СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЛАЦЕНТАРНОГО ПРОТЕИНА Российский патент 1994 года по МПК C07K3/02 C07K3/18 C07K13/00 

Изобретение относится к биологической химии и может быть использовано для выделения плацентарного протеина свиньи-2 (ППС-2).

В литературе этот белок не описан и способов его получения к настоящему времени в доступной патентной и медицинской литературе не найдено.

ППС-2 был выявлен в экстрактах ткани раннего хориона свиньи со сроком гестации до 8 недель. При иммунохимическом исследовании методом двойной радиальной иммунодиффузии с различными биологическими жидкостями и экстрактами тканей ППС-2 отсутствовал в плазме хряка, супоросной свиньи и эмбриональной сыворотке, а также в экстрактах ткани матки, гипофиза, надпочечника, яичка, яичника, почки, печени, селезенки, легкого. Иммунохимически данный антиген был обнаружен в тканях плаценты на всем протяжении гестации, при этом содержание его в ранней плаценте превышало содержание в терминальной в 2 - 3 раза. ППС-2 обнаруживался в равных количествах как в материнской, так и в плодной частях плаценты. Содержание его в этих тканях составило около 0,6 мг на 100 г ткани ранней плаценты.

Полученные данные позволяют предположить, что ППС-2 является плацента специфическим антигеном и может быть использован как маркер для ранней диагностики супоросности свиньи и мониторинга процесса гестации у этого животного. Создание высокочувствительного иммуноферментного метода определения ППС-2 в биологических жидкостях и тканях на основе очищенного препарата этого белка позволит решить эту задачу.

Для получения моноспецифических поликлональных антисывороток к ППС-2 ткань плодной части ранней плаценты свиньи гомогенизировали с равным объемом 0,05 М трис-глицинового буфера рН 8,5, добавляя 0,1% тритон Х-100, троекратно замораживали и оттаивали, центрифугировали, супернатант диализовали 48 ч против 0,1 аммоний-бикарбонатного буфера и лиофилизировали. Беспородных кроликов самцов иммунизировали пятикратно, подкожно, вводя с интервалом в 3 дня каждому животному по 100 мг препарата белков раннего хориона в смеси в полным адъювантом Фрейнда. Реиммунизацию проводили тем же количеством препарата без адъюванта на 30-й день после последней иммунизации и повторно на 90-й день после последней иммунизации. Полученные антисыворотки абсорбировали плазмой хряка, экстрактами почки, печени и селезенки. С помощью этих антисывороток в ткани ранней плаценты свиньи был индентифицирован антиген с подвижностью альфа₂-глобулина в агаровом геле.

Целью изобретения является получение очищенного препарата плацентарного протеина свиньи-2, достигаемое следующим образом: плодную часть 8-недельной плаценты свиньи гомогенизируют с двукратным (вес/объем) объемом 0,01 М трис-HCl буфера рН 8,0 - 9,0, гомогенат трижды замораживают и оттаивают, центрифугируют, супернатант подвергают аффинной хроматографии на иммобилизованном конго-красном красителе, связавшиеся с сорбентом белки элюируют 1,0 М раствором хлорида кальция с добавлением 5% глицерина, элюат осаждают при 90% насыщения сульфатом аммония, центрифугируют, осадок подвергают фракционированию на сефадексе G-200 в 0,1 М аммоний-бикарбонатном буфере рН 8,15, фракции, содержащие целевой продукт, собирают и лиофилизируют, получая препарат ППС-2 50% -ной степени чистоты.

Сорбент синтезировали следующим образом. 50 мл сефарозы 6 В отмывали на фильтре 500 мл дистиллированной воды и слегка отжимали на фильтре, далее суспендировали в 50 мл ацетона, в котором непосредственно перед этим растворяли 2 г трихлортриазина (цианурхлорида). Полученную суспензию помещали в колбе на магнитную мешалку и при медленном вращении добавляли по каплям 10% -ный раствор едкого натра, поддерживая рН около 8,5. Как только рН среды начинал смещаться в щелочную сторону, приближаясь к 9,0, добавление щелочи прекращали, выжидали 5 мин и реакцию останавливали, добавляя в суспензию 50 мл охлажденной уксусной кислоты. Полученную проактивированную сефарозу отмывали от несвязавшегося трихлортриазина и уксусной кислоты 1 л 50% -ного водного раствора ацетона и 1 л дистиллированной воды на фильтре на бюхнеровской воронке.

Проактивированную таким образом сефарозу помещали в колбу, добавляли 50 мл дистиллированной воды, 1 г эпсилон-аминокапроновой кислоты и 1 г карбоната натрия, тщательно перемешивали и оставляли на ночь на магнитной мешалке при медленном перемешивании. На следующий день полученный продукт отмывали на фильтре 2 л дистиллированной воды.

50 мл сефарозы с введенной эпсилон- аминокапроновой кислотой переводили в диоксан, помещали в химический стакан, добавляли 50 мл диоксана, 1 г конго-красного красителя, 2 г дициклогексилкарбодиимида, 1 мл пиридина, смесь оставляли при медленном перемешивании на магнитной мешалке на ночь, после чего последовательно отмывали на фильтре 2 л диоксана, 2 л 50% -ного водного диоксана, 2 л 50% -ного водного этанола, 2 л дистиллированной воды, после чего сорбент отмывался от несвязавшегося красителя, оставаясь розового цвета. На этом сорбенте проводили выделение ППС-2.

Новым в предлагаемом способе является то, что для выделения и очистки из сложной белковой смеси раннее неизвестного белка - планцентарного протеина свиньи-2 использован биоспецифический для данного белка лиганд - конго-красный краситель, иммобилизованный на нерастворимой матрице - сефарозе, причем элюат, содержащий ППС-2, фракционируют на колонке с сефадексом G-200 в летучем буфере, решая тем самым одновременно две задачи: дополнительной очистки белка и его диализа. Кроме того, обработка исходного материала буфером с низкой ионной силой позволяет избежать диализа приготовляемой белковой смеси и использовать супернатант гомогената сразу в аффинной хроматографии.

Для достижения цели изобретения выбраны и обоснованы параметрические значения способа. Так, при обработке ткани плаценты объемом буфера более двукратного наблюдалось разведение белковой смеси и меньшая сорбция ППС-2 на сорбенте; при обработке ткани плаценты объемом буфера менее двукратного ионная сила приготовляемой белковой смеси была более 0,06, что препятствовало сорбции искомого белка на лиганде.

Для аффинной хроматографии ППС-2 на имобилизованном конго-красном красителе оптимальным значением рН для наилучшей сорбции белка было рН 8,0 - 9,0 и молярность трис-НСl буфера 0,04 - 0,06; при уменьшении минимального значения рН ниже 8,0 наблюдалось уменьшение количества сорбируемого белка, при увеличении рН более максимального 9,0, отмечалась повышенная сорбция на лиганде балластных белков и соответствующее этому снижение чистоты препарата.

П р и м е р 1. 100 г ткани 8-недельной плаценты свиньи (плодная часть) гомогенизируют с 200 мл 0,01 М трис-НСl буфера рН 8,0. Гомогенат троекратно замораживают и оттаивают при -20^оС, центрифугируют 45 мин при 6000 об/мин, супернатант используют в аффинной хроматографии на колонке с иммобилизованным конго-красным красителем, уравновешенной 0,04 М трис-НСl буфером, рН 8,0. Связавшиеся белки элюируют 1,0 М раствором хлорида калия с добавлением 5% глицерина, способствующего более полной десорбции ППС-2, элюат осаждают при 90% насыщения сульфатом аммония, 12 ч при 4^оС, центрифугируют 45 мин при 8000 об/мин, осадок фракционируют на колонке с сефадексом G-200 в 0,1 М аммоний-бикарбонатном буфере рН 8,15, фракции, содержащие ППС-2 собирают и лиофилизируют, получая 0,08 мг белка. Содержание ППС-2 - 40% , выход 5,3% .

П р и м е р 2. Ткань плаценты обрабатывают как в примере 1. Аффинную хроматографию проводят в 0,06 М трис-НСl буфере рН 9,0. Связавшиеся белки элюируют 1,0 М раствором хлорида калия с добавлением 5% глицерина. Остальные процедуры как в примере 1. Получают 0,14 мг белка. Содержание ППС-2 30% , выход 7% .

П р и м е р 3. Ткань плаценты обрабатывают как в примере 1. Аффинную хроматографию проводят в 0,05 М трис-НСl буфере, рН 8,5. Связавшиеся белки элюируют 1,0 М раствором хлорида калия с добавлением 5% глицерина. Остальные процедуры как в примере 1. Получают 0,12 мг белка. Содержание ППС-2 50% , выход 10% .

Предлагаемый способ является оригинальным способом выделения нового белка - плацентарного протеина свиньи-2.

При изучении физико-химических свойств ППС-2 было установлено, что данный белок обладает электрофоретической подвижностью (относительно альбумина) - 0,6, молекулярной массой, определенной в гель-фильтрации около 60 кД. Белок не содержит углеводы при окрашивании дуги преципитации по методу Шиффа и осаждается сульфатом аммония при 65% насыщения.

Данные иммунохимического анализа и физико-химические свойства ППС-2 позволяют считать, что этот белок неидентичен альфа-фитопротеину свиньи, имеющему сходную с ППС-2 молекулярную массу, но встречающемуся в больших количествах в эмбриональной сыворотке; ППС-2 отличается и от плацентарного лактогена свиньи, имеющего молекулярную массу около 20 кД; от трофобластического протеина свиньи, также имеющего молекулярную массу около 20 кД.

Разработка оригинального способа выделения плацентарного протеина свиньи-2 и получение к нему антисыворотки является актуальной научной задачей, поскольку данный белок выявлен в ткани ранней плаценты и разработка высокочувствительного иммуноферментного метода определения ППС-2 в сыворотке крови супоросных свиней на основе очищенного препарата данного белка позволит получить диагностический текст для раннего определения гестации и ее мониторинга. (56) ЕР N 0226181, кл. C 07 K 13/00, 1987.

Использование: сельскохозяйственная биотехнология, экспериментальная ветеринария. Сущность применения: протеин получают из плаценты свиньи, проводят фракционирование супернатанта гомогената белков раннего хориона на иммобилизованном конго-красном красителе с последующей гель-фильтрацией элюата на сефадексе G-200.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЛАЦЕНТАРНОГО ПРОТЕИНА, включающий получение гомогената ткани, центрифугирование, хроматографирование, элюирование связанного белка, осаждение элюата и повторное центрифугирование, отличающийся тем, что из тканей используют ткань, плаценты свиньи, из хроматографий - аффинную хроматографию на сефарозе с иммобилизованным конго-красным носителем, элюирование проводят 1,0 М раствором хлорида калия с добавлением 5% глицерина, осаждение элюата осуществляют при 90% -ном насыщении сульфатом аммония, а после центрифугирования осадок дополнительно подвергают фракционированию на сефадексе G-200 в 0,1 М аммоний-бикарбонатном буфере с последующим сбором фракций, содержащих целевой продукт, и их диализом.