СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НИТРОЗОСОЕДИНЕНИЙ И НИТРИТА В БИООБЪЕКТАХ Российский патент 2010 года по МПК G01N33/68 

Изобретение может быть использовано в биохимическом анализе при оценке содержания метаболитов NO - одного из универсальных регуляторов разнообразных биохимических и физиологических процессов. Оценка уровня этих метаболитов, как и самого оксида азота, может дать важные сведения о метаболизме и механизмах биологического действия NO, что имеет как научное, так и прикладное значение (медицина, сельское хозяйство).

В организме животных и человека генерация оксида азота приводит к появлению S-нитрозотиолов (RS-NO) и динитрозильных комплексов железа (ДНКЖ), обеспечивающих защиту оксида азота от действия супероксида. Тем самым реализуется возможность депонирования оксида азота в организме и его транспорт между клетками и тканями. При этом RS-NO и ДНКЖ могут выступать не только как доноры NO, но и как доноры ионов нитрозония (NO⁺) и Fe(NO)₂ групп, влияющих на активность различных белков и ферментов, т.е. выступать в качестве специфических сигнальных молекул. Окисление NO супероксидом приводит к образованию нитрита и нитрата. Нитрит в отличие от менее активного нитрата также может выступать в качестве депо оксида азота и тем самым оказывать влияние на метаболические процессы. Но он значительно менее эффективен в этом качестве, чем RS-NO и ДНКЖ [Rassaf, Т., Preik, М, Kleinbongard, P., Lauer, Т., Hei, Ch., Strauer, В-Е., Feelisch, М., and Kelm M. J.Clin. Invest., 2002, 109, 1241-1248].

Используемые в настоящее время методы позволяют определить только общий пул доноров NO. Они включают в себя методы, основанные на прямой регистрации выделяющейся NO (а) по включению NO в железодитиокарбаматные ловушки с образованием парамагнитных мононитрозильных комплексов железа с дитиокарбаматами, регистрируемые методом электронного парамагнитного резонанса [Vanin, A.F., Huisman, A., and van Faassen, Е., Methods in Enzymology, 2002, 359, 27-42], (б) по связыванию NO с его флюоресцентными ловушами [Tarpey, М; Wink, D.; Grisham M. Am. J. Physiol. Regul. Integr Сотр. Physiol, 2004, 286, R431-R444], (в) по образованию хемилюминесцирующих продуктов реакции NO с озоном [Doerr, R.; Gates, R.; Fiddler, W., J. Assoc. Off. Anal. Chem., 1982, 65, 616-618]).

Эти методы подвержены серьезным артефактам из-за множества субстанций, конкурирующих за NO с ловушками, а также различной эффективности соединений как доноров NO [Lima, Е.; Bonini, М.; Augusto, О.; Barbeiro, Н.; Souza, Н.; Abdalla, D., Free Radic. Biol. & Med., 2005, 39, 532-539]. Кроме того, эти методы регистрируют NO вне зависимости от источника ее продукции.

Методы, основанные на взаимодействии конкретных соединений со специфическими реагентами, требуют подготовки и очистки образца и сопряжены с серьезными артефактами, поскольку такие соединения как нитрозотиолы, ДНКЖ не являются стойкими. Эти недостатки широко известны, и многие исследователи делают попытки их минимизировать путем подбора более специфичных реагентов и минимизации модифицирующего воздействия [Tsikas, D., Anal. Chem., 2000, 72, 4064-4072].

Распространен способ обнаружения нитрозотиолов, связанный с их разрушением под воздействием тяжелых металлов и регистрации выделившейся NO⁺ либо по количеству образовавшегося нитрита посредством классического метода Грисса [Tarpey, М; Wink, D.; Grisham M. Am. J. Physiol. Regul. Integr Сотр. Physiol, 2004, 286, R431-R444], либо при помощи специфических флюоресцентных ловушек на NO⁺.

Чувствительность при использовании метода Грисса - 0,5 мкМ, при использовании ловушек - 50 нМ [Wink DA, Kim S, Coffin D, Cook JC, Vodovotz Y, Chistodoulou D, Jourd'heuil D, and Grisham MB. Methods Enzymol, 1999, 301, 201-211]. Этот способ может считаться прототипом предлагаемого. Но в идеале нужен способ, основанный на каких-то специфических свойствах немодифицированных нитрозосоединений в физиологических или близких к таковым условиях, чтобы избежать упомянутых выше артефактов.

Задачей данного изобретения является разработка способа, позволяющего количественно определять в биообъектах полный спектр пула соединений, являющихся депо окиси азота, без какой-либо их предварительной модификации, в физиологических или близких к таковым условиях и не уступающего прототипу по чувствительности и избирательности. Предлагаемый нами способ основан на способности компонентов этого пула - ДНКЖ, RSNO и нитрита специфически ингибировать активность каталазы, что позволяет получить сведения как об общем пуле депонированного NO, так и о вкладе конкретных компонентов в этот пул.

Нами установлено, что ДНКЖ, RSNO и нитрит способны ингибировать фермент каталазу. Их ингибирующий эффект имеет одинаковую эффективность и одинаковые зависимости от концентрации вещества-ингибитора, от рН среды, от концентрации галоид-ионов - последние на 2 порядка повышают эффективность ингибирования. Это существенно отличает их от других известных ингибиторов каталазы.

Вместе с тем, ингибирование каталазы перечисленными компонентами пула NO характеризуется некоторыми оособенностями, которые и позволяют оценить их долю в этом пуле. Так, ингибирующее действие ДНКЖ резко ослабляется при добавлении в реакционную среду о-фенантролина в присутствии оксигемоглобина. Объясняется это тем, что о-фенантролин и его производные, как сильные хелаторы двухвалентного железа, разрушают ДНКЖ [Severina, I.; Bussygina, О.; Pyatakova, N.; Malenkova, I.; Vanin, A., Nitric Oxide, 2003, 5,155-163], a высвободившиеся молекулы NO в присутствии оксигемоглобина перехватываются им, что и приводит к снятию ингибирующего действия ДНКЖ на каталазу. Эта особенность ингибирующего действия ДНКЖ на каталазу и позволяет определить его наличие в пуле NO. В отличие от ДНКЖ RSNO и нитрит сами по себе не подвержены влиянию смеси оксигемоглобин-о-фенантролин. Оценить их вклад в пул NO можно используя способность RSNO превращаться в ДНКЖ при нейтральных значениях рН при их взаимодействии с ионами двухвалентного железа и тиолов [Vanin, A.; Muller, В.; Alencar, J.; Lobysheva, I.; Nepveu, F.; Stoclet, J-C. Nitric Oxide, 2002, 7, 194-209]. Это превращение не характерно для нитрита, что и позволяет, вводя в среду оксигемоглобин, а затем о-фенантролин, оценить вклад RSNO и нитрита в пул депонированного NO. Перечисленные способы разделения вклада ДНКЖ, RSNO и нитрита иллюстрируются данными, приводимыми в таблице 1 (см. Приложение), и ниже изложенном тексте. Таким образом, мы можем

1) определить общее количество нитрозосоединений, используя их способность ингибировать каталазу;

2) количественно разделить нитрит, нитрозотиолы и ДНКЖ, основываясь на утрате ими этого свойства под действием определенных факторов, специфических для каждой группы соединений (таблица 1).

Определение основано на биохимических свойствах исходных немодифицированных соединений. Чувствительность метода - до 50 нМ. Предлагаемый способ не требует никакой предварительной очистки образца и создания среды, модифицирующей исследуемые соединения (закисление, взаимодействие со специфическими реагентами). Эти преимущества предлагаемого метода перед применяемыми в настоящее время будут продемонстрированы ниже на ряде примеров, в которых сравниваются данные различных методов:

- по определению заранее известных концентраций нитрозосоединений в водном растворе и экзогенно добавленных в биологические объекты;

- по определению содержания эндогенных нитрозосоединений в биообъектах.

НЕОБХОДИМЫЕ РЕАКТИВЫ

40 мМ р-р KH₂PO₄ (или NaH₂PO₄);

1,5 М маточный раствор NaCl;

25 мкМ маточный водный раствор нитрита (натрия либо калия) - для калибровки;

гемолизированные эритроциты коровы, полученные путем разбавления крови дистиллированной водой в 10 раз;

перекись водорода (3% р-р).

Динитрозильный комплекс железа с глутатионом (ДНКЖ-GS) синтезировали в реакции газообразного NO с 5 мМ раствором закисного железа в дистиллированной воде с последующем добавлением к нему в атмосфере NO раствора глутатиона в 15 мМ Hepes-буфере (рН 7,4) (соотношение Fe²⁺: глутатион - 1:2) [Severina, I.; Bussygina, О.; Pyatakova, N.; Malenkova, I.; Vanin, A., Nitric Oxide, 2003, 8,155-163].

S-нитрозоглутатион(GS-NO) и S-нитрозоцистеин(Cys-NO) получали путем инкубации 0,1 М нитрита с 0,1 М глутатионом либо цистеином и 0,1 М НС1 (1:1:2, по объему) в течение 15 мин при последующем разведении 40 мМ Na-фосфатным буфером (рН 6,0) до нужной концентрации.

ПОРЯДОК ПРОВЕДЕНИЯ АНАЛИЗА

1. Определяется активность каталазы в реакционной среде (общий объем 20 мл), содержащей 40 мМ фосфатный буфер, рН 6,0, 150 мМ NaCl, гемолизированные эритроциты коровы - 100 мкМ по гем-группе (можно крысы, человека), содержащие эндогенную каталазу. Это - контрольный образец.

2. Проводится калибровка. Определяется активность каталазы в вышеуказанной среде в присутствии 125, 250 и 500 нМ нитрита. Строится калибровочная кривая.

3. Исследуемый образец (200 мкл) добавляется в основную среду (см п.1). В нее также добавляется 100 мкМ глутатиона. Определяется активность каталазы в его присутствии и суммарное содержание нитрозосоединений (NO₂ ^-+RSNO+ДНКЖ) согласно калибровке.

4. Также проводится дополнительный контроль: измерение активности каталазы в присутствии образца и в отсутствии NaCl. В отсутствии прочих ингибиторов каталазы (не содержащих нитрозогруппу) она должна быть аналогична контролю (1).

5. В среду, содержащую исследуемый образец (п.3), последовательно, с 1-минутным интервалом добавляется 25 мкМ FeSO₄, 100 мкМ глутатиона и 300 мкМ о-фенантролина. Еще через 1 мин проводится определение активности каталазы. Содержание RSNO+ДНКЖ определяют по разнице степени ингибирования фермента в п.1 и в п.5 согласно калибровке. Оставшийся ингибирующий эффект принадлежит нитриту. Его содержание также определяют согласно калибровке.

6. Содержание ДНКЖ определяется аналогично п.5, но без добавления FeSO₄. Оставшийся ингибирующий эффект принадлежит RSNO+нитрит.

Активность каталазы определяется любым известным методом, не требующим использования перекиси водорода в концентрации более 9 мМ. Предпочтительнее видится разработанный нами ранее калориметрический метод, основанный на контроле кинетики теплопродукции, сопровождающей разложение перекиси [Titov, V.; Petrenko, Yu., Biochemistry (Moscow), 2003, 68, 627-633]. Этот метод не связан с фотометрией, а потому не чувствителен к исходной окрашенности и мутности образца.

В таблице 2 представлены данные по определению содержания экзогенно добавленного нитрита в образцах коровьего молока. Молоко - один из наиболее трудных для анализа биообъектов, так как из-за его высокой мутности необходима предварительная очистка от липопротеидов. Как можно видеть из данных, представленных в таблице 2, процедура предварительной очистки образца приводит к существенным потерям исследуемого соединения - нитрита, а также к переводу его в недетектируемую форму. Это видно в сравнении показаний стандартного теста на нитрит с показаниями предлагаемого нами способа, не требующего предварительной очистки образца. Последний во всех случаях показывал то количество нитрита, которое фактически было добавлено.

В таблице 3 представлены данные о содержании S-нитрозоглутатиона в его искусственно синтезированном препарате, полученные по классической методике (разрушение нитрозоглутатиона до нитрита под воздействием солей ртути и определение последнего по методу Грисса [Tarpey, М.; Wink, D.; Grisham М. Am. J. Physiol. Regul. Integr Comp. Physiol, 2004, 286, R431-R444]) и по предлагаемому каталазному тесту. Сравнение показывает, что классический метод давал значительно заниженное содержание GSNO по сравнению с каталазным тестом. Показания последнего соответствовали расчетному количеству нитрозоглютатиона, которое должно было образоваться в такой системе. Классический метод также показывал наличие нитрита, который согласно каталазному тесту отсутствует в образце. Это объясняется тем, что нитрозотиолы под воздействием сильнокислой среды, необходимой для реакции Грисса, подвергаются деструкции [Titov, V.; Vanin, А.; Serezhenkov, V.; Petrenko, Yu., Probl. Ecol. Secur. Agric, 2003, 6, 50-65], что и создает этот артефакт.

Препарат динитрозильного комплекса железа (ДНКЖ), синтезированный в реакции газообразного NO с 5 мМ раствором закисного железа с последующем добавлением глутатиона [Severina, I.; Bussygina, О.; Pyatakova, N.; Malenkova, I.; Vanin, A., Nitric Oxide, 2003, 5,155-163], согласно тесту по Гриссу содержал некоторое количество нитрита. Однако согласно предлагаемому тесту образец не содержал нитрита, но содержал ДНКЖ в количестве, соответствующем расчетному (таблица 4).

Заметим, что препарат, синтезированный по вышеуказанной методике, но без добавления глутатиона, не ингибировал каталазу, но согласно тесту по Гриссу содержал некоторое количество нитрита. После добавления глутатиона препарат вел себя как ДНКЖ (таблица 5). Этот пример наглядно демонстрирует те артефакты, с которыми сопряжены классические методы.

Согласно данным различных авторов, полученным общепринятыми методами, в коровьем молоке содержалось порядка микромоль нитрита и нитрозотиолов [Silanikove N.; Shapiro F.; Shamay A.; Leitner G., Free Radical Biology & Medicine, 2005, 38, 1139-1151; Paszkowski, Т.; Sikorski, R.; Kozak, A.; Kowalski, В.; Jakubik, J., Polski tygodnik lekarski, 1989, 44, 961-963; Шидловская В.П., Молочная промышленность,1986, №1, 29-31]. Но согласно данным предлагаемого каталазного теста образец свежего молока здоровой коровы содержал только нитрозотиолы и не содержал нитрита (таблица 6).

В таблице 6 приведены также данные, о содержании в молоке NO-продуцентов, полученные методом, основанным на улавливании выделяющегося NO спиновой ловушкой MGD по методике, описанной в работах А.Ф.Ванина [Vanin A.F., Huisman A., van Faassen Е., Iron dithiocarbamate as spin trap for nitric oxide detection: pitfalls and successes, Methods in Enzymology, 2002, 359, 27-42]. Содержание доноров NO в молоке, определенное этим методом, было значительно ниже, чем определенное как по Гриссу, так и с помощью предлагаемого каталазного теста. Это объясняется большим количеством соединений, способных конкурировать за NO с ловушкой, а также постепенной окисляемостью последней.

В то же время кефир, прокисшее молоко, а также молоко коров, больных маститом, содержали нитрит (таблица 7).

ПРИЛОЖЕНИЕ

Таблица 1 Особенности ингибирования каталазы под действием ряда нитрозосоединений и нитрита ИССЛЕДУЕМОЕ СОЕДИНЕНИЕ ДОБАВЛЯЕМЫЕ РЕАГЕНТЫ К GSH Fe Fe+GSH HbO₂ о-ф HbO₂+о-ф О-ф+HbO₂ Нитрит + + + + + + + + Нитрит + Fe + GSH +       + + + + ДНКЖ/GS + + + + + + - + GS-NO/Cys-NO + + + + + + + + То же + Fe + +     + + - + Нитрат - - - - - - - - Примечания: +- ингибирующий эффект присутствует (снижение активности на 40-47% по сравнению с изначальной); - - отсутствует (нет изменения активности фермента)

Концентрация всех исследуемых соединений в реакционной среде - 0,5 мкМ.

Обозначения: Fe - 100 мкМ FeSO₄, GSH - 100 мкМ глутатион, о-ф - 0,3 мМ о-фенантролин, ДНКЖ/GS - динитрозильный комплекс железа, содержащий глутатион, HbO₂ - гемолизат эритроцитов (100 мкМ по гем-группе), GS-NO/Cys-NO нитрозоглутатион и нитрозоцистеин соответственно.

К 5,0 мкМ растворам исследуемых соединений в 40 мМ Na-фосфатном буфере, рН 6,0, добавлялись Fe, GSH, о-ф и HbO₂ в указанной последовательности с интервалом в 1 мин. Спустя 5 мин инкубируемые вещества переносились в реакционную среду, разбавляясь при этом в 10 раз, и через 1 мин измерялась активность каталазы. Реакционная среда во всех случаях содержала: 40 мМ Na-фосфатный буфер, 150 мМ NaCl, 9,0 нМ каталазы либо HbO₂ (100 мкМ по гем-группе), содержащий эндогенную каталазу, рН 6,0. 9,

Таблица 2 Концентрация экзогенно добавленного нитрита в образцах коровьего молока и их фильтратах (мкМ) через 4 ч после добавления по показаниям стандартного теста (метод Грисса) и предлагаемого каталазного теста. № пробы Добавлено нитрита, мкМ Каталазный тест Метод Грисса Концентрация нитрита, мкМ В молоке В фильтратах В фильтратах 1 100 95±8 55±4 39±10,3 2 10 9,75±0,7 8,5±1,7 3,5±2 Примечание: фильтрат получен согласно общепринятой методики осаждения липопротеидов в системе ферроцианид калия - сульфат цинка - NH₄OH и последующей фильтрацией [Doerr, R.; Gates, R.; Fiddler, W., J. Assoc. Off Anal. Chem., 1982, 65, 616-618]. Молоко исходно содержало 5,5 мкМ нитрозосоединений. Они учитывались при анализе данных.   Таблица 3. Содержание RSNO, нитрита и ДНКЖ/НКЖ в продукте 10-минутной инкубации 0,1М KNO₂ с 0,1М глутатионом и 0,1М HCl (1:1:2 по объему) (х±m_x, n=4). Определяемые соединение Концентрация вещества, мМ Классический тест Предлагаемый каталазный тес RSNO 9,4±0,9 24,5±1,15 Нитрит 5,6±2,8 0 ДНКЖ - 0   Таблица 4 Содержание ДНКЖ/НКЖ, RSNO и нитрита в препарате, полученном путем инкубации газообразного NO с 5 мМ раствором закисного железа с последующим добавлением глутатиона (х±m_x, n=4). Определяемые соединения Концентрация вещества, мМ Тест Грисса Предлагаемый каталазный тест RSNO - 0 Нитрит 3,5±0,3 0 ДНКЖ - 4,8±0,3

Таблица 5. Содержание ДНКЖ, RSNO и нитрита в препарате, полученном путем инкубации газообразного NO с 5 мМ раствором закисного железа без последующего добавлением глутатиона (х±m_x, n=4). Определяемые соединения Концентрация вещества, мМ Тест Грисса Предлагаемый каталазный тест До добавления к препарату 10 мМ глутатиона После добавления к препарату 10 мМ глутатиона RSNO - 0 0 Нитрит 3,8±0,4 0 0 ДНКЖ - 0 4,7±0,2 Таблица 6. Содержание RSNO, ДНКЖ и нитрита в молоке клинически здоровой коровы (2 образца). Определяемые соединения Концентрация вещества, мкМ Общепринятый тест (Грисс, Грисс + ртуть []) Предлагаемый каталазный тест Метод спиновых ловушек   Образец I Образец II Образец I Образец II Образец I Образец II RSNO 0 0,17 3,2 4,3 - - Нитрит(NO₂ ^-) 3,2 0,42 0 0 - - ДНКЖ - - 0 0 - - Общее содержание доноров NO         0,2 0,1

Таблица 7 Содержание RSNO и нитрита в образцах молока и молочных продуктов (мкМ), согласно каталазному тесту (х±m_x, n=4) Объект RSNO Нитрит (NO₂ ^-) ДНКЖ Молоко здоровой коровы (1 ч после дойки). 6,0±1 0 0 То же через 24 ч инкубации при 20°С. 2,3±0,5 3,5±0,5 0 То же через 48 ч инкубации при 20°С. 0 8,5±1,2 0 То же через 48 ч инкубации при 5°С. 5,8±0,8 0 0 Молоко коровы с выраженными клиническими признаками мастита (покраснение вымени, молоко содержит хлопья) 1 ч после дойки. 0 12,0±2 0 Кефир 0 7,2±0,9 0

Изобретение может быть использовано в биохимическом анализе, а также везде, где оценка содержания метаболитов NO имеет научное и прикладное значение (медицина, сельское хозяйство). Определение содержания соединений, могущих выполнять функцию доноров NO, основано на свойстве нитрита (NO₂ ^-), нитрозотиолов (RSNO), динитрозильных комплексов железа (ДНКЖ) ингибировать фермент каталазу в присутствии галоид-ионов, и на утрате ими этого свойства под действием определенных факторов, различных для каждой группы соединений. Чувствительность метода - до 50 нМ. Определение проводится в нейтральной и околонейтральной среде и не требует какой-либо предварительной подготовки образца. Использование изобретения позволяет количественно разделить нитрит, нитрозотиолы и ДНКЖ. 7 табл.

Способ определения содержания нитрита, S-нитрозотиолов и динитрозильных комплексов железа в биообъектах, характеризующийся тем, что
определяют активность каталазы в контроле, содержащем реакционную среду, содержащую 40 мМ фосфатного буфера рН 6, 150 мМ NaCl, гемолизированные эритроциты коровы, или крысы, или человека в концентрации 100 мкМ по гем-группе, содержащие эндогенную каталазу;
определяют активность каталазы в вышеуказанной среде в присутствии 125, 250 и 500 нМ нитрита, строят калибровочную кривую;
добавляют исследуемый образец и глутатион в концентрации 100 мкМ в реакционную среду, определяют активность каталазы в его присутствии и суммарное содержание нитрита, S-нитрозотиолов и динитрозильных комплексов железа согласно калибровочной кривой;
добавляют в реакционную среду, содержащую исследуемый образец, последовательно, с 1-минутным интервалом 25 мкМ FeSO₄, 100 мкМ глутатиона и 300 мкМ о-фенантролина, еще через 1 мин определяют активность каталазы, содержание S-нитрозотиолов и динитрозильных комплексов железа определяют по разнице степени ингибирования фермента по сравнению с контролем согласно калибровочной кривой, при этом оставшийся ингибирующий эффект принадлежит нитриту, его содержание также определяют согласно калибровочной кривой;
содержание динитрозильных комплексов железа определяют аналогично предыдущей стадии, но без добавления FeSO₄, при этом оставшийся ингибирующий эффект принадлежит S-нитрозотиолам и нитриту, далее проводят оценку содержания S-нитрозотиолов.