СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ КОМПОНЕНТА C4 КОМПЛЕМЕНТА ЧЕЛОВЕКА Российский патент 2001 года по МПК G01N33/544 

Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения функциональной активности компонентов комплемента в сыворотке крови человека при диагностике ряда заболеваний и в биологических препаратах.

Наиболее перспективным из современных методов определения белков сыворотки крови является метод иммуноферментного анализа благодаря своей чувствительности, избирательности и возможности автоматизации аналитического процесса. Однако имеющиеся на сегодня методы иммуноферментного анализа белков комплемента позволяют определять лишь их содержание, как антигена. Тем не менее, наиболее информативным является оценка функциональной активности этих белков, которая и характеризует развитие патологического процесса. Что касается определения функциональной активности компонентов комплемента, то практически единственным является гемолитический метод [1], не отличающийся высокой степенью воспроизводимости и неохотно используемый клиницистами из-за трудностей, связанных с приготовлением гемолитической системы на основе эритроцитов барана.

Нами разработан способ, позволяющий определять функциональную активность компонента C4 системы комплемента человека на основе иммуноферментного метода. Преимуществами предложенного метода является простота определения, хорошая воспроизводимость результатов и отсутствие необходимости использования таких плохо сохраняемых и плохо стандартизуемых компонентов, какими являются эритроциты.

Способ осуществляется следующим образом: проводят последовательную сорбцию в лунках микропанели сначала липополисахарида клеточной стенки грамотрицательных бактерий, затем определяемого C4 из растворов, его содержащих, в присутствии сыворотки морской свинки. Количество ковалентно связавшегося в результате активации компонента C4 определяют по продукту ферментативной реакции с помощью антител к C4 -фракции иммуноглобулинов G, ковалентно связанных с ферментом. Способ основан на изученной нами способности липополисахаридов клеточной стенки грамотрицательных бактерий активировать классический путь комплемента [2] и способности активированного компонента C4 ковалентно связываться с активатором.

Пример 1. Определение функциональной активности препарата C4. Растворяют препарат липополисахарида из S. sonnei в 0,05 М натрий-карбонатном буфере, pH 9,5, в концентрациях 10-100 мкг/мл и вносят по 100 мкл раствора в каждую лунку плоскодонного полистиролового 96-луночного планшета. Закрывают крышкой и оставляют на ночь при 4^oC. Два раза отмывают планшет вероналовым буферным раствором, pH 7,4, содержащим 0,15 М NaCl, 0,15 мМ Са²⁺ и 0,5 мМ Mg²⁺ (VBS⁺⁺), по 150 мкл в каждую лунку, затем планшет осушают путем вытряхивания остатка жидкости. В лунки планшета ряда вносят по 100 мкл раствора, содержащего C4 в растворе VBS⁺⁺, в виде прогрессивных двукратных разведений. Во все лунки планшета вносят по 10 мкл сыворотки морской свинки. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37^oC, двукратной отмывки фосфатным буфером, pH 7,4, содержащим 0,15 М NaCl и 0,05% твин-20, и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл конъюгата пероксидазы с антителами против компонента C4 человека в том же буфере в подобранном разведении. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37^oC и двукратной отмывки с детергентом и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл субстратного буфера (10 мг ортофенилендиамина в 25 мл цитратно-фосфатного буфера, pH 5,0, и 50 мкл 3% перекиси водорода). После 30 мин инкубации в темноте реакцию останавливают внесением в каждую лунку 50 мкл 14% серной кислоты. Результаты реакции учитывают с помощью спектрофотометра с вертикальным лучом измерением светопоглощения при 492 нм. Функциональную активность препарата C4 рассчитывают по стандартной кривой.

Этим методом проведено определение активности C4 в 6 образцах сыворотки крови человека и стандартным гемолитическим методом [1]. Полученные результаты (в ед. активности в пробе) приведены в таблице.

Пример 2. Определение функциональной активности препарата C4. Растворяют препарат липополисахарида из Е. coli в 0,05 М натрий-карбонатном буфере, pH 9,5, в концентрациях 10-100 мкг/мл и вносят по 100 мкл раствора в каждую лунку плоскодонного полистиролового 96-луночного планшета. Закрывают крышкой и оставляют на ночь при 4^oC. Два разе отмывают планшет вероналовым буферным раствором, pH 7,4, содержащих 0,15 М NaCl, 0,15 мМ Ca²⁺ и 0,5 мМ Mg²⁺ (VBS⁺⁺), по 150 мкл в каждую лунку, затем планшет осушают путем вытряхивания остатка жидкости. В лунки планшета ряда вносят по 100 мкл раствора, содержащего C4 в растворе VBS⁺⁺, в виде прогрессивных двукратных разведений. Во все лунки планшета вносят по 10 мкл сыворотки морской свинки. После инкубации в термостате в течение 30 мин при 37^oC, двукратной отмывки фосфатным буфером, pH 7,4. содержащим 0,15 М NaCl и 0,05% твин-20, и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл конъюгата пероксидазы с антителами против компонента C4 человека в том же буфере в подобранном разведении. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37^oC и двукратной отмывки с детергентом и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл субстратного буфера (10 мг ортофенилендиамина в 25 мл цитратно-фосфатного буфера, pH 5,0, и 50 мкл 3% перекиси водорода). После 30 мин инкубации в темноте реакцию останавливают внесением в каждую лунку 50 мкл 14% серной кислоты. Результаты реакции учитывают с помощью спектрофотометра с вертикальным лучом измерением светопоглощения при 492 нм. Функциональную активность препарата C4 рассчитывают по стандартной кривой.

Пример 3. Определение функциональной активности препарата C4. Растворяют препарат липополисахарида из Neisseria meningitidis в 0,05 М натрий-карбонатном буфере, pH 9,5, в концентрациях 10-100 мкг/мл и вносят по 100 мкл раствора в каждую лунку плоскодонного полистиролового 96-луночного планшета. Закрывают крышкой и оставляют на ночь при 4^oC. Два раза отмывают планшет вероналовым буферным раствором, pH 7,4, содержащим 0,15 М NaCl, 0,15 мМ Са²⁺ и 0,5 мМ Mg²⁺ (VBS⁺⁺), по 150 мкл в каждую лунку, затем планшет осушают путем вытряхивания остатка жидкости. В лунки планшета ряда вносят по 100 мкл раствора, содержащего C4 в растворе VBS⁺⁺, в виде прогрессивных двукратных разведений. Во все лунки планшета вносят по 10 мкл сыворотки морской свинки. После инкубации в термостате в течение 30 мин при 37^oC, двукратной отмывки фосфатным буфером, pH 7,4, содержащим 0,15 М NaCl и 0,05% твин-20, и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл конъюгата пероксидазы с антителами против компонента C4 человека в том же буфере в подобранном разведении. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37^oC и двукратной отмывки с детергентом и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл субстратного буфера (10 мг ортофенилендиамина в 25 мл цитратно-фосфатного буфера, pH 5,0, и 50 мкл 3% перекиси водорода). После 30 мин инкубации в темноте реакцию останавливают внесением в каждую лунку 50 мкл 14% серной кислоты. Результаты реакции учитывают с помощью спектрофотометра с вертикальным лучом измерением светопоглощения при 492 нм. Функциональную активность препарата C4 рассчитывают по стандартной кривой.

Литература
1. Козлов Л.В., Крылова Ю.И., Чих В.П., Молчанова Н.Н. Модифицированные методы определения функциональной активности факторов комплемента C2, CЗ, C4 и C5. Биоорганическая химия. 1982. Т. 8. N 5. С. 652-659.

2. Козлов Л. В., Зинченко А.А., Соляков Л.С., Сизой М.Н., Ищенко А.М., Мартюшин С. В. , Андреев С.В. Механизм активации комплемента человека иммуностимуляторами из клеточных стенок бактерий. Биоорганическая химия. 1983. Т. 9. N 8. С. 1047-1055.

Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения функциональной активности компонентов комплемента в сыворотке крови человека при диагностике ряда заболеваний и в биологических препаратах. Способ позволяет определять функциональную активность компонента C4 системы комплемента человека на основе иммуноферментного метода. Проводят сорбцию в лунках микропанели липополисахарида клеточной стенки грамотрицательных бактерий. Затем сорбируют определяемый C4 из растворов, его содержащих, в присутствии сыворотки морской свинки. Количество ковалентно связывшегося в результате активации компонента C4 определяют по продукту ферментативной реакции с помощью антител к C4-фракции иммуноглобулинов. Способ основан на способности липополисахаридов клеточной стенки грамотрицательных бактерий активировать классический путь комплемента и способности активированного компонента С4 ковалентно связываться с активатором, надежен и достоверен. 1 табл.

Способ определения функциональной активности компонента С4 комплемента человека, отличающийся тем, что сорбируют в лунках микропанели липополисахарид из клеточной стенки грамотрицательных бактерий, в лунки микропанелей вносят раствор, содержащий компонент С4, и сыворотку морской свинки, проводят инкубацию, а затем вносят конъюгат фермента с антителами против компонента С4 человека и субстрат этого фермента, после чего проводят определение активности С4 по продукту ферментативной реакции.