ЖИДКИЕ ИММУНОГЛОБУЛИНОВЫЕ ПРЕПАРАТЫ Российский патент 2000 года по МПК A61K39/395 

Изобретение относится к стабильным препаративным формам иммуноглобулинов.

Известно несколько способов получения иммуноглобулиновых препаратов, в частности форм IgG для внутривенного вливания (вв-IgG), из фракций плазмы человеческой крови. Для того, чтобы продукт являлся пригодным для внутривенного вливания, необходимо удалить или предотвратить образование аггрегатов, которые обладают антикомплементарной активностью и которые при внутривенном вливании могут создавать угрозу возникновения тяжелых побочных реакций, включая анафилактический шок. Большинство вв-IgG препаратов, пригодных для клинического применения, являются лиофилизированными (высушенными замораживанием), что повышает их стабильность при хранении, однако такие препараты перед использованием должны быть разведены разбавителем, например стерильной водой или солевым раствором. Эта стадия разведения является трудоемкой и длительной и открывает возможность для инфицирования продукта. Поэтому желательно производить фармацевтические препараты вв-IgG, которые пригодны для хранения и применения в жидкой (водный раствор) форме и которые обладают необходимой степенью стабильности при таком хранении. Такие препараты будут именоваться далее как жидкие препаративные формы вв-IgG. Некоторые из таких препаративных форм уже производятся в коммерческом масштабе.

Несмотря на то, что продукты IgG для внутривенного вливания содержат только очень небольшие количества аггрегатов (молекул тримеров или полимеров IgG с большим числом звеньев), они, тем не менее, могут содержать довольно большие количества димеров IgG, что может быть определено, например, посредством жидкостной хроматографии высокого разрешения (ЖХВР). Такие димеры не создают угрозы анафилактического шока и, как правило, не представляют из себя проблему. На практике, как правило, в большинстве спецификаций мономеры и димеры указываются совместно под таким заголовком, как "функциональный IgG".

Было установлено (Tankersley et al., Molecular Immunology 25? 41-48, 1988), что содержание димеров в препаратах IgG выше, чем у большинства доноров, образовывавших плазменный пул, из которого получали IgG. Поэтому димер не может быть обнаружен в IgG, полученном от отдельного донора, и является относительно низким в гипериммунном IgG, полученном от нескольких сотен или нескольких тысяч доноров, которые были иммунизированы против специфического антигена заболевания, но в то же время он достигает высоких уровней в IgG, полученном из донорских пулов 10000 или более доноров. Авторы делают заключение о том, что димеры IgG являются димерами идиотип-антиидиотип, которые образуются тогда, когда антитело одного донора узнает антиген-связывающую область антитела от другого донора и связывается с ним. Димеры и мономеры находятся в равновесии, а содержание димера возрастает с ростом общей концентрации иммуноглобулина.

Эти же авторы установили, что образование димеров усиливается при хранении; содержание димеров в обычном препарате может удваиваться в течение первой недели хранения, а затем продолжает медленно возрастать. Если препарат IgG подвергают лиофилизации вскоре после получения, это предотвращает увеличение образования димеров. Однако, если препарат предназначен для хранения и применения в жидкой форме, то концентрация димера в ходе хранения будет возрастать.

Такой же тип образования димеров может иметь место у иммуноглобулинов, отличных от IgG, например, у IgA, IgD и IgE. Кроме того, образование димеров наблюдают также в препаратах моноклональных антител, хотя механизм образования димеров в MAbs может отличаться от предложенного в указанной выше работе (Tankersley et al., Molecular Immunology 25. 41-48, 1988).

Авторами настоящего изобретения установлено, что хотя IgG димер, в отличие от высших полимеров, не вызывает анафилактического шока, тем не менее препараты IgG с высоким содержанием димеров характеризуются худшей переносимостью при внутривенном вливании и могут являться причиной нежелательных побочных эффектов, включая лихорадку, тошноту и иногда снижение кровяного давления. Гипотензивные побочные эффекты были обнаружены на крысиной модели (Bleeker et al. Vox Sanguinis 52. 281-290, 1987), что также свидетельствует о наличии очевидной корреляции с содержанием димеров. Поэтому желательно стабилизировать препараты иммуноглобулинов, в частности жидкие препаративные формы вв-IgG, для предотвращения образования димеров.

Для стабилизации вв-IgG и повышения его переносимости при вв-вливании было использовано несколько добавок. К таким добавкам относятся: глицин; дисахариды, например мальтоза и сахароза; сахарные спирты, например сорбитол; полиэтиленгликоль; либо небольшие количества сурфактантов, такие как ПЭГ-20-сорбитанмоноолеат или ПЭГ-10-нонилоксифенол. Однако было установлено, что ни один из этих традиционных стабилизаторов не является достаточно эффективным при ингибировании образования димеров в жидких препаративных формах вв-IgG.

Поскольку содержание димеров является функцией концентрации IgG, то, конечно, возможно понизить содержание димеров путем разведения жидких препаратов IgG. Этот подход не является, тем не менее, приемлемым, поскольку требует вливания больших объемов жидкости пациентам.

Согласно настоящему изобретению проблему решают путем добавления в препарат иммуноглобулина эффективного количества амфифильного стабилизатора.

Описываемый согласно настоящему изобретению жидкий иммуноглобулиновый препарат содержит один или более амфифильных стабилизаторов, не являющихся тенсайдными и имеющих в молекуле одну или несколько групп, выбранных из карбоновой кислоты, сульфоновой кислоты, кето-, альдегидной, гидрокси-, амино- или амидной групп; а также одну или несколько липофильных групп, содержащих от 3 до 12 атомов углерода и, возможно, один атом азота или серы, в общем количестве по меньшей мере 0,2 ммоль на грамм иммуноглобулина и в общей концентрации по меньшей мере 20 ммоль/литр, причем по меньшей мере один амфифильный стабилизатор представляет собой никотиновую кислоту или производное никотиновой кислоты.

Предпочтительно жидкий иммуноглобулиновый препарат представляет собой жидкий препарат иммуноглобулина G для внутривенного вливания.

Преимущественно производным никотиновой кислоты является никотинамид.

Обычно по меньшей мере один из амфифильных стабилизаторов выбирают из фенилаланина, метионина, лейцина, изолейцина, пролина, валина или производного любого из этих соединений, у которых карбоксильная группа замещена группой формулы -CONH₂, -CONHR, -CH₂ОН или - COOR, где R является С_1-4алкилом.

Предпочтительным является по меньшей мере один амфифильный стабилизатор, выбранный из пролина, лейцина и изолейцина. Наиболее предпочтительным является содержание в препарате пролина и никотинамида.

Как правило, молярное соотношение никотинамида и общего количества амфифильных аминокислот находится в пределах между 1:1 и 1:4.

Наиболее предпочтительно, чтобы препарат содержал никотинамид, пролин и изолейцин в качестве единственных амфифильных стабилизаторов в молярном соотношении 1:(0,8-2,0):(0,8-2,0).

Как правило, жидкий препарат имеет pH между pH 5 и pH 6.

Амфифильные стабилизаторы, применяемые согласно изобретению, представляют собой вещества, которые содержат внутри молекулы сильно или умеренно гидрофильную область, а также сильно или умеренно липофильную область, которые не являются тенсайдными, т.е. они не образуют мицеллы в водном растворе при концентрациях, в которых они применяются, а сохраняют мономерную форму. Амфифильные стабилизаторы содержат внутри молекулы одну или несколько групп, выбранных из карбоновой кислоты, сульфоновой кислоты, фосфорной кислоты (все в виде свободной кислоты или фармакологически приемлемой соли), кето-, альдегидо-, гидрокси-, амино- или амидогрупп; а также одну или несколько липофильных групп, содержащих от 3 до 12 атомов углерода, предпочтительно от 4 до 10 атомов углерода, и, как правило, один атом азота или серы. Эти группы предпочтительно выбирают из алкильных групп с прямой или разветвленной цепью, алкенильных групп с прямой или разветвленной цепью и ароматических, гетероароматических, алифатических или гетероалифатических колец.

Если атом азота расположен в липофильной группе, то он предпочтительно является третичным, например, в пиридиновом кольце. Предпочтительными нециклическими липофильными группами являются алкильные группы с разветвленной цепью, содержащие от 4 до 10, предпочтительно от 4 до 6 атомов углерода.

Очевидно, что любое соединение, применяемое в качестве стабилизатора для вв-IgG, должно само по себе быть фармацевтически приемлемым для внутривенного вливания в применяемых концентрациях. Предпочтительно также, чтобы оно не вызывало химических изменений в молекуле IgG и чтобы оно не обладало значительной буферной емкостью при значениях pH между pH 4 и pH 8.

Предпочтительными амфифильными стабилизаторами являются никотиновая кислота и ее производные, например, никотинамид, N-оксид никотинамида и N'-метилникотинамид, из которых наиболее предпочтительным является никотинамид.

Следующей предпочтительной группой амфифильных стабилизаторов являются α-аминокислоты естественного происхождения, имеющие незаряженные липофильные боковые цепи, а также производные таких аминокислот, у которых карбоксильная группа замещена группой формулы -CONH₂, -CONHR, -CH₂ОН или - COOR, где R является С_1-4алкилом. Такими аминокислотами являются фенилаланин, метионин, лейцин, пролин и валин, из которых предпочтительны фенилаланин, пролин, лейцин и изолейцин; особенно пролин, лейцин и изолейцин; наиболее предпочтителен пролин.

Описаны (публикация патента Японии N 61-194035) жидкие препараты гамма-глобулина, которые подвергают тепловой обработке в присутствии стабилизатора, являющегося моносахаридом, дисахаридом или сахарным спиртом, в количестве 10-100 г/100 мл, и ауксилярного стабилизатора, который может представлять собой нейтральную аминокислоту, например валин, лейцин или изолейцин, либо соль карбоновой кислоты.

В настоящем изобретении предложен жидкий иммуноглобулиновый препарат, в частности жидкий препарат иммуноглобулина G, для внутривенного вливания, содержащий один или более амфифильных стабилизаторов, описанных здесь, в общем количестве по меньшей мере 0,2 ммоль на грамм иммуноглобулина и в общей концентрации по меньшей мере 20 ммоль/литр, при условии, что если препарат содержит 100 г/л или более моносахарида, дисахарида или сахарного спирта, то по меньшей мере один амфифильный стабилизатор не является нейтральной аминокислотой или солью карбоновой кислоты, и его предпочтительно выбирают из никотиновой кислоты и ее производных.

Предпочтительными стабилизаторами являются составы, содержащие никотинамид совместно с одним или более упомянутых амфифильных аминокислот или их производных. Более предпочтительные стабилизирующие составы содержат никотинамид и пролин, возможно совместно с одной или более дополнительных амфифильных аминокислот. Наиболее предпочтительными составами являются смеси (а) никотинамида и пролина; (б) никотинамида, пролина и изолейцина; и (в) никотинамида, пролина, изолейцина и лейцина. Предпочтительно, чтобы в таких составах молярное отношение никотинамида к общему количеству амфифильных аминокислот лежало в пределах от 1:1 до 1:4. Наиболее предпочтительным составом является смесь никотинамида, пролина и изолейцина, предпочтительно в молярном соотношении 1:(0,8-2,0):(0,8-2,0).

Иммуноглобулин, стабилизированный согласно изобретению, может представлять собой любой препарат IgA, IgD, IgE или IgG, либо поликлональный, либо моноклональный, выделяемый либо из плазмы крови человека или животных, либо получаемых другими способами, например посредством гибридомной технологии или технологии рекомбинантной ДНК. Предпочтительно он является препаратом IgG из плазмы человеческой крови, подвергнутым обработке, делающей его пригодным для внутривенного вливания, который предназначен для хранения и применения в жидкой форме. Более предпочтительно, чтобы он представлял собой поливалентный, интактный иммуноглобулин, который не был подвергнут гидролизу (например, посредством высоких концентраций пепсина) и который сохраняет структурную и функциональную целостность 7S-IgG антител, включая интактную F_c область. Предпочтительно, чтобы его получали из фракций сыворотки крови посредством модифицированного спиртового криоосаждения, включая обработку низкими концентрациями пепсина при pH 4.

Содержание IgG в жидком препарате предпочтительно варьирует между 3% и 16%, более предпочтительно - между 6% и 12%. pH раствора предпочтительно варьирует от pH 4 до pH 8, более предпочтительно от pH 5 до pH 6, особенно от pH 5,2 до pH 5,4. При таких относительно кислых значениях pH важно, чтобы раствор имел низкую буферную емкость для предотвращения любого значительного понижения pH крови реципиента при внутривенном вливании. Тоничность раствора может быть доведена до физиологических значений путем добавления одного или нескольких незабуферивающих веществ, например хлорида натрия, глицина, сахарозы, мальтозы и сорбита. Такие жидкие препараты могут быть введены путем внутривенного вливания, например в дозе 0,2-1,0 г IgG на кг веса тела в сутки.

Количество амфифильного стабилизатора, присутствующего в составах согласно изобретению, предпочтительно составляет от 0,2 до 6 ммоль на грамм IgG, более предпочтительно - от 1 до 3 ммоль/г IgG. Иммуноглобулиновые препараты могут содержать также другие протеины, например альбумин.

Жидкий препарат вв-IgG согласно изобретению, содержащий амфифильный стабилизатор, может храниться до 2 лет при температурах от 2^oC до 25^oC без увеличения содержания димеров до нежелательных уровней. Такие препараты хорошо переносятся при внутривенном вливании.

Растворы вв-IgG, предназначенные для лиофилизации и хранения в твердой лиофилизированной форме, также могут быть стабилизированы путем добавления амфифильных стабилизаторов согласно изобретению для уменьшения образования димеров в течение периода времени между изготовлением и лиофилизацией.

Следующие примеры иллюстрируют изобретение:
А. Препаративная процедура для жидкого препарата вв-IgG
Сырую пасту IgG, полученную путем спиртового фракционирования объединенной плазмы человеческой крови, растворяют в стерильной воде при 4^oC и фильтруют. Раствор подкисляют до pH 4 и инкубируют с небольшим количеством пепсина при pH 4, 37^oC, а затем нейтрализуют. Затем продукт диафильтруют для удаления оставшегося спирта, после чего pH доводят до pH 5,3 и концентрируют раствор путем ультрафильтрации, получая конечную концентрацию белка от 6% до 15% в/об.

Продукт также может быть получен известным способом (патент Швейцарии N 684164).

Б. Измерение содержания димеров
Продукт анализируют посредством ЖХВР на Hewlett Packard HP 1090, применяя TSK G3000SW-XL колонку размерами 7,8 х 300 мм с 0,04 М фосфатным буфером и 0,2 М хлоридом натрия с pH 7,0 в качестве подвижной фазы. Скорость протока составляет 0,7 мл/мин. Наносят образец раствора с концентрацией 150 мг/мл объемом 1,3 мкл, белок определяют по УФ поглощению при 280 нм. Автоматически измеряют площади пиков, соответствующих аггрегату (характерное время удержания 8-9 мин), димеру (9-10,5 мин) и мономеру (10,5-13,5 мин), и определяют содержание димеров по формуле:

где ПА, ПД и ПМ представляют собой площади пиков аггрегата, димера и мономера, соответственно.

В. Тест на стабильность
Жидкие препараты вв-IgG хранят при температуре окружающей среды (20-25^oC) в запаянных контейнерах в течение 80-90 суток, а затем в конце этого периода измеряют содержание димеров.

Пример 1
К 1 литру стандартного жидкого препарата, приготовленного согласно А и с содержанием белка, составляющим 15%, и pH, равным 5,3, добавляют 24,75 г фенилаланина (150 ммоль/л, 1 ммоль/г белка).

Данные о стабильности для примера 1 и для дополнительных примеров 2-16 согласно изобретению совместно со сравнительными примерами А-Д, не содержащими добавок или содержащими только глицин, представлены в таблицах 1 и 2, приведенных ниже. Приводимая ниже таблица 3 представляет результаты тестирования четырех жидких препаратов, каждый из которых содержит 12% белка, в крысиной гипотензивной модели, как это описано Bleeker и др. (Vox Sanguinis 52. 281-209, 1987), после хранения при комнатной температуре. Препараты согласно изобретению (примеры 17-19) давали только 5-18% снижения кровяного давления, в то время как нестабилизированный препарат давал снижение приблизительно 50%.

Изобретение относится к области медицины. Представлены иммуноглобулиновые препараты, в частности препараты иммуноглобулина G, для внутреннего вливания, подвергнутые стабилизации для предотвращения образования димеров посредством добавления одного или нескольких амфифильных стабилизаторов. Предпочтительными амфифильными стабилизаторами являются производные никотиновой кислоты, в частности никотинамид, и б-аминокислоты естественного происхождения, имеющие липофильную боковую цепь, например фенилаланин, пролин, лейцин и изолейцин. Техническим результатом изобретения является расширение арсенала средств, относящихся к иммунокомпетентным веществам. 9 з.п.ф-лы, 3 табл.

1. Жидкий иммуноглобулиновый препарат, содержащий один или более амфифильных стабилизаторов, не являющихся тенсайдными, отличающийся тем, что они содержат в молекуле одну или несколько групп, выбранных из карбоновой кислоты, сульфоновой кислоты, кето-, альдегидной, гидрокси-, амино- или амидной групп, а также одну или несколько липофильных групп, содержащих от 3 до 12 атомов углерода и, возможно, один атом азота или серы, в общем количестве по меньшей мере 0,2 ммоль на грамм иммуноглобулина и в общей концентрации по меньшей мере 20 ммоль/л, причем по меньшей мере один амфифильный стабилизатор представляет собой никотиновую кислоту или производное никотиновой кислоты. 2. Препарат по п.1, отличающийся тем, что представляет собой жидкий препарат иммуноглобулина G для внутривенного вливания. 3. Препарат по пп.1 и 2, отличающийся тем, что производным никотиновой кислоты является никотинамид. 4. Препарат по пп.1 - 3, отличающийся тем, что по меньшей мере один из амфифильных стабилизаторов выбирают из фенилаланина, метионина, лейцина, изолейцина, пролина, валина или производного любого из этих соединений, у которых карбоксиальная группа замещена группой формулы -CONH₂, -CONHR, -CH₂OH или -COOR, где R является C_1-4 алкилом. 5. Препарат по п.4, отличающийся тем, что по меньшей мере один амфифильный стабилизатор выбирают из пролина, лейцина и изолейцина. 6. Препарат по п.5, отличающийся тем, что содержит пролин и никотинамид. 7. Препарат по п.6, отличающийся тем, что молярное соотношение никотинамида и общего количества амфифильных аминокислот находится в пределах между 1 : 1 и 1 : 4. 8. Препарат по п.7, отличающийся тем, что содержит никотинамид, пролин и изолейцин в качестве единственных амфифильных стабилизаторов. 9. Препарат по п.8, отличающийся тем, что указанные стабилизаторы присутствуют в молярном соотношении 1 : (0,8-2,0) : (0,8-2,0). 10. Жидкий препарат по пп.2-9, отличающийся тем, что имеет pH между pH 5 и pH 6.