СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НИТРАТОВ И НИТРИТОВ В МОЧЕ Российский патент 2000 года по МПК G01N33/52 G01N33/493 

Изобретение относится к клинико-диагностическим исследованиям и предназначено для определения в биологических жидкостях, в частности в моче, конечных продуктов обмена оксида азота, - нитритов и нитратов.

Нитраты и нитриты в моче определяли L.C. Green co авторами (Analysis of nitrate, nitrite and [N¹⁵] nitrate in biological fluids; Anal. Biochem, 1982, 126, 131 - 138) с применением автоматизированной системы, позволяющей восстанавливать под высоким давлением нитраты в нитриты в тефлоновых колонках, набитых кадмием. Образовавшиеся нитриты определяли различными способами, в частности с применением реактива Грисса.

Для восстановления нитратов в нитриты фирма World precision instruments (США) предлагает кадмиевый редуктор K^oWPI (Nitrolyser TM) с инструкцией его использования.

Однако указанные приборы весьма дороги, быстро выходят из строя и часто дают противоречивые результаты, что делает их недоступными для широкого применения в клинике в современных условиях.

Целью изобретения явилась разработка нового практичного способа определения нитратов и нитритов на основе недорогих и доступных отечественных материалов.

Эта цель достигается тем, что 2%-ным раствором сернокислого кадмия заливают гранулы цинка и образующийся на поверхности цинка в виде пористой пленочки кадмий снимают шпателем, переносят в дистиллированную воду, тщательно промывают, слегка растирают в фарфоровой ступке до получения частиц размером 0,3 - 0,8 мм, кадмий промывают водой, затем 0,1 N HCl, вновь водой и вносят под водой в стеклянную колонку толщиной 0,9 - 1,0 см до формирования столбика пористого кадмия на высоту 13 - 15 см; колонку промывают 25 мл 0,1 N HCl, 50 мл дистиллированной воды, 25 мл разбавленного 1 : 9 аммиачного буфера pH = 9 - 10 и наносят 2 мл мочи, разведенной 1 : 9 аммиачным целым буфером pH = 9 - 10, дают ей прокапать со скоростью не более 1,5 мл в мин, промывают дважды по 10 мл дистиллированной водой, подкисляют HCl до pH = 3 - 4, доводят общий объем элюата до 25 мл и в 3 мл этого раствора определяют колориметрическим методом с использованием реактива Грисса содержание нитрита, образованного из нитрата пробы при прохождении ее через кадмиевый столбик.

Одна колонка с учетом поддержания кадмиевого столбика на одном уровне может работать длительное время. Сама процедура определения не превышает 30 - 40 мин. Такие колонки могут заменить дорогие продажные кадмиевые редукторы, что дает значительный экономический эффект.

Способ поясняется следующими конкретными примерами его осуществления.

Пример 1. Взяли мочу здорового человека, собранную с 7 час. вечера до 7 утра и определили общий объем, который составил 700 мл, затем к 1 мл мочи прилили 9 мл неразбавленного аммиачного буфера pH - 9,6 и 2 мл этого раствора пропустили через колонку, набитую пористым кадмием для восстановления нитратов мочи в нитриты. Пористый кадмий приготовили путем нанесения 2%-ного раствора сернокислого кадмия на гранулы цинка. Образующийся на поверхности цинка кадмий в виде пористой пленочки сняли шпателем и перенесли в дистиллированную воду, тщательно промыли, слегка растерли в фарфоровой ступке для получения частиц 0,3 - 0,8 мм, промыли водой, затем 0,1 N HCl и вновь водой. Внесли суспензию кадмия в стеклянную колонку толщиной 0,9 - 1,0 см до формирования столбика кадмия на высоту 13 - 15 см. Промыли колонку 25 мл 0,1 N HCl, 50 мл дистиллированной воды, 25 мл разбавленного 1 : 9 аммиачного буфера pH = 9,6. Дали пробе полностью прокапать со скоростью не более 1,5 мл в мин. После этого колонку дважды промыли по 10 мл дистиллированной водой, элюат пробы вместе со смывными водами собрали в 25 мл колбу, 1 N HCl довели pH до 3-х и общий объем довели до 25 мл. К 3 мл этого раствора прилили 0,3 мл 10% реактива Грисса, растворенного в воде. Смесь стояла при комнатной температуре и через 20 мин колориметрировали на фотоэлектроколориметре при длине волны 520 нм в кювете толщиной 1 см против контроля, содержащего вместо пробы дистиллированную воду. Определили величину поглощения, в данном случае она равнялась 0,290, нашли содержание нитритного азота по калибровочной кривой с азотистым натрием, пересчитали содержание этого соединения в 1 мл мочи, а затем в общем объеме (700 мл) мочи, что составило 7,7 мг.

Были проведены исследования содержания нитритов в моче 12 здоровых лиц в возрасте от 18 до 60 лет. Размах колебаний находился в пределах от 4,5 до 11,8 мг нитритного азота на весь объем выделяемой человеком мочи в период от 7 вечера до 7 утра, т.е. за сутки.

Указанные колебания содержания нитритного азота были приняты за норму.

Пример 2. Готовили аммиачный буфер с колебаниями pH от 3-х до 12, нитрат калия 0,001 М развели в 4 раза буфером конкретного pH и 2 мл этого раствора внесли в редукционную колонну, перед этим уравновешенную буфером тоже pH. В дальнейшем повторялась процедура, описанная выше. Выяснилось, что восстановление нитрата калия в нитрит лучше всего идет в пределах pH от 9 до 10, причем оптимум для исследования - 9,6.

Пример 3. У больной К. с острым гепатитом собрали с 7 вечера до 7 утра мочу и определили в ней содержание нитратов способом, как описано в примере 1. Конечное содержание нитритного азота в данном случае составило 50,4 мг.

Это указывает на то, что воспалительный процесс в данном случае в печени протекает с повышением скорости синтеза оксида азота, что отразилось увеличением продуктов его преобразования в моче.

Пример 4. У больной М. с хроническим гепатитом анализ содержания нитратов в моче, проведенный по вышеописанной методике показал незначительное их повышение - 14,0 мг нитритного азота в сутки, что косвенно указывает на незначительное повышение скорости синтеза оксида азота при хроническом течении болезни.

Таким образом, данные, представленные в примерах 3 и 4, указывают на возможность использования предлагаемого способа для дифференциального диагноза заболевания, в данных случаях острого или хронического гепатита.

Этот метод позволяет косвенно определить содержание оксида азота, быстро окисляемого в организме млекопитающих и проявляемого в моче в виде нитратов. Оксид азота (за открытие которого в 1998 г. была присуждена Нобелевская премия) непрерывно вырабатывается в организме млекопитающих. Он регулирует артериальное давление и является одним из факторов неспецифической защитной системы организма. Нарушения его обмена являются главной причиной необратимости септического шока и одной из причин аутоиммунных, демиелинизирующих и других хронических болезней. Поэтому клиническое значение заявляемого способа трудно переоценить.

Проблема определения оксида азота в биологических жидкостях млекопитающих (или нитратов и нитритов, что косвенно свидетельствует о его содержании) стояла давно, а клинически приемлемый метод определения нитратов и нитритов в моче практически не применялся в широкой медицинской практике исключительно в связи с отсутствием простого и недорогого при широком лабораторном использовании способа исследования их содержания. Выше уже отмечалось, что практикуемый метод восстановления нитратов в нитриты на зарубежных кадмиевых стержнях не только дорог, но не достоверен вследствие того, что повторное использование стержней дает ошибку показателя до 20 и более процентов, что естественно не позволяет сравнивать результаты исследования, в целом снижает диагностическую ценность методики, что приводит на практике к ее дискредитации.

Заявляемый способ определения нитратов и нитритов в моче выгодно отличается от прототипа стабильностью получаемых результатов, что является на сегодня абсолютно не очевидным для широкого круга врачей-лаборантов и клиницистов, работающих в этой области. Совершенно не очевидным и новым моментом в этом способе явилась обнаруженная в результате длительных экспериментальных исследований возможность изготовления стабильного редуктора, позволяющего получать сопоставимые данные исследования при многократном использовании одной и той же колонки, заполненной пористым кадмием, как при динамическом наблюдении одного и того же больного, так и в группе разных больных, например, страдающих однотипной патологией. Особенностью и новым элементом способа служит обнаруженная способность более длительного сохранения свойств редукционной колонки давать стабильные результаты благодаря возможности постоянного хранения кадмия в колонке под слоем 0,1 N HCl. При повторном применении колонка промывается строго однотипно по разработанному и описанному в данной заявке способу.

Казалось бы относительно простой в методическом отношении лабораторный прием позволил коренным образом изменить значимость диагностического исследования в клинике, причем эта значимость в принципе известна, но не могла быть широко использована вследствие отсутствия достоверного при многократном клиническом повторении метода исследования содержания нитратов и нитритов в биологических жидкостях.

В настоящее время клиническая медицина получает новый, не очевидный для специалистов в данной области способ диагностики одного из важных показателей обмена при самых различных патологических состояниях.

Способ доступен всем клинико-диагностическим лабораториям, существующим в лечебно-профилактических учреждениях, и может быть внедрен в практику непосредственно по описанию данного изобретения.

Изобретение может быть использовано в медицине, а именно в клинико-диагностических исследованиях, для определения нитратов и нитритов в моче. В собранной с 7 вечера до 7 утра моче человека определяют общий объем, разводят 1:9 аммиачным буфером pH 9,6 и 2 мл этого раствора вносят в редукционную колонку, представляющую собой стеклянную трубку толщиной 0,9 - 1,0 см, набитую пористым кадмием, приготовленным путем нанесения 2%-ного раствора сернокислого кадмия на гранулы цинка. Образующийся на поверхности цинка в виде пористой пленочки кадмий снимают шпателем, переносят в дистиллированную воду, промывают, слегка гомогенизируют в фарфоровой ступке, вновь промывают водой, 0,1 N HCl и водой. Вливают суспензию кадмия в стеклянную колонку толщиной 0,9 - 1,0 см, дают сформироваться столбику пористого кадмия на высоту 13 - 15 см, последовательно промывают 0,1 N HCl, водой и аммиачным буфером pH 9,6. Дают пробе прокапать, смывают дважды 10 мл дистиллированной водой и доводят общий объем элюата до 25 мл и определяют колориметрическим методом с использованием реактива Грисса содержание нитрита, образованного из нитрата пробы при прохождении ее через кадмиевый столбик. Способ более практичен, экономичен, осуществляется при помощи недорогих и доступных отечественных материалов и во всех клинико-диагностических лабораториях.

Способ определения нитратов и нитритов мочи, отличающийся тем, что 2% раствором сернокислого кадмия заливают гранулы цинка и образующийся на его поверхности в виде пористой пленочки кадмий снимают шпателем, переносят в дистиллированную воду, тщательно промывают, слегка растирают в фарфоровой ступке до получения частиц размером 0,3 - 0,8 мм, кадмий промывают водой, затем 0,1 N HC1, вновь водой и вносят под водой в стеклянную колонку толщиной 0,9 - 1,0 см до формирования столбика пористого кадмия на высоту 13 - 15 см; промывают 25 мл 0,1 N HC1, 50 мл дистиллированной воды, 25 мл разбавленного 1: 9 аммиачного буфера pH 9 - 10 и наносят 2 мл мочи, разведенной 1:9 аммиачным целым буфером, дают ей прокапать со скоростью не более 1,5 мл/мин, промывают дважды по 10 мл дистиллированной водой, подкисляют HC1 до pH 3 - 4, доводят общий объем элюата до 25 мл и в 3 мл этого раствора определяют колориметрическим методом с использованием реактива Грисса содержание нитрита, образованного из нитрата пробы при прохождении ее через кадмиевый столбик.