СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ТУБЕРКУЛЕЗНЫХ ИЗМЕНЕНИЙ В ЛЕГКИХ Российский патент 2000 года по МПК G01N33/68 

Изобретение относится к медицине, в частности к фтизиатрии, и может быть использовано в противотуберкулезных учреждениях.

Известен способ определения активности протеиназ гранулоцитов и их кислотостабильных ингибиторов в бронхиальном секрете (БС) больных впервые выявленным туберкулезом легких, осложненным неспецифическим эндобронхитом. Результат этой работы заключается в определении клинической значимости указанных показателей (эластазоподобной активности БС, кислотостабильных ингибиторов) у больных с впервые выявленным туберкулезом легких, осложненным неспецифическим эндобронхитом на этапах их стационарного лечения (М.В.Шестерина, О.Г.Оглоблина, Б.М.Малиев. Пробл. туберкулеза, 1983, N 2, С. 51-55).

Однако, авторы не определяли эти тесты у больных с неактивными туберкулезными изменениями в легких.

Известен также способ определения активности туберкулеза легких, заключающийся в измерении активности гиалуронидазы, определении белкового состава сыворотки крови, содержания сиаловой кислоты до и после подкожного введения туберкулина (Гавриленко B. C. "Критерии клинического излечения туберкулеза легких", М., Медицина, 1977, 151 с.).

Недостатком этого способа является неудовлетворительная достоверность получаемых данных.

Известен способ определения активности туберкулезных изменений в легких, заключающийся в определении числа нейтрофилов и альвеолярных макрофагов с НСТ-положительной реакцией в бронхо- альвеолярном смыве до и после туберкулиновой нагрузки (В.П.Костромина, Е.Д.Московенко, М.Ф.Яцына, а.с. 1755100, 5 G 01 N 1/28, опубликовано в БИ 30, 1992, С. 166).

Недостатком данного метода является необходимость подкожного введения туберкулина, что может привести к известным реакциям (местная, очаговая, общая) и к обострению заболевания.

Известен способ определения эластазы крови при туберкулезе и гнойно-воспалительных заболеваниях легких, основанный на использовании в качестве субстрата эластина, окрашенного орцеином (Л.А.Винник, Л.М.Герович. Проблемы туберкулеза, 1985, N 12, С. 35-39).

Недостатком этого способа является то, что используя указанные субстраты, авторы определяли у больных не лейкоцитарную эластазу, а суммарную активность бактериальной, панкреатической и частично лейкоцитарной эластазы, а также то, что исследования были выполнены до лечения и через 1- 4-6 месяцев комплексной терапии и потому не посвящены вопросам клинического излечения туберкулеза легких.

Данный аналог является близким по технической сущности заявленному изобретению и взят за прототип.

Задача - повышение точности способа определения активности туберкулезных изменений в легких за счет одновременного измерения активности лейкоцитарной эластазы, эластазоподобной активности в сыворотке крови, содержания катионных белков в нейтрофилах плазмы.

Решение задачи достигается следующим образом.

В 2 пробирки, одна из которых содержит гепарин (100 Ед) и 1 мл бесцветного раствора Хенкса, отбирают по 5 мл крови из локтевой вены. Пробирку без стабилизатора центрифугируют при 1500 об/мин в течение 20 минут для получения сыворотки. Вторую пробирку со стабилизатором (гепарин) выдерживают в течение 1 часа при комнатной температуре для получения плазмы. В сыворотке крови определяют активность лейкоцитарной эластазы (полностью высвобожденной из комплекса с α1-протеиназным ингибитором) и эластазоподобную активность. Из плазмы крови выделяют нейтрофилы и определяют содержание в них катионных белков.

Активность лейкоцитарной эластазы измеряют следующим образом: в термостатированную кювету (t= 30^oC) наливают 2,8 мл трис-HCl буфера, 0,15 мл 1,18% раствора ВОС (9,3 мг N-t-BOC-L-Alanine p-nitrophenyl ester разводят в 1 мл ацетонитрила) и 0,05 мл исследуемой сыворотки, разведенной 1:30. Смешивают и определяют изменение оптической плотности пробы ежеминутно в течение 4 минут на однолучевом спектрофотометре при длине волны 347,5 нм. Аналогично определяют оптическую плотность контрольной пробы, где вместо сыворотки больного берут 0,05 мл физиологического раствора. Из линейного хода реакции находят прирост оптической плотности опытных и контрольной проб. Расчет результатов производят по формуле

где Δ_o и Δ_k - прирост оптической плотности опытной и контрольной проб. Активность лейкоцитарной эластазы выражается в Ед/мл.

Эластазоподобную активность сыворотки крови определяют следующим образом: в кювету наливают 2,9 мл 0,1 М фосфатного буфера (рН 6,5), 0,1 мл 0,40% раствора ВОС (3,1 мг N-t-BOC-L-Alanine р- nitrophenyl ester разводят в 1 мл ацетонитрила) и 30 мкл исследуемой сыворотки. Оптическую плотность пробы измеряют против контроля, состоящего из 2,9 мл 0,1 М фосфатного буфера и 0,1 мл раствора ВОС. Определение оптической плотности проводят ежеминутно в течение 4 минут на спектрофотометре при длине волны 347,5 нм. Расчет производят по формуле.

где Δ - максимальный прирост оптической плотности за 1 минуту. Эластазоподобная активность сыворотки крови выражается в МЕ/мл.

Содержание катионных белков в нейтрофилах определяют, окрашивая их зеленым прочным. Берут отмытые в бесцветном растворе Хенкса нейтрофилы, в количестве 600000 клеток на каждое определение. Отмытые нейтрофилы помещают в 3 лунки плашки и окрашивают 0,1% раствором зеленого прочного (100 мг зеленого прочного растворяют в 100 мл трис-буфера pH 8,0-8,2) по 0,05 мл. Плашку термостатируют при t=37^oC в течение 30 минут. Далее не связанный с катионными белками краситель удаляют, отмывая пробу тем же бесцветным раствором, и добавляют (с целью разрушения окрашенных нейтрофилов) 0,1 мл изопропилового спирта, подкисленного 0,04 М HC1. Оптическую плотность проб измеряют на сканирующем фотометре при длине волны 320 нм. Полученную цифру умножают на 100. Содержание катионных белков в нейтрофилах выражается в условных единицах (усл.ед.).

Активность лейкоцитарной эластазы, составляющая до 3,1 Ед/мл, при эластазоподобной активности сыворотки крови до 183 МЕ/мл и при содержании катионных белков в нейтрофилах не более 7,0 усл.ед. определяет неактивный туберкулез легких. При более высоких значениях показателей (или хотя бы одного из них) диагносцируется активный туберкулез легких.

Пример 1. Больной Б., 28 лет, состоит в IА группе диспансерного учета с диагнозом: инфильтративный туберкулез верхней доли правого легкого в фазе рассасывания и уплотнения, ВК--. Болен в течение 14 месяцев. При выявлении - инфильтративный туберкулез верхней доли правого легкого в фазе распада, ВК+. В результате комплексной терапии в течение 10 месяцев достигнута ликвидация полости распада в легких, рассасывание инфильтративных и очаговых изменений. На момент обследования состояние больного удовлетворительное. Жалоб нет. Проявления туберкулезной интоксикации отсутствуют. Гемограмма без изменений. Показатели функции печени нормальные. Содержание белка в сыворотке крови и протеинограмма не отличаются от нормы. Рентгенологически в верхней доле правого легкого на фоне фиброзной тяжистости определяются немногочисленные мелкие очажки с четкими контурами. При обследовании: активность лейкоцитарной эластазы - 4,2 Ед/мл, эластазоподобная активность сыворотки - 190 МЕ/мл, содержание катионных белков в нейтрофилах - 12 усл.ед. Полученные данные свидетельствуют о том, что у больного сохраняется высокая активность туберкулезных изменений в легких.

Пример 2. Больной В., 45 лет, болен туберкулезом легких в течение 6 лет. При выявлении констатирован инфильтративный туберкулез верхней доли левого легкого в фазе распада, ВК+. После длительного противотуберкулезного антибактериального лечения, сезонных весенне-осенних курсов антибактериальной терапии в течение 2 лет больной переведен в III группу диспансерного учета, а спустя 2 года - в VIIA группу. На момент обследования состояние пациента удовлетворительное. Жалоб нет. Проявления туберкулезной интоксикации отсутствуют. Гемограмма без изменений. При исследовании функций печени патологии не выявлено. Белок и белковые фракции сыворотки крови нормальные. Рентгенологически в уменьшенной в объеме верхней доли левого легкого определяется грубая фиброзная тяжистость, плевральные наслоения. На этом фоне видны разновеликие плотные, частично кальцинированные, туберкулезные очаги. Результаты исследования: активность лейкоцитарной эластазы в сыворотке крови - 3,0 Ед/мл, эластазоподобная активность сыворотки - 168 МЕ/мл, содержание катионных белков в нейтрофилах - 6 усл.ед. Полученные данные говорят о неактивном туберкулезе легких.

Способ апробирован в НИИ фтизиопульмонологии ММА им. И.М.Сеченова на 116 больных туберкулезом легких и лицах с неактивными туберкулезными изменениями в легочной ткани без сопутствующих заболеваний.

Таким образом, применение предлагаемого способа определения активности туберкулезных изменений в легких с помощью одновременного измерения активности лейкоцитарной эластазы в сыворотке крови, эластазоподобной активности сыворотки и содержания катионных белков в нейтрофилах плазмы позволяет в 100% случаев подтвердить или исключить активность туберкулеза легких. Установление активности туберкулезных изменений в легких позволит более обоснованно переводить больных в неактивные группы диспансерного учета, что уменьшит число рецидивов заболевания. Предлагаемый способ может найти применение в клинической практике во фтизиатрии. Способ высокоинформативен, воспроизводим.

Изобретение относится к фтизиатрии и касается определения активности туберкулезных изменений в легких. Это достигается одновременным изменением уровня лейкоцитарной эластазы, эластазоподобной активности в сыворотке крови и содержания катионных белков в нейтрофилах плазмы. Активность лейкоцитарной эластазы измеряют спектрофотометрически, предварительно высвобождая ее с помощью трис-HCl буфера из комплекса с α1 - протеиназным ингибитором. В качестве субстрата используют N-BOC-L-Alanine p-nitrophenyl ester. Эластазоподобную активность сыворотки измеряют, используя тот же субстрат. Содержание катионных белков в нейтрофилах плазмы определяют, окрашивая белки зеленым прочным с последующим разрушением клеток и измерением оптической плотности проб на сканирующем фотометре. При активности лейкоцитарной эластазы до 3,1 Ед/мл, эластазоподобной активности сыворотки крови до 183 МЕ/мл и содержании катионных белков не более 7 усл.ед. определяют неактивный туберкулез легких, при более высоких значениях этих показателей или хотя бы одного из них определяют активный туберкулез легких. Способ позволяет получить высокую воспроизводимость и информативность.

Способ определения активности туберкулезных изменений в легких, включающий исследование крови, отличающийся тем, что в сыворотке крови регистрируют активность лейкоцитарной эластазы и эластазоподобную активность, а в нейтрофилах плазмы крови измеряют содержание катионных белков и при активности лейкоцитарной эластазы до 3,1 Ед/мл, эластазоподобной активности сыворотки крови до 183 МЕ/мл и содержании катионных белков не более 7 усл.ед. определяют неактивный туберкулез легких, при более высоких значениях этих показателей или хотя бы одного из них определяют активный туберкулез легких.