, а через 2 ч контакта они еще более возрастали. Следовательно, железосодержащее производное арабиногалактана обладает стимулирующим действием на фагоцитарную активность макрофагов и полиморфноядерных лейкоцитов в отношении псевдотуберкулезного микроба, оказывая ингибирующее действие на его размножение внутри фагоцитов, а также активирует окислительный метаболизм макрофагов и тем самым усиливает его бактерицидный эффект в отношении псевдотуберкулезного микроба.

В опытах с перитонеальными макрофагами морской свинки установлено, что железосодержащее производное арабиногалактана является индуктором синтеза окиси азота (NO) - низкомолекулярного соединения, обладающего бактерицидными и цитотоксическими свойствами, и, таким образом, повышает неспецифическую резистентность организма.

Железосодержащее производное арабиногалактана является эффективным противоанемическим препаратом широкого спектра действия, проявляет иммуномодулирующие свойства, повышая бактерицидный эффект в отношении микроорганизмов Y. pseudotuberculosis.

Изобретение относиться к медицине и фармакологии и касается новых лекарственных средств. Средство, обладающее противоанемической и иммуномодуляторной активностью, представляет собой железопроизводное природного полисахарида арабиногалактана из древесины лиственницы сибирской Larix sibirica и содержит железо в количестве 0,1-5,5%. Средство является эффективным противоанемическим препаратом широкого спектра действия и проявляет иммуномодулирующие свойства. Создание средства расширяет ассортимент лекарственных препаратов указанного назначения. 6 табл.

Средство, обладающее противоанемическим и иммуномодулирующим действием, представляющее собой железопроизводное природного полисахарида арабиногалактана из древесины лиственницы сибирской Larix sibirica, содержащее железо в количестве 0,1-5,5%.