НУКЛЕОТИДНАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ГЕНА XPR 2 YARROWIA LIPOLYTICA (ВАРИАНТЫ), ШТАММ ДРОЖЖЕЙ YARROWIA LIPOLYTICA (ВАРИАНТЫ) Российский патент 2000 года по МПК C12N15/00 C12N15/63 C12N15/81 C12N1/19 C07K14/39 

Заявка является частичным продолжением заявки, серийный номер 789206, поданной 18 октября 1985 г.

Данное изобретение относится к технологии выделения протеинов дрожжей. Более конкретно оно относится к рекомбинантным векторам клонирования Yarrowia lipolytica содержащим чужеродную ДНК, кодирующую экспрессию и выделение протеинов млекопитающих (напр., прохимозина) и других полипептидов; к векторам экспрессии, содержащим промотор гена Y. lipolytica /напр., XPR2 или LEU2/, сигнальную /или предсигнальную/ последовательность щелочной протеазы, прорегион и участок терминатора XPR2 и их варианты и функциональные эквиваленты, возникающие при вырождении генетического кода или использования других генных компонентов Y. lipolytica. Кроме того, изобретение относится к трансформантам дрожжей, несущим указанные векторы экспрессии и выделения, их использованию для получения чужеродных протеинов в их нативной, функциональной форме и методам осуществления вышеуказанного.

Экономическая привлекательность как надежного и с достаточно высоким выходом метода производства множества протеинов или полипептидов, представляющих интерес для промышленности (напр. прореннина, бычьего гормона роста) или для медицинских целей (напр. урогастрона, активатора тканевого плазминогена, человеческого анафилатоксина C5a) и в особенности как источника, дающего высококачественный продукт в легко отделяемой функциональной форме, привели многих исследователей к приложению ДНК-рекомбинантной технологии к микроорганизмам как "фабрикам" для производства чужеродных протеинов.

Обширные исследования сконцентрированы на секреции протеинов как потенциальном разрешении трудностей, встретившихся при извлечении чужеродных /нетерологичных/ или экзогенных протеинов в биологически активной форме из внутриклеточных скоплений и рекомбинантных клетках хозяина, в особенности Escherichia coli B E.coli чужеродный протеин часто производится в клетке в форме преломляющих тел включения. Эти протеины обычно имеют низкую растворимость в воде и малую биологическую активность или не имеют ее. Извлечение данных протеинов из преломляющих тел включения обычно требует жесткой химической обработки, которая может быть дорогостоящей и может приводить к малому извлечению или отсутствию извлечения протеина в желаемой нативной, биологически активной форме. Кроме того, возможность загрязнения протеина нежелательными веществами, производимыми E.coli, увеличивается ввиду необходимости разрушения клеток для освобождения преломляющих тел. Другие организмы, кроме E.coli также производят чужеродные протеины в нерастворимой внутриклеточной форме. Например, патент Великобритании N 2091271, опубликованный 28 июля 1982, описывает генетическую модификацию S.cerevisiae путем ДНК-рекомбинантной технологии для экспрессии телячьего реннина, или химозина; эти термины используются в патенте взаимозаменяемо. Ввиду этих трудностей обратились к секреции упомянутых протеинов в попытке получения протеинов в нативной, активной конфигурации.

Выделяется ли какой-либо протеин, включая чужеродные протеины, или полипептид данным организмом, как представляется, зависит от протеина. В большинстве эукариотических клеток часть аппарата синтеза протеинов связана с эндоплазмичной сетчатой мембраной, и последовательность аминокислот /называемая "сигнальной последовательностью"/ у аминоконца растущей полипептидной цепи служит для направления пересечения протеином мембраны. Сигнальная последовательность затем расщепляется протеолитически, давая активный готовый протеин. Для ускорения процессов выделения чужеродных протеинов было сделано несколько попыток использовать сигнальные последовательности в микроорганизмах, включая Bacillus subtilis, Sacoharomyces serevisiae и культуры клеток млекопитающих. Однако данные организмы оказались не идеальными.

Присущие B. subtilis свойства, например выделение многих протеинов, включая многочисленные протеазы, которые способны деградировать выделяемый чужеродный протеин, нестабильность трансформированных штаммов, возникающая вследствие потери чужеродной ДНК, препятствуют его использованию.

Клетки млекопитающих успешно модифицировать генетически для экспрессии и выделения чужеродных протеинов, но эти системы технологически сложны и дорогостоящи для обработки и не имеют практического применения для коммерческого производства большинства протеинов.

Хотя исследования выделения протеинов были более успешны с S. cerevisiae , чем с B. Subtilis, даже S. cerevisiae, как представляется, имеет внутренние ограничения как система выделения протеинов. Европейская патентная заявка N 0123544, опубликованная 31 октября 1984, описывает изолирование α - фактор-генов и использование промотирующих и/или сигнальных пептидных частей их в сочетании с ДНК, кодирующей чужеродные для дрожжей протеины, в плазмиде для трансформации клеток дрожжей, способных производить отдельный готовый протеин в клеточной культуре. Европейская заявка N 0088632, опубликованная 14 сентября 1983, описывает способ экспрессии и выделения чужеродного протеина в S. cerevisiae. Однако размер протеинов, которые S.cerevisiae эффективно выделяет с данной и другими системами выделения, как представляется, ограничен примерно 20000 дальтон. Преодоление этой неэффективности S.cerevisiae как организма выделения потребовало многих мутационных изменений, как описано Smith и др., Science 229, 1219 - 1224 /1985/. Единственным исключением для этого направления является наблюдение, что ферменты Aspergillus величиной более 20000, видимо, могут выделяться S. cerevisiae, но эти ферменты сильно гликозирируются S. cerevisiae, и это может влиять на эффективность выделения.

Особый интерес заключается в Yarrowia lipolytica, промышленно важном виде дрожжей, используемом для производства лимонной кислоты и клеточных протеинов. Он также может быть использован для получения эритрита, таннита и изопропиляблочной кислоты. В противоположность S. cerevisiae, Y. lipolytica представляет особый интерес и ценность из-за своей способности эффективно выделять высокомолекулярные протеины (щелочную протеазу, кислую протеазу и ДНК-азу) в культурную среду, предоставляя таким образом потенциальную возможность извлечения чужеродных протеинов в нативном состоянии без необходимости разрушения продуцирующих клеток. Кроме того, Y. lipolytica количественно выделяет очень мало протеинов, таким образом предоставляя возможность получения нужного чужеродного протеинов в питательной среде в качестве доминирующей разновидности протеинов и облегчая извлечение указанного чужеродного протеина.

Y. lipolytica производит большое количество внеклеточной протениазы. Это доминирующий протеин, выделяемый Y. lipolytica. Вид протеазы /щелочной, кислый или нейтральный/ зависит от штамма использованной Y. lipolytica /Ogrydziak и др. J. Gen. microbiol /1982/ 128, 1225 - 1234/. Частичный анализ N-концевой аминокислотной последовательности щелочной внеклеточной протеазы описан Ogrydziak и др. /ук. соч./.

Рассматриваемая заявка серийный N 634505, поданная 25 июля 1984, описывает методы трансформации Y. lipolytica и клонирования генов Y. lipolytica путем комплементации мутаций. В ней описано клонирование гена XPR2, который кодирует выделяемую щелочную протеазу, путем комплементации XPR2 мутаций Y. lipolytica. Метод включает трансформацию штамма-хозяина Y. lipolytica с частичным дайджестом BglII библиотеки генов Y. lipolytica в вектор pID40, описанный в Европейской заявке N 0138508, опубликованной 24 апреля 1985 г., являющейся дубликатом вышеуказанной заявки США.

Данное изобретение предусматривает: рекомбинантные векторы клонирования Y. lipolytica, содержащие чужеродную ДНК, кодирующую протеины млекопитающих и другие полипептиды, включая плазмиды, пригодные для трансформации клеток хозяина Y. lipolytica и в особенности интегративные векторы экспрессии, содержащие ген-промотор LEU2, ген-промотор XPR2, препрорегион щелочной протеазы и концевой регион XPR2; и плазмиды экспрессии, имеющие чужеродную кодирующую последовательность с сигналами выделения XPR2 ниже по течению от промотора LEU2, которые способны вызывать экспрессию и выделение чужеродного протеина в Y. lipolytica, трансформируемой при этом.

Изобретение, таким образом, иллюстрирует процесс экспрессии и выделения готовых чужеродных протеинов, в особенности прореннина и человеческого анафилатоксина C5a, из генетически измененных клеточных культур Y. lipolytica, установление точной идентичности аминокислотной последовательности, а также последовательности ДНК для внеклеточной щелочной протеазы Y. lipolytica позволило предположить, что чужеродный протеин может быть экспрессирован и выделен с помощью ДНК-рекомбинантной технологии для производства в клеточной культуре. В случае прореннина готовая форма зимогена/предшественник реннина/ выражается и выделяется.

Было обнаружено, что Y. lipolytica может быть генетически модифицирована с помощью ДНК-рекомбинантной технологии с получением трансформантов, способных к экспрессии и выделению чужеродных протеинов в их нативной форме. Это достигается путем конструирования векторов, несущих сигнальную последовательность или сигнальную и первую /про1/ или обе пропоследовательности /про1, про2/ гена XPR2, связанные со структурной генной последовательностью для чужеродного протеина, который необходимо выделить.

Трансформанты, получаемые интеграцией в локусе XPR2 вектора ДНК, содержащей фрагмент гена XPR2 с отсутствующими регуляторами или структурными компонентами на обоих концах гена, не выделяют более щелочной протеазы, характеристика, не только желательная для выделения чужеродного протеина, но и которая может быть использована для скрининга транcформантов.

Кроме того, векторы, несущие промотор XPR2 и последовательности для сигнальной последовательности выделение щелочной протеазы, способны в трансформированной клетке вызвать выделение готового чужеродного протеина. Некоторые ДНК-рекомбинантные векторы этого типа способны вызвать экспрессию/выделение независимо от сайта интеграции в геноме дрожжей. Вообще, векторы, содержащие подходящие 5' и 3' - боковые ДНК, вызывают экспрессию продукта независимо от сайта интеграции.

Кроме того, было неожиданно обнаружено, что интеграция pBR322 производной плазмиды в хромосомную ДНК Y. lipolytica создает область гомологии, способную благоприятствовать дальнейшей сайт-направленной интегративной трансформации. Интегрированная копия pBR322 служит, таким образом, "доком" для входящей трансформирующей ДНК. Интеграция резидент-копии pBR322 в хромосомную ДНК Y. lipolytica, несмотря на то, что pBR322 не является нативной ДНК Y. lipolytica, таким образом создает известную мишень для интеграции. Трансформированные реципиенты Y. lipolytica, содержащие такой сайт, обладают двумя главными преимуществами перед реципиентами, у которых подобный сайт отсутствует, а именно: наличие региона с известной последовательностью и известной рестрикционной картой в качестве мишени для сайт-направленной интеграции и возможность определить, используя pBR322 как мишень для интеграции, содержит ли входящая плазмида полную функциональную единицу или ген или только часть нужного гена. Например, плазмида, содержащая только 3'-фрагмент гена XPR2, может трансформировать реципиент XPR2 - 1002, если она содержит кодон дикого типа и интегрирована в локусе XPR2. Однако та же плазмида не будет трансформировать клетку-хозяина XPR2-1002 к положительному фонотипу протеазы, если интегрирована в pBR322, так как в ней отсутствует целая функциональная единица.

Таким образом, в трансформантах Y. lipolytica, содержащих область гомологии к чужеродному вектору ДНК, указанная область, содержащая экзогенную ДНК, служит в качестве принимающего сайта во время интегративной трансформации Y. lipolytica. В дополнение к pBR322 и ее производным, космиды, бактериофаги, такие как M13 и лямбда, синтетические ДНК и обычные плазмиды, такие как p и C13, могут быть использованы для получения трансформантов Y. lipolytica, имеющих "док".

Под промотирующей последовательностью LEU2 понимается нетранслированный участок вверх по течению от ATG, который содержит большинство, если не все, черты, требуемые для экспрессии. Под промотирующей последовательностью XPR2 понимается нетранслированный участок вверх по течению перед сигнальной /или предсигнальной/ последовательностью, которая необходима для экспрессии. Кроме того, сигнал, с или без пропоследовательности, из гена XPR2 может быть использован для выделения протеинов под контролем экспрессии промоторов Y. lipolytica иных, чем гена XPR2. Таким образом, векторы, несущие промотор LEU3 и последовательности для сигнала выделения щелочной протеазы, способны в трансформированной клетке Y. lipolytica вызвать выделение готовых чужеродных протеинов.

Человеческий анафилатоксин C5a, также известный как человеческий дополнительный протеин C5a /человеческий C5a/, представляет собой биоактивный полипептидный фрагмент, генерируемый in vivo в результате комплементарной активации. Он функционирует как иммуномодулятор при регулировании определенных аспектов гуморальной и клеточной иммунореакции. Изучена первичная структура его и других анафилатоксинов. Обзор химических, физических и биологических характеристик представлен Hugli в "Complement", под редакцией H.J. Muller-Eberhard и P.A.Mcischer, cc. 73-99, 1985, Springer-Verlag, New-York.

Специалистам в данной области понятно, что в настоящем изобретении может быть использована с соответствующими необходимыми изменениями чужеродная ДНК, кодирующая фактически любую известную аминокислотную последовательность. Методика, описанная здесь, может быть применена с соответствующими необходимыми изменениями для получения и выделения любых известных чужеродных протеинов, представители которых перечислены в патенте США N 4532207, опубликованном 30 июля 1985 г. Кроме того, любой другой ген Y. lipolytica для выделения протеинов, такой как гены рибонуклеазы и кислой протеазы, может быть использован вместо гена XPR2, а также гибридные гены, сконструированные путем объединения фрагментов двух или более указанных генов, например сигнальная последовательность гена XPR2 и промотирующая последовательность гена рибонуклеазы.

Также включены в объем данного изобретения функциональные эквиваленты вышеописанных ДНК или нуклеотидных последовательностей. Вырожденность генетического кода дает возможность замещения определенных кодонов другими, которые кодируют ту же самую аминокислоту и, следовательно, приводят к тому же протеину. ДНК или нуклеотидная последовательность могут значительно изменяться, так как, за исключением метионина и триатофана, известные аминокислоты могут кодироваться более чем одним кодоном. Так, часть или весь ген XPR2 могут быть синтезированы для получения последовательности ДНК, существенно отличающейся от показанной на фиг. 3. Кодируемая аминокислотная последовательность для него будет, однако, сохранена. Подобные функциональные изменения данной ДНК или нуклеотидной последовательности дают возможность промотировать выделение и/или обработку чужеродных протеинов, кодируемых чужеродными ДНК-последовательностями, привитыми к ним. Все изменения нуклеотидной последовательности гена XPR2 и фрагментов его, разрешенные генетическим кодом, следовательно, включены в данное изобретение. Кроме того, возможно ликвидировать кодоны или заменить один или более кодонов, иными чем вырожденные кодоны, для получения структурно модифицированного полипептида, но по существу имеющего ту же полезность или активность, что и полипептид, полученный с помощью немодифицированной молекулы ДНК. Данные два полипептида функционально эквивалентны, как две молекулы ДНК, вызывающие их появление, даже если разница между этими молекулами ДНК не относится к вырождению генетического кода. Наиболее простой пример этому относится к прореннину A и прореннину B, двум аллольным формам прореннина, которые различаются только присутствием остатка аспарагиновой кислоты в положении 286 прореннина A и остатка глицина в этом положении у прореннина B.

Используя данную методику, достигнута экспрессия и секреция в Y. lipolytica чужеродных протеинов млекопитающих прореннина и человеческого анафилатоксина C5a при применении сигналов экспрессии и выделения из генов Y. lipolytica XPR2 и/или LEU2. ДНК-последовательности для прореннина и человеческого анафилатоксина C5a были пришиты с помощью синтетических олигонуклеотидов к генной последовательности XPR2 в сайтах, предполагаемых для кодирования сигнального пептида щелочной протеазы, или в сайтах, обрабатывающих предшественника протеазы, обозначенных здесь как про1 и про2, и использованы для получения генных конструктов, которые были затем введены в Y. lipolytica путем интегративной трансформации. Рекомбинантные культуры экспрессировали и выделяли в питательную среду чужеродные протеины, имеющие молекулярный вес и иммунореактивность прореннина и человеческого анафилатоксина C5a. Прореннин, полученный таким образом, как представляется, сложен в нативной конфигурации, так как после удаления пропептида он обнаруживает полную ферментативную активность.

Термин "рекомбинантный ДНК материал" используемый здесь, включает любой материал, который содержит по крайней мере одно из следующего: ген XPR2 Y. lipolytica сигнал/или предсигнал/, про1- и про2- /которые вместе содержат прорегион/, промотор или его концевую последовательность; промотор LEU2; и функциональные эквиваленты вышеуказанных последовательностей, допускаемые вырожденностью генетического кода.

Представителями указанного рекомбинантного ДНК материала являются фрагменты ДНК, плазмиды или векторы или трансформанты, содержащие любую или все из вышеуказанных последовательностей.

Материалы. Рестрикционные эндонуклеазы и T4 дигаза были получены из New England Biolabs бактериальная щелочная фосфатаза из Bethesda-Research Laboratories T4 полинуклеотидкиназа из PL-Biochemicals, и [гамма-³²p] АТФ из New England Nuclear. Все ферменты использовались при условиях, рекомендованных поставщиком.

Среды. Среда ГПП /среда глицерин/протеоза-пептон/ содержала /на литр/: 6,7 г глицерина, 1,6 г Difco протеозы-пептона, 1,7 г Difco азотистого основания дрожжей без аминокислот и сульфата аммония, 30 г урацила и 0,5 мл/л полипропиленгликоля мол. в. 2000 (Polysciences), в 40 мМ-фосфатном буфере /pH 6,8/ полипропиленгликоль не был включен, когда среда использовалась для выращивания культур для анализа ферментной активности реннина. Протеаза-пептон был отдельно обработан в автоклаве в фосфатном буфере.

Среда ДЭПД /среда-дрожжи-экстракт/пептон/декстроза/ содержала /на литр/: 5 г экстракта дрожжей, 10 г пептона и 20 г декстрозы. E.coli выращивалась в среде LB при 37^oC. Среда LB содержала /на литр/: 10 г Бактотриптона, 10 г Бактодрожжевого экстракта, 10 г хлористого натрия, доводилась до pH 7,5 гидроокисью натрия.

Анализ последовательности ДНК. Фрагменты ДНК из различных здесь описанных плазмид изолировались на геле полиакриламида и секвентировались по методу Maxam и др. Methods in Enzymology 65, 499 /1980/.

Процедуры связывания. Фрагменты ДНК, включая расщепленные векторные плазмиды, связывались путем смешения нужных компонентов фрагменты ДНК с концевыми участками, специально сконструированными для обеспечения правильного спаривания с T4 ДНК дигазой. Добавлялось примерно 10 единиц лигазы на мкг количества вектора и вводимых фрагментов. Возникающая реакция связывания трансформировалась в компетентные клетки штаммов MM294 /АТСС-33625/ или HBIOI /АТСС-33694/ E. coli K12.

Получение химически синтезированной ДНК. Для конструирования гибридных генов для экспрессии и выделения прореннина восемь олигонуклеотидов были синтезированы по модифицированной фосфорамидатной методике /Sinha и др., Tetrahedron letters 24, 5843 /1983/ на Genetie Dezign 6500 /watertown MA/ автоматическом ДНК-синтезаторе и очищены на 6M мочевина-20% полиакриламидном геле. Аликвоты комплементарных олигонуклеотидов смешивались и сшивались друг с другом при 4^oC в течение ночи в ТЭ /10 мМ триc-HCl, pH 8,0, 1 мМ натриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты/. Аликвоты /около 2 мкг/ двухцепочечных олигонуклеотидов фосфорилировались в 20 мкл реакционной смеси, содержащей 70 мМ трис /pH 7,6/, 10 мМ MgCl₂, 5 мМ дитиотрейтола, 5 мМ АТФ, при 37^oC, используя T4 полинуклеотидкиназу.

Получение плазмидной ДНК. Плазмидная ДНК в больших количествах получалась по методике Holmes и др., anal. Biochem. 114, 195-197 /1981/, с последующим центрифугированием при градиенте плотности в этидиум-бромид-CSCI. Миниколичества плазмидной ДНК получались по щелочной SDS методике Birnboim и др., NAR 1,1513/1979/.

Конструирование векторов экспрессии/выделения для прореннина. Была приготовлена серия различных конструкций для получения конечных векторов экспрессии. Все стадии представлены в виде схемы на прилагаемых чертежах. В общем, фрагменты ДНК изолировали путем гель-электрофореза и сшивали с другими фрагментами или расщепленной плазмидной ДНК в 20 мкл 50 мМ трис-HCl /pH 7,5/, 1M мМ MgCl₂, 20 мМ дитиотрейтола, 1 мМ АТФ, и 200 единиц T4 лигазы при 4^oC. Если требовалось частичное расщепление ДНК рестрикционной эндонуклеазой, оптимальное время расщепления устанавливалось экспериментально.

Идентификация прореннина в культуральной жидкости.

Трансформанты дрожжей, содержащие векторы экспрессии, выращивались в течение ночи в среде ГПП /см.выше/. После ценрифугирования для удаления клеток дрожжей, добавляли 1 мл 50% трихлоруксусной кислоты в каждой 5 мл аликвоте культуральной жидкости и выдерживали при 4^oC 60 минут. Центрифугированием получали шарики, которые дважды промывали 2 мл холодного ацетона. Осажденный протеин растворяли в 100 мкл стандартного SDS буфера и аликвоты подвергали электрофорезу на 10% SDS-полиариламидных гелях /Laemmli, ИК /1970/ Nature 227, 680/. Освобожденные из геля протеины электрофоретически переносили на нитроцеллюлозу /Schleicher и Schuell 0,22 мкм/ и прореннин определяли иммуноточечным анализом на пластинке геля /Hawkes R. и др., 1982, Cinal.Biochem 119, 142/. Фильтр покрывали антипрореннин-антителом кролика с последующей инкубацией с сопряженным с пероксидазой антителом козел-кролик /gG/ Cappel, Malvern Pa. Связанные антитела определялись окрашиванием смесью 4-xлоp-1-нафтол и перекись водорода.

Активность по свертыванию молока прореннина в культуральной жидкости. Культуральная жидкость различных трансформантов Y.lipolytica исследовалась на активность по свертыванию молока по модифицированному методу Ernstrom J. Dairy Sci 41, 1664 /1958/. Коротко говоря, исследование включало измерение времени, требуемого реннину в активированных супернанантах культуры для свертывания буферного снятого молока и соотношения значений со стандартными для очищенного реннина. Культуры дрожжей /25 мл/ выращивались в течение ночи в среде ГПП. После центрифугирования для удаления клеток 5 мл аликвоты супернатантов культуры высушивались замораживанием под вакуумом. Каждый диофилизированный супернатант был ресуспендирован в 300 мкл дистиллированной воды. Серия разбавлений очищенного прореннина теленка была также приготовлена в качестве контрольного стандарта. Прореннин в среде концентратов и контрольные образцы активировались добавлением примерно 5-10 мкл конц. HCl до получения pH приблизительно 2 и инкубировались один час при 22^oC. Снятое молоко приготовляли путем прибавления 60 г сухого порошка снятого молока /Difco/ к 500 мл 41,5 мМ ацетата натрия /pH 6,3/ и 13,6 мМ CaCl₂ и перемешивания 20 минут при 4^oC. Субстрат был использован для анализа немедленно после приготовления. Аликвоту 60 мкл /эквивалент 1 мл супернатанта культуры/ каждого препарат фермента добавляли к 1 мл аликвоты снятого молока при 37^oC и регистрировали время свертывания.

Получение синтетических олигонуклеотидов для гена C5a.

Олигодезоксинуклеотиды, используемые в синтезе структурного гена C5a, получали по модифицированной фосфорамидатной методике /Sinka и др., ук. соч. / с использованием контролируемой опоры из пористого отекла на Cienetic Design 6500 /Watertown MA/ автоматическом ДНК-синтезаторе. При получении использовали 3% /вес/объем/ дихлоруксусную кислоту в дихлорметане для удаления тритильной группы, активирование фосфорамидатов насыщенным тетразолом в ацетонитриле, обработку ди-этоксифосфинтетразолидом и окисление водным раствором иод/ТГФ/Mattеucci и др., 1981, J.Am.Chem.Soc. 105, 3183/. Полное время на цикл добавления составляло 14 минут. Девять 47-мер сегментов A-J фиг. 9 получали с 98,9% средним выходом на стадию /по тритильному анализу/, деблокировали по методике Matteucci и др. ук.соч., осаждали этанолом из 0,3 М ацетата натрия и выделяли путем препаративного гельэлектрофореза на 10% денатурированном геле полиакриламид-мочевина перед сшиванием.

Сборка, клонирование и секвентирование человеческого гена C5A. На фиг. 9 показана аминокислотная последовательность нужного протеина и расположение синтетических олигонуклеотидов, необходимых для изготовления гена, кодирующего человеческий протеин C5a. Все олигомеры, кроме A и F, фосфорилировались по их 5'-концам T4 полинуклеотидкиназой. Сборка гена включала две первичных реакции расщепления/сшивания, включающих: олигомеры A, B, I и J и олигомеры C, D, E, F, G и H. Образующиеся B 94 п.ос. и 141 п.ос. двухцепочечные фрагменты ДНК изолировались после электрофореза на 10% полиаклирамидном геле, сшивались вместе и их B 235 п.ос. продукт изолировался гель-электрофорезом. В 235 п.ос. фрагмент ДНК, содержащий структурный ген, кодирующий C5a, вводился между E.coRI и Hind III байтами ДНК вектора pBP322 и трансформировался в компетентные клетки штамма HBIOI E.coli K-12. Рестрикционный анализ плазмидной ДНК, изолированной из 6 трансформантов, показал, что 5 из 6 клонов содержали E. coRI/HindIII фрагмент правильного размера. Нуклеотидную последовательность участка гена C5a каждой из этих плазмид определяли до методу Maxam и др. Methods Enzymology 65, 499 /1980/.

Конструирование и характеризация плазмиды экспрессии C5a для E.coli. Методика изолирования фрагментов ДНК и условия реакции свивания были такими же, как описаны Manialis и дp., /1982/, Molecular Cloning: a Laboratory Mannual, Cold Spring Harbor. E.coli trp промотор-оператор был первоначально получен из ptrpL1/Edman и др., /1981/ Nature 291, 503/. 360 п.ос. фрагмент E.coRI, содержащий trp промотор-операторную последовательность, используемый в плазмиде экспрессии C5a /pC5a-48/, изолировался из плазмиды экспрессии прореннина pPFZ-P2, описанной в Европейской заявке N 0147178, опубликованной 3 июля 1985 г.

Плантификация C5a в культуральной жидкости Y.lipolytica. Методика была такой же, как описана выше для прореннина, за исключением того, что в иммуноанализе были использованы козел-анти-C5a- и кролик-анти-козел /gG/ Cappel/ Антитело козел-анти-человеческий C5a получали методом Manderino и др., J. Immunol. Methods 53, 41-50 /1982/.

Векторы
pLD40 - описанный в Европейской заявке N 0128508, опубликованной 24 апреля 1985 г. (см. табл. A)
Они были депонированы в соответствии с Будапештским договором в Коллекции американского типа культур, Rochille Maryland призванная коллекция, гарантирующая неизменность депозитов и быстрый доступ к ним заинтересованных лиц, если будет выдан патент по данной заявке. В период рассмотрения данной заявки депозиты доступны лицам, которые определяются Комиссионером Ведомства по патентам и товарным знакам США в соответствии с 37 СГР 1.14 и 35 US C 122, и в соответствии с иностранными патентными законодательствами в странах, куда поданы дубликаты данной заявки или основанных на ней последующих заявок. Все ограничения на доступ к депонированным микроорганизмам будет окончательно сняты после выдачи патента.

Таксономическое исследование Y.lipolytica ATCC 20774 /идентифицированного в коллекции культур Pfizer Inc как PC 30869/ проведено д-ром J.R.DeZeeuw, который подготовил следующее описание. Использовались методики, рекомендованные J.L.Lodder в " The Yeasts", второе издание, N.Holland Publishing Co., Амстердам, 1970.

CHS599, типовая культура для вида Candida lipolytica /The Yeasts второе издание, N.Holland Publishing Co., Амстердам, 1970/ и CBS 6124, типовая культура для Saccharomcopsis lipolytica в "The Yeasts", третье издание, были взяты для сравнения. Ранее вид был также сопоставлен с Endomycopsis lipolytica. Его неполное состояние - Candida lipolytica. Таксономическое положение вида было установлено van der Walt u von Arx., Antonie van Leucwenbock 46, 517-521 /1980/. Предпочитаемое название в настоящее время Yarrowia lipolytica.

Культуральные, морфологические и физиологические характеристики штамма PC 30869 согласуются со стандартным описанием вида, указанного как Saccharomycopsis lipolytica в "The Yeasts" третье издание, под редакцией Kreger-van Rij cc. 406-408, Elsevier Science Publishing B.Y. Амстердам, 1984 (см. табл. 1)
PC-30869 был сконструирован с помощью генетически рекомбинированных подходящих мутантов Y. lipolytica PC-22208, Pfizer почвенный изолят, и Y.lipolytica PC-30026, субкультура NRRLY-1094. PC-30869 фенотипически отличается от своих родителей дикого типа следующим: /1/ не производит активной внеклеточной щелочной протеазы, /2/ требует биотина для роста и /3/ требует источник L-лейцина.

В течение дог-фазы роста PC-30869 в бульоне дрожжевой экстракт-пептон-глюкоза /ДЭНГ/ почкующиеся клетки имеют яйцевидную форму и средний размер 2,6х5,5 микрон. На ДЭНГ- агаре доминируют псевдо- и истинные мицелии. Бластоспоры присутствуют в большинстве как одиночки в плевральных положениях. Не обнаруживается каротеноидных пигментов. Культура ведет себя как "B" спаривающийся гиплоид в скрещивании с аутентичными тестовыми штаммами для вида /таблица 5/. Типичная аскоспоруляция наблюдается на агаре VB. Особенности ассимиляции углерода указаны в таблице 2 ферментация отсутствует. Ион аммония и мочевина, но не нитрат, утилизируются как единственные источники азота /таблица 3/. Штамм PC-30869 требует витаминов тиамина и D-биотина /таблица 4/. Только тиамин требуется для родителей культуры дикого типа. Никакого роста не наблюдается при 37^oC.

PC-30869 отличается от других штаммов Y.lipolytica, описанных в патентной литературе, как это следует из сравнения их фенотипов /таблицы 7 и 8/.

ATCC 20228 /Nubel и др. Патент США N 4155811/ обнаруживает вид питания дикого типа, подобно типовым штаммам для вида, CBS 599 и CBS 6124. Конкретно, он не нуждается для роста в урациле, лейцине или биотине, и он разжимает желатину.

ATCC 20620 /Dezecuw и др., патент США N 4407953/ в отличие от ATCC 20228 требует дополнительного лейцина для роста. Подобно ATCC 20228 он не нуждается в урациле или биотине. Он также разжижает желатину.

ATCC 20688 /европейская заявка N 0138508/ растет, только если в среду добавлены как урацил, так и лейцин. Эта необходимость в урациле отличает ATCC 20688 как от ATCC 20228, так и ATCC 20620, ATCC 20688 не требует биотин и разжижает желатину.

Культура PC-30869 отличается от всех вышеуказанных. Она нуждается для роста в биотине и лейцине, но не в урациле. Она не разжижает желатину.

Краткое описание чертежей
Фиг. 1 - Частичная линейная растрикционная карта перекрывающихся плазмид pLD57, pLD58 и pLD62, изолированных из штамма Y.lipolytica DL 112.

Фиг. 2 - Пробы синтетических олигонуклетидов для генар XPR2.

Из описанной последовательности для большинства первых 25 аминокислотных остатков активной протеазы /Ogrydziak и др., ук. соч./ два участка, отмеченные I и II, дают возможность конструирования 14-мер олигонуклеотидных проб с 32-кратным или меньшим вырождением. Эти два участка начинаются соответственно у аминокислот 7 и 18. Четыре различные восьмикратко вырожденные смешанные пробы были приготовлены для каждого участка, они получили номера от 170 до 186, кал показано. В изображенной предсказанной последовательности нуклеиновой кислоты "X" означает все 4 основания, "U " означает оба пурина и "Y" означает оба пиримидина.

Фиг. 3 - Нуклеотидная последовательность гена XPR2, с указанием промотора, пре /от -157 до -136/, про1 /от -135 до -98/, про2 /от -97 до -1/, щелочной внеклетечной протеазы и концевых последовательностей.

Фиг. 4 - Сконструированная последовательность для вектора-терминатора pterm 4.

Фиг. 5 - Сконструированная последовательность и рестрикционная карта плазмиды pLS - 3.

Фиг. 6 - Сконструированная последовательность и рестрикционная карта плазмиды pXX-33.

Фиг. 7 - Сконструированная последовательность и рестрикционная карта плазмиды pXX-22.

Фиг. 8 - Сконструированная последовательность и рестрикционная карта плазмиды pXX-11.

Фиг. 9 - Аминокислотная последовательность человеческого анафилатоксина C5a.

Фиг. 10 - Рестрикционная карта плазмиды pC5a-48.

Фиг. 11 - Сконструированная последовательность и рестрикционная карта плазмиды pC5aX-3.

Фиг. 12 - Нуклеотидная последовательность гена LEU2.

Фиг. 13 - Сконструированная последовательность и рестрикционная карта плазмиды pLX-34.

Анализ последовательности гена XPR2. Анализ ДНК-последовательности клонированного гена XPR2 проводился методом химической деградации /Maxam и др., 1980, Methods Enzymol, 65, 499/ на перекрывающихся фрагментах рестрикции, полученных из плазмид pLD57, pLD58, pLD62 /фиг. 1/ и pLD84 и pLD86 /см.ниже/. Результаты показали, что клонированные геномные ДНК дрожжей действительно содержат ген для внеклеточной щелочной протеазы. Нуклеотидная последовательность гена XPR2 и аминокислотная последовательность предшественника щелочной протеазы с ее сигнальной последовательностью, выведенная из нуклеотидной последовательности, показаны на фиг. З. Значительная часть аминокислотной последовательности внеклеточной протеазы была неизвестна /Ogrydziak и дp., ук.соч./ и представлена здесь впервые. Более того, последовательности, требуемые для экспрессии и выделения внеклеточной протеазы, описаны здесь в первый раз. Последовательность ДНК, кодирующая щелочную протеазу, ее предшествениика и сигнальные последовательности, состоит из 1362 пар оснований /фиг. 3/. Первичная структура этой полипептидной цепи, выводимая из нуклеотидной последовательности, должна содержать 454 аминокислотных остатка. Щелочная протеаза синтезируется в клетке в форме предшественника, который протеолитически переводится в выделяемую или готовую форму. Анализ N-концевой аминокислотной последовательности, выведенной из нуклеотидной последовательности, показал наличие сигнального пептида в молекуле предшественника. Этот сигнальный пептид содержит 22 аминокислотных остатка, и его структурные особенности подобны особенностям сигнальных пептидов высших эукариотов и прокариотоз /Perlman и др., 1983, J.mol. Biol. 167, 391. Участку в выведенной аминокислотной последовательности в согласии с известными 25 П-концевыми аминокислотами активной щелочной протеазы /Ogrydziak и др., 1982, J. Gen. Microbiol 128, 1225/ предшествуют 157 аминокислотных остатка, содержащих сигнальный пептид и два сайта расщепления трипсинового типа /Lys-Arg/. Эти сайты расщепления использовались для разделения прорегиона на про1 /от -135 до -98/ и про2 /от -97 до -1/. См.фиг. 2. Активная щелочная протеаза имеет 297 аминокислот, как следует из нуклеотидной последовательности. Аминокислотные последовательности для различных форм протеазы, выведенные из нуклеотидной последовательности, находятся в соответствии с размерами очищенных форм фермента. В дополнение к структурной последовательности предшественника щелочной протеазы были определено примерно 700 п.ос.5'-боковой последовательности и 600 п.ос. 3'-боковой последовательности. Анализ этих участков показал, что они содержат последовательности, аналогичные другим эукариотическим промоторами и терминаторам, и, вероятно, они играют существенную роль в экспрессии щелочной протеазы.

Как указано выше, методика трансформации Y.lipolytica и клонирования генов Y. lipolytica путем комплементации мутаций, включая клонирование гена XPR2, который кодирует выделяемую щелочную протеазу, путем комплементации мутации xpr2, описаны в Европейской заявке N 0138508. Методика, описанная в ней, включает трансформацию клетки-хозяина штамма Y.lipolytica частичным дайджестом BgIII библиотеки генов Y.lipolytica в вектор pLD 40. Данный вектор характеризуется тем, что он содержит в себе малый сегмент, содержащий LEU2 участок Y. lipolytica и сайты рестрикции эндонуклеазы 3EcoRI, 4EcoPV, 6AVaI, IBgIII, INcoI, IApaI, 2XLOI и IBS+XI. Один из транcформантов XPR2 Y. lipolytica был использован для извлечения гена дикого типа /pLD84 и pLD86/ из Y. lipolytica NRRL Y-1094 для применения в векторе конструирования экспрессии/выделения, как описано в Примере 1.

Анализ последовательности гена LEU2. Анализ последовательности ДНК клонированного гена LEU2 в pLD5 /Европейская заявка N 0138508/ проводился методом химической деградации /Maxam и др., 1980, Methods Enzymol 65, 499/ на перекрывающихся фрагментах рестрикции. Для определения участка, кодирующего бета-изопропилмалат Y. lipolytica /ИПМ/ дегидрогеназу, и правильной считывающей рамки была использована информация с аминокислотной последовательности, ранее определенной для гена LEU 2 S Cerevisiae/Andreadis и др., 1984, J. Biol. Chem. 259, 8059/. Участок геномной последовательности Y.lipolytica, который кодирует аминокислотную последовательность, гомологичную к участку протеиновой последовательности S.cerevisiae был идентифицирован. Нуклеотидная последовательность гена 2,8-го LEU2 и аминокислотная последовательность бета-ИПМ-дегидрогеназы, выведенная на нуклеотидной последовательности, показаны на фиг. 12. Кроме того, последовательности, требуемые для экспрессии бета-ИМП-дегидрогеназы Y. lipolytica, описаны здесь впервые. Последовательность ДНК, кодирующая этот протеин, состоящий из 405 аминокислот, содержит 1215 пар оснований /фиг. 12/. В дополнение к последовательности, кодирующей бета-ИПМ-дегидрогеназу, были определены примерно 798 п.ос.5'-боковой последовательности 797 п.ос. 3'-боковой последовательности /включая кодон окончания трансляции TAA/. Анализ этих участков показал, что они содержат последовательности, аналогичные другим эукариотическим промоторам и терминаторам, и что они имеют существенное значение для экспрессии.

5'-участок вверх по течению гена LEU2 Y.lipolytica содержит TATATATA-последовательность в 78 п.ос. перед точкой начала трансляции и в 30 п.ос. перед предполагаемой точкой начала образования мРНК. Вторая последовательность, важная для инициации транскрипции в эукариотах, представляет собой бокс CAAT, который в гене LEU2 расположен в 74 п.ос. перед предполагаемым сайтом инициации транскрипции, расположенным в 48 п.ос, от ATG /фиг. 12/.

3'-участок вниз по течению имеет последовательность от 72 до 120 нуклеотидов после стоп-кодона /TAA/, гомологичную последовательности 5'-TAG... TA/T/GT. ..TTT-3', предложенной Zaret и др., Cell 28, 563 /1982/ как имеющей важное значение для окончания транскрипции в S.Cerevisiae.

Пример 1
Использованным штаммом-хозяином был ATCC 20774 /MATB IeU2-40 bio -6 xpr2-1002/. Трансформант XPR2, Y. lipolytica ATCC 20781, определялся как колония, образующая зону на индикаторных чашках со снятым молоком после посева методом отпечатков на чашки с недостатком дейцина. Хромосомную ДНК получали из трансформанта по методу заявки EP N 0138508 и использовали для извлечения гена для выделяемой протеазы. Хромосомную ДНК частично расщепляли ферментом BgIII, сшивали для образования кольцевого фрагмента, содержащего репликон E. coli и ген устойчивости к ампициллину из вектора и использовали для трансформации E.coli. Хромосомную ДНК также расщепляли ферментом SaII и использовали в эксперименте Southern, который показал, что нормальный участок LEU2 трансформанта не был нарушен /520 п.ос. SaII к Eco RI сегменту участка LEU2 в 5' к сегменту LEU2, содержащемуся в pLD40, использовался в качестве пробы/. Поэтому, так как гомология необходима для интеграции библиотечной плазмиды в Y.lipolytica, участок XPR2 должен быть сайтом интеграции. Три перекрывающиеся, но различные плазмиды, pLD57, pLD58 и pLD62, были первоначально извлечены из Y.lipolytica ATCC 20781. Они изображены на фиг. 1. Гибридизации синтетическими олигонуклеотидными пробами гена XPR2, основанные на известной последовательности первых 25 аминокислотных остатков выделенной активной протеазы /фиг. 2 и 3/, показали, что ген выделения протеазы был клонирован. Для определения того, представляет ли извлеченный ген копию дикого типа или мутантную копию, штамм-раципиент Y.lipolytica был трансформирован в pLD58.

Так как не возникло трансформантов, положительных к протеазе, из любых лейцин-независимых трансформантов, был сделан вывод, что pLD58 содержит мутантный аллель гена.

Форма гена XPR2, присутствующая в штамме NRRL Y-1094 дикого типа, была получена в эксперименте по гибридизации колонии E.coli. В качестве пробы использовался 2 тыс.п. фрагмент PVUI - EcoRI, который, как следует из данных по секвентированию, содержит полный структурный ген. Из оригинальной библиотеки Sau3A частично расщепленных фрагментов NRRL Y-1094 ДНК в pLD40 было получено несколько колоний, гибридизируемых пробой. Две из этих колоний содержали очень сходные плазмиды, обозначенные pLD64 и pLD86, которые были использованы для получения векторов экспрессии. Обе плазмиды содержат одинаковый 5'-конец участка XPR2 - сайт Sau 3A /который был присоединен и регенерировал сайт BamHI вектора/, от которого начинается последовательность на фиг.3. Каждый содержит целиком структурный ген протеазы и предполагаемый терминатор транскрипции и включает приблизительно 4 - 5 тыс.п., введенных из участка XPR2 штамма NRRL Y-1094. Включение в pLD86 содержит дополнительно несколько сотен пар оснований на 3'- конце, Так как мы использовали 3'-цепь до сайта BgIII /2655 пар оснований/ для конструирования вектора экспрессии, две плазмиды передают одинаковую ДНК, которая функционально идентична последовательности на фиг. 3.

Конструирование векторов экспрессии/выделения. План, разработанный для получения экспрессии и выделения прореннина в Y.lipolytica, предусматривает конструирование различных гибридных генов в интегративном векторе клонирования. Подобный подход требует нескольких различных плазмид, которые содержат обширные участки общих последовательностей ДНК. Фактически была использована модулированная конструктивная схема для объединения векторов с геном прореннина, введенным в положение 3' предсказанного сайта XPR2, ответственного за сигнальный пептид, предполагаемым про1-перерабатывающим сайтом и расщепляющим сайтом-известным генератором активной щелочной протеазы. Вообще, желательно, чтобы чужеродный ген был введен между последовательностями дрожжей для промотора и терминатора экспрессии. Ясно, что N-кoнцeвaя часть последовательностей гибридного гена будет изменяться в различных конструкциях плазмид, однако последовательность структурного гена прореннина, последовательность терминатора XPR2 и челночный вектор ДНК будут одинаковы в каждой конструкции плазмиды экспрессии. Предполагалось, что одни и те же фрагменты структурного гена прореннина и терминатор/вектор-плазмида будут использованы в каждой конструкции плазмиды экспрессии, как описано ниже. Различные конструкции плазмид экспрессии/выделения прореннина различаются в участке сразу вниз по течению от промотирующей последовательности гена XPR2 по длине N-концевой последовательности предшественника щелочной протеазы, которая предшествует последовательности гена прореннина. Поэтому промотирующий фрагмент каждой плазмиды экспрессии конструировался как изменяемая последовательность в участке связи XPR2 - прореннин. Все векторы экспрессии/выделения собирались схожими реакциями связывания, содержащими три компонента.

Экспериментальные ступени, использованные для конструирования вектора-терминатора pterm4, изображены на фиг. 4. Сначала синтетический связующий присоединяли к фрагменту, содержащему 3'- конец гена XPR2, включающему сигналы окончания транскрипции и полиаденилизации. Коротко говоря, плазмиду pLD84 расщепляли эндонуклеазой KpnI и связывали синтетической двухцепочечной связующей ДНК, изображенной на фиг.4. Продукт связывания расщепляли эндонуклеазами HindIII и BgIII и фрагмент из 760 п.ос. вводили в плазмиду pLD41, линеализированную теми же двумя эндонуклеазами до образования pterm 4. Плазмиду pterm 4 идентифицировали по ее рестрикционной карте. Результаты серии рестрикционных расщеплений эндонуклеазой при использовании EcoRV, EcoRI, KpnI, BgIII-HindIII и BgIII-BcII анализировались. Расщепления дают пригодные фрагменты, подтверждающие присутствие синтетического связующего и "полного" 3'-конца гена XPR2 в челночной плазмиде pLD41, как описано в EP N 0138508. Частичная карта этого 7,3 ко вектора-терминатора показана на фиг. 4.

Конструирование плазмиды экспрессии/выделения pLS-3.

На фиг. 5, показано конструирование первоначальной плазмиды, использованной для выделения прореннина в Y.lipolytica. Ее рестрикционная карта представлена на фиг. 5. Конструирование плазмиды выделения прореннина было инициировано приготовлением фрагмента, содержащего большую часть последовательности структурного гена прореннина. Фрагмент ДНК BcII-BamHI /частичный/ из 1080 п.ос., содержащий кодирующую последовательность для остатков прореннина 6 - 365, изолировали из плазмиды экспрессии прореннина E.coli pPFZ-84A. /Плазмида pPFZ-84A является производным плазмиды экспрессии прореннина pPFZ-P2, конструкция которой описана в заявке EP N 0147178, опубликованной 3 июля 1985, и которая была получена мутагенозом, направленным синтетическим олигонуклеотидом, при использовании замещения фрагментом рестрикции. Конкретно, pPFZ-84A отличается от pPFZ-P2 только двумя парами оснований для аминокислотных остатков прореннина 214 /ASn--->Asp/ и 286 /Asp--->Gly/, чтобы кодировать так называемый аллель A прореннина, однако обе плазмиды содержат необходимую последовательность для прореннина и функционально эквивалентны в данном примере/. Фрагмент промотора XPR2, содержащий кодирующую последовательность для предшественника щелочной протеазы 1-157 и прореннина 1-5, получали следующим образом. Фрагмент HindIII-AvaI ДНК из 870 п.ос., содержащий участок промотора и 5'-конец гена щелочной протеазы, изолировали из субклона XPR2 плазмиды pLD90. Этот фрагмент связывался с синтетическим фрагментом, имеющим структуру:
5'CCGAGATTCCTGCTCTTCTAATGCCAAGCGAGCTGAGATCACTAG 3'
3'CTAAGGACGAAGAAGATTACGGTTCGGTCGACTCTAGTGATCCTAG 5'
направление считывания --->
Эта последовательность содержит липкий конец AvaI, за которым следует последовательность, кодирующая последние девять кодонов про-пептида щелочной протеазы, за которой следует последовательность, кодирующая первые четыре аминокислоты прореннина и оканчивающаяся в сайте BamHI. Фрагмент промотора получали по стандартной реакции связывания, используя синтетический фрагмент и фрагмент - HindIII-AvaI из 870 п.ос. и T4-лигазу с последующим расщеплением HindIII и BamIII. Образовавшиеся связанные последовательности очищали электрофорезом на геле полиакриламида, выделяя соответствующий фрагмент ДНК HindIII-BamHI из 916 п. cо. 3' конец гибридного гена получали из плазмиды терминатор/вектора prem4, описанной выше. Плазмида prem расщеплялись HindIII и BcII и приблизительно 7,3 тыс. п. HindIII-BcII фрагмента ДНК терминатор/вектора, содержащего терминатор XPR2, селективный маркер LEU2 и pBR322, выделяли на геле агарозы.

Плазмиду экспрессии/выделения прореннина pLS-З, собирали путем инкубирования трех фрагментов ДНК /HindIII-BcII-расщепленной плазмиды pterm4, промотора HindIII-BamIII из 916 п.ос. и фрагментов, содержащих ген прореннина HamHI-BcII из 1080 п.ос./ сконструированных, как описано выше, в присутствии T4-лигaзы /см.фиг.5/. Связанную смесь использовали для трансформации штамма ММ294 E.coli K12 по CaGl₂ -методу Dagert др., Gene 6, 23-28 /1979/. Плазмиды изолировали от выделенных траносформантов, устойчивых к ампициллину, и плазмиду pLS-3 идентифицировали до ее растрикционной карте /фиг. 6A/. Участок XPR2-прореннин этой плазмиды секвентировали для подтверждения наличия нужной последовательноcти синтетической ДНК и правильного соединения нужных фрагментов.

Получение pLD90. Эта плазмида содержит субклон из pLD84. Участок ДНК от сайта PVUI в участке промотора XPR2 до сайта EcoRI в концевом участке был субклонирован в сайт HindIII pBR322 по следующей методике. Несколько микрограмм pLD84 расщепляли двумя вышеупомянутыми ферментами рестрикции. Затем в "липкие" концы расщепленных молекул ДНК вводился Klenow фрагмент ДНК-полимеразыI. Затем киназные HindIII-связующие /CAAGCTTG из New England Biolabs добавляли к концам с помощью T4-лигазы. Избыток связующего удаляли и генерировали липкие концы HindIII последующим расщеплением ферментом HindIII. Смесь молекул ДНК разделяли на препаративном агарозном геле, отделяли нужную 2 тыс.п. группу, очищали и вводили в реакцию связывания с HindIII-расщепленным вектором pBR322, обработанным бактериальной щелочной фосфатазой. Продукт связывания использовали для трансформации компетентных E.coli, Ориентация с сайтом EcoRI терминатора XPR2, более близкая к сайту EcoRI pBR322 была названа pLD90, а обратная ориентация - pLD91.

5' конец участка промотора XPR2, который был включен в PLS-З, представляет собой сайт PVUI, приблизительно в 280 п.ос. от начала области, последовательность которой указана на фиг.3. Было обнаружено, что плазмиды, содержащие ген протеазы дикого типа под контролем только этой части промотора, при интеграции с геном в сайте, удалением от резидент-локуса xpr2, не делают трансформант способным производить большие количества протеазы /определено по зонам прояснения на чашках снятого молока/.

Мы обнаружили, что если pLS-З содержит укороченный и поэтому "недостаточный" промотор, то интегрант, возникающий при рекомбинации между плазмидой и резидент-геном XPR2 дикого типа, будет образовывать полный промотор, направляющий экспрессию продукта плавления прохимозина, но недостаточный промотор, направляющий экспрессию протеазы. Аналогичный эксперимент типа дезинтеграции гена был выполнен с актин-геном S.cerevisiae Shortle и др. Science 217:371-373 1982/. В соответствии с нашими ожиданиями некоторые лейцин-независимые трансформанты с pLS-3 были действительно недостаточны по отношению к протеазе. Трансформанты, недостаточные к протеазе, представляли собой скорее нужные интегранты в локусе XPR2, чем нежелательные побочные продукты, такие как преобразователи гена в LEU2. Со штаммом-реципиентом ATCC 20688 мы обнаружили, что нерасщепленная pLS-3, генерировала 6,5% протеаза-недостаточных трансформантов, тогда как SnaBI- расщепленная плазмида давала приблизительно 70% протеаза-недостаточных трансформантов. Аспект дезинтеграции гена при этой трансформации был использован для того, чтобы избежать необходимости в большом количестве Southern точечных экспериментов для нахождения правильного интегранта среди всех трансформантов.

Плазмиды, содержащие структурный ген протеазы дикого типа под контролем промотора XPR2 /начинающегося, как указано на фиг. 3/, дают возможность экспрессии значительного количества протеазы, если интегрированы в клетки Y. lipolytica в сайте, ином, чем локус xpr2. Однако для эффективной экспрессии чужеродных генов этим видом интегрантом может потребоваться дальнейшая модификация этого контрольного участка ДНК.

Выделение прореннина. Штамм ATCC 20688 Y.lipolytica был трансформирован нерасщепленной pLS-3 ДНК и SnaBI- расщепленной pLS-3 ДНК для получения xpr^-Leu⁺ и трансформантов ATCC 20775 /DL114/ я ATCC 20776 /DL 148/ соответственно. Эти трансформированные штаммы высевались в тест-пробирку, содержащую среду ДЭПД. Клетки выращивались в течение ночи при 28^oC. Аликвоту /250 мкл/ этих культур разбавляли 1:100 в 25 мл среды ГПП. Клетки выращивались во встряхиваемой колбе при 28^oC в течение 16-18 часов до возникающей абсорбции 5,0 - 7,0 при X 600 нм и отбирались центрифугированием. Образующаяся культуральная жидкость или суперенант исследовались на присутствие прореннина путем концентрирования сумернатанта и нанесения концентрата на SDS - PAGE. Плиточный воск электрофоретически переносился на нитроцеллюлозную бумагу в присутствии 20 мМ трис-основания, 150 мМ глицина, 20% метанола при 500 mamp в течение 2 часов при 4^oC. Удаление протеина из плиточного геля проверялось окрашиванием с Coomassie blue.

Нитроцеллюлозную бумагу высушивали при 37^oC и обжигали при 65^oC в течение 1 часа, затем промывали в TBS /200 мМ NaCl, 50 мм трис-HCl, pH 7,5/. Бумагу затем инкубировали при комнатной температуре 30 минут в TBS, содержащем 10% лошадиной сыворотки /Gibco, Chagrin Falls, Ohio/, с последующей инкубацией в TBS, содержащем 10% лошадиной сыворотки, и соответствующим разведением антитела прореннина в течение 16 часов при комнатной температуре. Бумагу затем три раза промывали в TBS с последующей инкубацией в TBS, содержащем 10% лошадиной сыворотки, с последующей инкубацией в течение 2 часов в TBS, содержащем 10% лошадиной сыворотки, и соответствующим разведением антитела козел-антикролик IgG, сопряженного с пероксидазой лошадь-кролик. Бумагу затем промывали три раза в течение 10 минут в TBS и проявляли в присутствии 4-xлop-1-нaфтoлa /3 мг/мл в метаноле/, добавленного к концентрации 0,5 мг/мл в TBS, содержащем 0,01% перекиси водорода. Присутствие прореннина молекулярного веса 40000 было подтверждено в обоих супернатантах.

После кислотной активации концентрированных супернатантов культуры /см. выше/ значительная активность по свертыванию молока присутствовала в образцах, приготовленных из трансформированных культур ATCC 20775 и 20776, содержащих pLS-З. Как ожидалось, активность по свертыванию молока не обнаружена в супернатантах контрольной культуры штамма-реципиента Y. lipolytica ATCC 20688.

Конструирование плазмиды экспрессии/выделения pXX-33.

Модификация для превращения pLS-3 в усовершенствованную плазмиду экспрессии pXX-33 изображена на фиг.6. Такая модификация увеличивает участок промотора XPR2 на 280 п.оc. Как в случае pLS-3, плазмида экспрессии pXX-33 содержит гибридный ген, кодирующий весь препро-пептид /157 аминокислотных остатков/ щелочной протеазы, присоединенный к полной структурной генной последовательности прореннина.

Перед конструированием плазмид экспрессии/выделения прореннина с последовательностью промотора XPR2 на 280 п.ос. больше, чем в pLS-3, было необходимо субклонировать фрагмент рестрикции, содержащий полный ген щелочной протеазы, в сайт HindIII Этот субклон был собран путем добавления синтетических связующих к фрагменту рестрикции, выделенному из клона XPR2 геномной библиотеки pLD86. Конструирование этого субклона XPR2 с сайтом вверх по течению HindIII было инициировано приготовлением фрагмента ДНК, содержащего весь ген щелочной протеазы. 2,3 тыс.п. фрагмент/частичный/ EcoRI-BamIII из геномного участка клона XPR2 pLD-86 был очищен электрофорезом на агарозном геле и связан с синтетическим фрагментом, имеющим последовательность
5'GATCGAACCTTC 3'
3' TTCGAACTTAA 5'
Эта связующая последовательность содержит липкий конец BamHI /но не регенерирует сайт BamBI/, за которым следует сайт HindIII и за которым липкий конец EcoRI. Плазмида pXHP-24 была идентифицирована по ее рестрикционной карте и стала источником фрагментов промотора XPR2 для будущих конструкций экспрессии.

В плазмиде pXHP-24 субклонированный ген XPR2 содержит приблизительно на 280 п.ос. больше 5'последовательность промотора XPR2, чем последовательность промотора XPR2, содержащаяся в pLS-3. Первый фрагмент промотора был получен стандартной реакцией связывания при использовании синтетического фрагмента ДНК /описанного выше для pLS-3/ и фрагмента HindIII-AvaI с 1150 п.ос. из pXHP-24 и T4 лигазы с последующим расщеплением HindIII и BamHI. Образующиеся связанные последовательности очищали гель-электрофорезом, выделяя фрагмент HindIII-BamHI приблизительно из 1196 п.ос. Второй фрагмент, содержащий последовательности, кодирующие аминокислотные остатки прореннина 6 - 151 получали pLS-3 расщеплением BamHI и XmaI и очисткой на геле образующегося фрагмента ДНК HamIII и XmaI из 440 п.оc. Третий фрагмент, содержащий остальную часть гена прореннина, терминатор XPR2 и последовательности вектора получали из pLS-3 расщеплением HindIII и XmaI и очисткой на геле фрагмента вектора HindIII и XmaI приблизительно из 8,0 тыс.п. Эти три фрагмента затем связывали, используя стандартную методику, описанную выше. Реакцию связывания использовали для трансформации штамма MM294 E.coli K12. Плазмиды изолировали из трансформантов, отобранных на основе устойчивости к ампициллину, и плазмиду pXX-33 идентифицировали по ее рестрикционной карте /фиг. 6/. Протеаза-прореннин-участок этой плазмиды секвентировали для подтверждения правильного соединения нужных фрагментов.

Y.lipolytica ATCC 20774 затем трансформировали pXX-33, расщепленной SnaBI, для получения Y. lipolytica ATCC 20780 и прореннин, выделенный трансформированными культурами в культуральный бульон, анализировали, как описано выше в случае pLS-3. Было подтверждено присутствие прореннина в культуральном супернатанте.

После кислотной активации концентрированных культуральных супернатантов /см. выше/ значительная активность по свертыванию молока наблюдалось в образцах, приготовленных из трансформормированной культуры Y.lipolytica ATCC 20780.

Конструирование плазмиды экспрессии/выделения pXX-22
Экспериментальные ступени, использованные для конструирования плазмиды экспрессии/выделения pXX-22, показаны на фиг. 7. Вектор экспрессии отличается от pLS-3 в двух отношениях. Подобно pXX-33, он содержит дополнительный сегмент последовательности промотора XPR2 из 280 п.ос. Во-вторых, он содержит последовательность, кодирующую сигнальный пептид щелочной протеазы и только 38 аминокислотных остатков про-пептида /про1/.

План конструирования pXX-22 был аналогией использованному для pXX-33. Первый фрагмент промотора был получен по стандартной реакции связывания при использовании фрагмента HindIII и BgIII из 890 п.ос. из pXHP-24 и синтетического фрагмента с последовательностью
5' GATCTTGCTGAGATCACTAG 3'
3' AACGACTCTAGTGATCCTAG5'
и T4 лигазы с последующим расщеплением HindIII и BamHI. Образующиеся связанные последовательности очищали гель-электрофорезом, выделяя фрагмент ДНК HindIII и BamIII из 920 п.ос. Второй фрагмент, кодирующий остатки прореннина 6 - 151 изолировали из pLS-3 расщеплением BadHI и XmaI и очисткой на геле образующегося фрагмента ДНК BamIII и XmaI из 440 п.ос. Третий фрагмент, содержащий остальную часть гена прореннина, терминатор XPR2 и векторные последовательности, получали расщеплением pLS Hind и XmaI, и очисткой на геле фрагмента вектора приблизительно в 8,0 тыс.п. Затем эти три фрагмента ДНК связывали, используя стандартную методику, описанную выше. Реакцию связывания использовали для трансформации штамма MM294 E.coli K12. Плазмиды изолировали из отобранных трансформантов и плазмиду pXX-22 идентифицировали по ее растрикционной карте /фиг. 7/.

Y. lipolytica ATCC 20774 затем трансформировали pXX-22,расщепленной S на B1, для получения Y.lipolytica ATCC 20779, и прореннин, выделяемый в культуральный бульон трансформированными культурами, анализировали, как описано выше в случае pLS-2. Присутствие прореннина в культуральном супернатанте подтверждалось согласно методике, описанной выше. После кислотной активации концентрированных культуральных супернатантов /см.выше/, значительная активность по свертыванию молока наблюдалось в образцах, приготовленных из трансформированной культуры Y.lipolytica ATCC 20779.

Конструирование плазмиды экспрессии/выделения pXX-11
Экспериментальные ступени для конструирования плазмиды экспрессии/выделения прореннина pXX-11 изображены на фиг.8. Эта плазмида содержит последовательность для промотора XPR2 и сигнальный пептид из 22 аминокислотных остатков, присоединенный к последовательности, кодирующей прореннин. План конструирования, использованный для pXX-11, был подобен использованному для pXX-22 и pXX-33. Коротко говоря, фрагмент промотора получали по стандартной реакции связывания при использовании фрагмента ДНК HindIII-BgIII из pXHP-24 приблизительно с 750 п.ос. и синтетического фрагмента с последовательностью
5' TTGGССGCТССССТGGССGССССТGССGСTGAGATCACTAG 3'
3' AAGACCGGCGAGGGGACCGGCGGGGACGGCGACTCTAGTGATCCTAG 5' --->
и T4 лигазы с последующим расщеплением HindIII-BamHI. Образующиеся связанные последовательности очищали гель- электрофорезом, выделяя фрагмент ДНК HindIII-BamIII из 790 п.ос. Второй фрагмент, кодирующий остатки прореннина, 6 - 151 изолировали из pLS-3 расщеплением BamHI и XmaI и очисткой на геле образующегося фрагмента ДНК BamHI-XmaI и из 440 п.ос. Третий фрагмент, содержащий остальную часть структурного гена прореннина, терминатор XPR2 и последовательности челночного вектора, получали расщеплением pLS-3 и HindIII и XmaI и очисткой на геле фрагмента вектора приблизительно в 8,0 тыс.п. Затем эти три фрагмента ДНК связывали, используя стандартную методику, описанную выше. Реакцию связывания использовали для трансформации штамма MM294 E.coli K12. Плазмиды изолировали из отобранных трансформантов и плазмиду pXX-11 и идентифицировали по ее рестракционной карте /фиг.8/. Часть XPR2 - прореннин этой плазмиды секвентировали для подтверждения нужной последовательности синтетической ДНК и правильного соединения нужных фрагментов.

Y. lipolytica ATCC 20774 затем трансформировали pXX-11, расщепленной SnaB1, для образования Y.lipolytica 20778 и прореннин, выделенный в культуральную среду трансформированными культурами, анализировали, как описано выше в случае pLS-3. Присутствие прореннина в культуральном супернатанте подтверждалось согласно вышеописанной методике.

Анализы на свертываемость молока /см.выше/ показали, что имеется значительная активность по свертыванию молока в культуральном супернатанте трансформантов ATCC 20778, содержащих pXX-11.

Пример 2
Ген BIO дикого типа, соответствующий bio-6 аллелю в ATCC 20774 клонировали путем комплементации следующим образом. Библиотека генов частично Sa и 3A-расщепленной хромосомной ДНК Y.lipolytica, введенной в BamIII сайт pLD40 /которая представляет собой pBR322 плюс LEU2 в сайте EcoRI/, была сконструирована и приготовлено большое количество библиотечной ДНК как плазмидного препарата смешанной культуры E.coli /это та же самая библиотека, что была использована для клонирования генат XPR2/. Несколько микрограмм библиотечной ДНК расщепляли ферментом ApaI /который расщепляет одну связь в участке LEU2/. Затем эту ДНК использовали для трансформации ATCC 20774 /LEU2 xpr2 bio/ и трансформированные смеси высевались на синтетической среде с недостатком лейцина. Были получены десятки тысяч лейцин-независимых трансформантов. Чтобы обнаружить колонии, если они есть, содержащие библиотечные плазмиды, включающие ген BIO, лейцин-независимые трансформаты методом отпечатков высевались на агаровые чашки, содержащие биотин-селективную среду /рецептура на литр: 25 мг дестибиотина, 20 г глюкозы, 5 г сульфата аммония, 1 г KH₂PO₄, 0,5 г MgSO₄•7H₂O, 0,1 г CaCl₂, 0,1 г NaCl, 500 мкг борной кислоты, 400 мкг тиамин. HCl, 400 мкг ZnSO₄•7H₂O, 400 мкг MnSO₄•H₂O, 200 мкг Na₂MgO₄•2H₂O, 200 мкг FeCl₃•6H₂O, 100 мкг KI и 40 мкг CuSO₄•5H₂O/.

Один из нескольких Y. lipolytica BIO-трансформантов, растущий на биотин-селективной среде, был назван DL31. Затем приступили к извлечению плазмиды библиотеки генов, содержащей ген BIO из штамма DL 31 Y.lipolytica. Была приготовлена хромосомная ДНК из культуры штамма DL 31. Несколько микрограммов этой хромосомной ДНК расщепляли ферментом рестрикции ApaI для того, чтобы вырезать библиотечную плазмиду. Аликвоту расщепленной ДНК использовали в реакции связывания для циркулиризации неизвестной библиотечной плазмиды. Продукт связывания затем использовали для трансформации культуры E. coli к устойчивости к ампициллину путем введения неизвестной BIO-содержащей плазмиды в E.coli. Было получено немного трансформантов E.coli, устойчивых к ампициллину. На трансформантах E.coli было приготовлено немного препаратов плазмид. Рестрикционные дайджесты таким образом полученной плазмидной ДНК показывают, что неизвестная BIO-содержащая плазмида эквивалентна pLD40 с введением в сайт BamHI. Эта плазмида должна быть первоначально происходить из нашей библиотеки генов и была названа pLD51.

Плазмида pLD56 была образована как субклон pLD51 путем удаления гена LEU2 на pLD51, следующим образом. Аликвоту плазмиды pLD51 расщепляли ферментом EcoRI для удаления участка LEU2. Расщепленную ДНК использовали в реакции связывания ДНК для рециркуляризации плазмиды. Затем была выполнена трансформация E. coli для клонирования меньшей BIO-содержащей плазмиды. Один из ампициллин-устойчивых трансформантов E.coli, как показано, содержащая ожидаемую меньшую плазмиду, которая была названа pLD56. Было выполнено несколько рестрикционных расщеплений LD56. BIO-содержащий сегмент pLD56, который обнаруживается как вставка в BamH1 сайт pBR322, имеет длину приблизительно 3,6 тыс.п.

Очень грубая рестрикционная карта вставки ДНК Y.lipolytica из 3,6 тыс.п. в BamHI сайт pBP322 /включая pLD56/ описана ниже с указанием в скобках примерного расстояния в парах оснований от начала вставки. Оценка расстояний сделана из немногих анализов на агарозных гелях и, возможно, содержит относительно большие количественные погрешности: PvuН/800/, PvuII/1200/, PstI/1800/, MIuI/2000/, PstI/2300/, EcoRU/2700/, NcoI/3200/ для ориентации: SaII сайт pBP322 будет предшествовать описанным сайтам и сайт HindIII будет следовать за ними.

Штамм ATCC 20774 /MATB Leu2-40 bio-6 xpr2-1002/ трансформировали интактной pLD56 /pBR322 плюс приблизительно 3,6 тыс.п. хромосомной ДНК Y.lipolytica, содержащей ген BIO/. Три различных биотин-независимых трансформанта испытывали на высокочастотную трансформацию NruI-расщепленную /мишень для PKR322/pLD40/LEU2 на pBR322/ относительно родительского штамма для определения, который из них содержал резидент pBR322, интегрированный в участок BIO. Все три показали способность к высокочастотной трансформации ввиду интеграции pLD40 в резидент pBP322. Это было подтверждено Southern точечным экспериментом по гибридизации. Один из трех исходных BIO-трансформантов Y.lipolytica был назван DL118 и использован далее как реципиент ДНК. Вышеупомянутая рестрикционная карта требовалась для установления
а/ что использовать в качестве BIO-специфичной пробы гибридизации /область NcoI-PvuII/,
б/ какой фермент требуется, чтобы правильно вырезать плазмиду pLD56 /MIUI/,
в/ какой фермент расщепляет только одну связь в области pBR322 /CIaI/, и
г/ какой фермент не расщепляет плазмиду вообще /ApaI/.

Southern Гибридизация CIaI и ApaI дайджестов ДНК на ATCC 20774 и DL118 /испытанная с BIO-фрагментом/ показала, что, как ожидалось, биотин-участок DL118 /при сравнении с BIO-участком ATCC 20774/ был разрушен добавлением ДНК размера приблизительно pLD56. MIUI дайджесты ДНК DL118 /проба с pBR322/ показали далее, что добавка была того же размера, как интактная pLD56.

Конструирование плазмиды экспрессии/выделения pLX-34
Была сконструирована плазмида экспрессии, которая содержит последовательность, кодирующую прореннин, с сигналами выделения XPR2 /препропоследовательности из 157 аминокислот/ вниз по течению от промотора LEU2. Эта плазмида экспрессии демонстрирует, что может быть использован иной, чем XPR2 промотор для достижения выделения чужеродных протеинов. Кроме того, этот вектор экспрессии способен вызвать экспрессию/выделение независимо от сайта интеграции в геноме Y.lipolytica. Успешное выделение прореннина с промотором, иным, чем промотор XPR, демонстрирует возможность конструкции вектора экспрессии для идентификации альтернативных новых сильных промоторов в Y. lipolytica. В дополнение к этому данный подход может быть использован для получения культуры экспрессии с двумя отдельными гибридными генами прореннина, один экспрессируемый промотором LEU2, а другой - промотором XPR2, интегрированными в различных сайтах генома хозяина.

Экспериментальные ступени, использованные для конструирования вектора экспрессии, который содержит ген прореннина с сигналами выделения щелочной протеазы /препропоследовательность XPR2 157 аминокислот/, выражаемыми последовательностями промотора LEU2, изображены на фиг. 13. Конструирование этой плазмиды было инициировано приготовлением фрагмента промотора LEU2, содержащего около 300 пар оснований 5'-нетранслированной последовательности, предшествующей кодону инициации трансляции ATG гена бета-изопропилмалатдегидрогеназы /фиг. 12/. Фрагмент ДНК HindIII-FokI 300 п.ос., кодирующий участок из 270 п. ос. последовательности промотора LEU2, был выделен из челночного вектора pLD40. Этот фрагмент был связан с синтетическим связующим из 54 п.ос., имеющим последовательность

T4 лигазой с последующим расщеплением HindIII. Образующиеся связанные последовательности очищали гель-электрофорезом, выделяя фрагмент ДНК HindIII-BgII приблизительно из 360 п.ос. Второй составляющий фрагмент, кодирующий остальную часть препропоследовательности XPR2 и первые 152 аминокислоты прореннина, изолировали из плазмиды экспрессии pXX-33 /фиг.6/ расщеплением BgII и XmaI и очисткой на геле образующегося фрагмента ДНК из 887 п. ос. Третий фрагмент, содержащий остальную часть гена прореннина, терминатор XPR2 и последовательности вектора, приготовляли расщеплением pXX-33 HindIII и XmaI и очисткой на геле, выделяя приблизительно 8,5 тыс.п. фрагмента вектора. Три фрагмента ДНК связывались при использовании стандартной методики, описанной выше. Реакция связывания использовалась для трансформации штамма ^HB101 E.coli K12. Плазмиды изолировали из трансформантов, отобранных на основе устойчивости к ампициллину, и плазмиду pLX-34 идентифицировали по ее рестрикционной карте /фиг. 13/.

Y. lipolytica ATCC 20794 /DL118/ трансформировали Nru-расщепленной ДНК рX-34 для получения Y.lipolytica ATCC 20795 /DL251/ и прореннин, выделенный в культуральную жидкость лейцин-независимыми трансформантами культуры, анализировали, как описано выше в случае pLS-З. Данная методика трансформации обеспечивала интеграцию pLX-34 в последовательность pBR322, предварительно введенную в bio локус в хромосоме хозяина /описано выше/. Интеграция pLX-34 в этот сайт была подтверждена Southern анализом.

Использование DL118 в качестве реципиента
Southern эксперименты по гибридизации выполнялись следующим образом.

NruI дайджесты ДНК из трансформантов DL118 /гибридизованных прохимозиновой пробой, например, когда входящая плазмида представляла плазмиду экспрессии прохимозина/ точно вырезали вошедщую плазмиду. Несколько нанограмм NruI-расщепленной трансформирующей плазмиды использовались для проверки правильности размера гибридизирующейся полосы. Также MIuI дайджесты /MIUI не расщепляют трансформирующую плазмиду/ ДНК из этих трансформантов /проба с 32p-помеченной pBR322/ показали, что резидентная pBR322 последовательность DL 118 была разрушена при добавлении одной или более молекул трансформирующей плазмиды. Это показывает, что интеграция произошла в нужном сайте.

Трансформированную культуру Y.lipolytica ATCC 20795 /DL 251/ выращивали в среде ДЭНД при 22^oC, чтобы благоприятствовать экспрессии промотора LEU2. Присутствие прореннина в культуральных супернатантах было подтверждено анализом на свертываемость молока /см.выше/ культуральных супернатантов, активированных кислотой, и проверялось иммуно-точечным анализом /см.выше/. Эти результаты показывают, что этот гибридный ген представляет собой независимую единицу экспрессии, способную к экспрессии/выделению при интеграции в сайт, иной чем XPR2 или LEU2. Это позволяет сконструировать культуру экспрессии с множественными гибридными генами, потенциально способными увеличивать уровень внеклеточного прореннина.

Пример 3
Последовательность синтетического гена для человеческого C5a.

План, разработанный для достижения бактериальной продукции человеческого анафилатоксина C5a, был аналогичен предыдущим методам, использованным для синтеза и экспрессии EGF, как описано в EP, заявка N 0147178. В нем применялось конструирование гена, в котором кодирующая последовательность для активированного дополнительного компонента C5a, приготовлялась синтетически. Зная аминокислотную последовательность человеческого C5a, мы сконструировали фрагмент ДНК, кодирующий информацию для его 74 аминокислот /фиг. 9/. Синтетическая генная последовательность была выбрана, чтобы максимизировать утилизацию предпочтительного кодона E. coli и S.cerevisiae и обеспечить несколько сайтов растрикции эндонуклеазой для облегчения характеризации. Данный подход дает возможность прямой экспрессии анафилатоксина в E.coli путем введения кодона инициации ATG для синтеза протеина перед триплетом, кодирующим первую аминокислоту полипептида C5a. Для облегчения его введения в нужной ориентации в плазмиду pBR322, был сконструирован синтетический ген C5a, содержащий сайты EcoRI и Hind III узнавания эндонуклеазы рестрикции на своих концах. Для получения конечной генной последовательности C5a были синтезированы фосфорамидатным методом десять 47-меров и соединены в двухцепочечный фрагмент ДНК из 235 п.ос. Фрагмент гена C5a вводили в соответствующим образом расщепленную pBR322 и клонированный ген идентифицировали путем рестрикционного анализа плазмидной ДНК из произвольно выбранных трансформантов. Несколько клонов C5a затем анализировали секвентированием ДНК для идентификации клона с правильной последовательностью. Нужная нуклеотидная последовательность для участка гена C5a была найдена в 2 из 5 исследованных клонов.

Бактериальная экспрессия человеческого C5a. Конструирование плазмиды экспрессии C5a было инициировано расщеплением субклона C5a эндонуклеазой рестрикции EcoRI с последующим дефосфорилированием обработкой бактериальной щелочной фосфатазой. Используя фрагмент ДНК EcoRI из pPFZR2 с 360 п.ос., содержащий trp промотор-оператор и последовательности сайта, связывающего рибосому, была сконструирована плазмида экспрессии C5a. Компетентные клетки штамма HBIOI E.coli трансформировали реакцией связывания. Несколько устойчивых к лекарствам колоний от каждой трансформации очищали и их плазмидные ДНК подвергали анализу с помощью рестрикционной эндонуклеазы для идентификации ДНК с trp промотором в ориентации, которая будет проявляться в транскрипции гена C5a. Множественные изоляты из этой реакции связывания были идентифицированы с помощью плазмид, содержащих ген анафилатоксина, примыкающей к последовательности бактериального промотора в конфигурации, требуемой для прямой экспрессии C5a. Растрикционная карта плазмиды экспрессии C5a p C5a-48 представлена на фиг. 10.

Экспрессия и выделение человеческого анафилатоксина в Y.lipolytica
Вектор экспрессии/выделения pC5aX-3, кодирующий выделение человеческого анафилатоксина C5a, был приготовлен по методике, изложенной в Примере 1 для pXX-33. Y.lipolytica ATCC 20774 затем трансформировали этим вектором выделения и человеческий C5a, продуцированный трансформированными культурами, анализировали, как описано выше, за исключением того, что в иммуноточечной методике были использованы козел-анти-C5a и кролик-анти-козел IgG. Для плазмиды, описанной в данном примере, было подтверждено наличие C5a в культуральном супернатанте.

Конструирование плазмиды экспрессии/выделения pC5aX-3.

Экспериментальные ступени для конструирования плазмиды экспрессии/выделения анафилатоксина рC5aХ-3 показаны на фиг.11. Эта плазмида содержит последовательность для "полного промотора XPR2 и сигнала из 157 аминокислотных остатка и про-пептид, присоединенный к синтетической последовательности, кодирующей 74 аминокислотных остатка C5a. План конструирования, использованный для C5aX-3, был подобен использованному для pXX 33. Сначала плазмид pXHP-24 /или другую плазмиду, содержащую нужную последовательность/ расщепляли HindIII и AvaI и фрагмент из 1150 п.ос., содержащий промотор XPR2, очищали на геле. Второй фрагмент, содержащий 3' конец про-пептида XPR2 и последовательность структурного гена C5a, получали по стандартной реакции связывания при использовании фрагмента ДНК HinfI-HindIII с приблизительно 220 п.ос. из плазмиды экспрессии E.cоli pC5a-48 и синтетического фрагмента с последовательностью
5'CCGAGATGCCTGCTICTTCTAATGCCCAAGCGA 3'
3'CTAAGGACGAAGAAGATTACGGTTCGGTTGA 5'
и T4 лигазы с последующим расщеплением AvaI и HindIII. Образующиеся связанные последовательности очищали гель-электрофорезом, отбирая фрагмент AvaI-HindIII из около 250 п.ос. фрагмент HindIII-AvaI, содержащий промотор, и фрагмент AvaI-HindIII кодирующий C5a, затем связывают T4 лигазой с последующим расщеплением HindIII. Фрагмент приблизительно в 1,4 тыс.п. очищали на геле и использовали для связывания с HindIII расщепленным pterm /описанным выше/. Продукт реакции связывания использовали для трансформации штамма MM294 E.coli K12. Плазмиды, отобранные по устойчивости к ампициллину, изолировали из отобранных трансформантов и плазмиду pC5aX-2 идентифицировали по ее рестрикционной карте. Штамм Y.lipolytica PC-30869, ATCC 20774 затем трансформировали SнаВI расщепленной рC5aХ-3 и анафилатоксин, выделенный в культуральную среду трансформированными культурами, анализировали, как описано выше. Присутствие C5a в культуральном супернатанте было подтверждено по вышеописанной методике.

Известно, что многие протеины, которые синтезируются рибосомами, связанными с эндоплазмической сетью, производятся в виде гликопротеинов. Действительно, гликосилирование может оказывать влияние на выделение данного протеина. N-связанное гликосилирование эукариотических протеинов происходит в трипептидных последовательностях аспарагин-X-треонии и аспарагин-X-серин, где X может быть любой аминокислотой, кроме, возможно, аспарата /Hubbard S. и др. 1981, Ann. Rev. Biochem. 50, 555/. Аминокислотная последовательность прореннина включает два таких трипептида, однако гель-электрофоретический анализ прореннина, выделяемого в культурах Y.lipolytica, не показывает наличия гликосилирования. В других выделяемых эукариотических протеинах не все аспарагин-X-треонин/серин сайты гликосилированы. Видимо, определенные аспарагины в трипептидных последовательностях не гликосилируются, так как они недоступны ферментам гликосилирования. В случае человеческого C5a аминокислотная последовательность включает отдельный сайт гликосилирования или трипептидную последовательность /Asn-IIe-Ser/, которая обычно содержит сложный олигосахарид, присоединенный к аспарагину /Ternandez H и др. 1976, J. Immunol 117, 1688/. Часть молекул C5a, выделяемых в культуральную среду Y. lipolytica как представляется, гликосилирована, так как широкая область антигенной активности наблюдается в высокомолекулярной части иммуноточечного анализа. Данная гетерогенная электрофоретическая мобильность аналогична наблюдаемой для других выделяемых протеинов и, вероятно, является следствием различий в степени добавления углеродов. По настоящему изобретению очевидное гликосилирование определенных выделяемых чужеродных протеинов предполагает, что экспрессия и выделение будут полезны для получения многих обычно гликосилированных эукариотических протеинов.

Данное изобретение относится к технологии получения протеинов с использованием рекомбинантных штаммов дрожжей Yarrowia lipolytica. Предложены нуклеотидные последовательности гена ХРR2: сигнальная, рrо-1 последовательность, рrо-2 последовательность, промотор, терминирующая последовательность. Также предложены штаммы дрожжей Yarrowia lipolytica, продуцирующие прореннин и человеческий анафилатоксин С5а. Изобретение позволяет получать высококачественный продукт в легко отделяемой форме. 15 с.п. ф-лы, 13 ил., 9 табл.

1. Нуклеотидная последовательность гена XPR2 Yarrowia lipolytica, представляющая собой последовательность 1, приведенную в графической части. 2. Нуклеотидная последовательность, используемая для экспрессии гетерологичного белка Yarrowia lipolytica, причем указанная нуклеотидная последовательность представляет собой сигнальную последовательность гена XPR2 Yarrowia lipolytica, имеющую последовательность 2, приведенную в графической части. 3. Нуклеотидная последовательность, используемая для экспрессии гетерологичного белка Yarrowia lipolytica, причем указанная нуклеотидная последовательность представляет собой pro1-последовательность гена XPR2 Yarrowia lipolytica, имеющую последовательность 3, приведенную в графической части. 4. Нуклеотидная последовательность, используемая для экспрессии гетерологичного белка Yarrowia lipolytica, причем указанная нуклеотидная последовательность представляет собой pro2-последовательность гена XPR2 Yarrowia lipolytica, имеющую последовательность 4, приведенную в графической части. 5. Нуклеотидная последовательность, используемая для экспрессии гетерологичного белка Yarrowia lipolytica, причем указанная нуклеотидная последовательность представляет собой промотор гена XPR2 Yarrowia lipolytica, имеющую последовательность 5, приведенную в графической части. 6. Нуклеотидная последовательность, используемая для экспрессии гетерологичного белка Yarrowia lipolytica, причем указанная нуклеотидная последовательность представляет собой терминирующую последовательность гена XPR2 Yarrowia lipolytica, имеющую последовательность 6, приведенную в графической части. 7. Штамм дрожжей Yarrowia lipolytica ATCC 20780 - продуцент прореннина, являющийся трансформантом Yarrowia lipolytica ATCC 20774 плазмидой pXX-33. 8. Штамм дрожжей Yarrowia lipolytica ATCC 20779 - продуцент прореннина, являющийся трансформантом Yarrowia lipolytica ATCC 20774 плазмидой pXX-22. 9. Штамм дрожжей Yarrowia lipolytica ATCC 20778 - продуцент прореннина, являющийся трансформантом Yarrowia lipolytica ATCC 20774 плазмидой pXX-11. 10. Штамм дрожжей Yarrowia lipolytica ATCC 20777 - продуцент человеческого анафилатоксина С5а, являющийся трансформантом Yarrowia lipolytica ATCC 20774 плазмидой pC5aX-3. 11. Штамм дрожжей Yarrowia lipolytica ATCC 20775 - продуцент прореннина, являющийся трансформантом Yarrowia lipolytica ATCC 20688 неусеченной плазмидой pLS-3. 12. Штамм дрожжей Yarrowia lipolytica ATCC 20776 - продуцент прореннина, являющийся трансформантом Yarrowia lipolytica ATCC 20688 SnaBI-расщепленной плазмидой pLS-3. 13. Штамм дрожжей Yarrowia lipolytica ATCC 20795 - продуцент прореннина, являющийся трансформантом Yarrowia lipolytica ATCC 20794 NruI-расщепленной плазмидой pLX-34. 14. Штамм дрожжей Yarrowia lipolytica ATCC 20794, используемый в качестве исходного материала для трансформации NruI-расщепленной плазмидой pLX-34 и получения Yarrowia lipolytica ATCC 20795. 15. Штамм дрожжей Yarrowia lipolytica ATCC 20774, используемый в качестве исходного материала для трансформации плазмидой pXX-33, pXX-22, pXX-11, pLD56 или pC5aX-3.