СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДЕЙСТВИЯ ВЕЩЕСТВ НА КОМПЛЕМЕНТ НА СТАДИИ СВЯЗЫВАНИЯ СУБКОМПОНЕНТА C1q Российский патент 2002 года по МПК G01N33/544 

Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения прямого воздействия на функциональную активность компонентов комплемента различных веществ, в том числе лекарственных препаратов, в частности к способам определения ингибирующего действия веществ на связывание субкомпонента С1q комплемента активаторами классического пути активации комплемента.

Изобретение может быть использовано в медицине для определения механизма действия лекарственных веществ, для поиска потенциальных лекарственных веществ, изучения побочного действия лекарственных препаратов и воздействия экологически вредных веществ на организм.

Для определения способности веществ взаимодействовать с субкомпонентом С1q комплемента известен способ, основанный на ингибировании связывания C1q с сенсибилизированными эритроцитами барана, т.е. ингибировании инициации каскада активации комплемента, завершающегося лизисом эритроцитов [1]. Гемолитический метод [2] , используемый в этом способе, не отличается высокой степенью воспроизводимости и связан с необходимостью приготовления гемолитической системы на основе эритроцитов барана. Кроме того, метод требует удаления из системы исследуемого ингибитора после стадии связывания C1q с антителами, поскольку нельзя исключить возможности действия ингибитора на поздних этапах каскада активации, что усложняет процесс определения ингибирующего действия.

Задачей заявленного изобретения является разработка более современного и точного способа, позволяющего определять действие веществ на комплемент на стадии связывания субкомпонента С1q на основе иммуноферментного метода.

Поставленная задача достигается путем разработки способа определения, который предусматривает сорбцию в лунках микропанели иммуноглобулина G, затем внесение в лунки микропанели сыворотки крови человека в качестве источника субкомпонента С1q, содержащей ряд концентраций тестируемого ингибитора в серии экспериментов, и инкубацию. Для контроля исходной активности субкомпонента C1q проводят эксперимент без ингибитора. Количество сорбированного в лунках субкомпонента C1q определяют по продукту ферментативной реакции с помощью специфических антител против C1q, ковалентно связанных с ферментом. Способ основан на ингибировании исследуемыми веществами способности функционально активного субкомпонента C1q специфически связываться с иммуноглобулином G. Тем самым достигается определение ингибирования субкомпонента C1q комплемента изучаемыми эффекторами иммуноферментным методом, пригодным для стандартизации.

Техническим результатом заявленного изобретения является разработка упрощенного способа определения действия веществ на комплемент на стадии связывания субкомпонента C1q на основе иммуноферментного метода, обладающего хорошей воспроизводимостью результатов и отсутствием необходимости использования таких плохо сохраняемых и трудно стандартизуемых компонентов, какими являются эритроциты.

Пример. Определение действия лизоцима на комплемент (ингибирование связывания субкомпонента С1q комплемента человека). Растворяют иммунохимически чистый IgG в 0,05 М натрий-карбонатном буфере, рН 9,5, в концентрации белка 30 мкг/мл и вносят по 100 мкл раствора в каждую лунку плоскодонной полистироловой 96-луночной микропанели. Закрывают крышкой и оставляют на ночь при 4^oС. Три раза отмывают микропанель фосфатным буфером, рН 7,4, содержащим 0,15 М NaCl и 0,05% твин-20, затем микропанель осушают путем вытряхивания остатка жидкости. В другой микропанели с круглодонными лунками готовят серии двукратных разведений свежей сыворотки крови человека (в качестве источника C1q) в фосфатном буфере, рН 7,4, содержащем 0,15 М NaCl и 0,05% твин-20, общий объем в лунке 50 мкл. Затем во все лунки каждой серии вносят по 50 мкл раствора лизоцима в своей для каждой серии концентрации, а в контроле 50 мкл буфера без ингибитора, содержимое лунок этой микропанели переносят в первую микропанель. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37^oС, двукратной отмывки фосфатным буфером, рН 7,4, содержащим 0,15 М NaCl и 0,05% твин-20, и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл конъюгата пероксидазы с антителами против субкомпонента C1q человека в том же буфере в подобранном разведении. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37^oС и двукратной отмывки с детергентом и осушения микропанели в каждую лунку вносят по 100 мкл субстратного буфера (10 мг ортофенилендиамина в 25 мл цитратно-фосфатного буфера, рН 5,0, и 50 мкл 3% перекиси водорода). После 30 мин инкубации в темноте реакцию останавливают внесением в каждую лунку 50 мкл 14% серной кислоты. Результаты реакции учитывают с помощью спектрофотометра с вертикальным лучом измерением светопоглощения при 492 нм. Функциональную активность C1q без ингибитора (лизоцима) и для каждой концентрации ингибитора рассчитывают по стандартной кривой. Константу ингибирования К_i определяют по линейному уравнению 1/z=[I]/(z₀К_i)+1/z₀, где [I] - конечная концентрация ингибитора в лунках данной серии, z - активность C1q в присутствии ингибитора в данной концентрации, a z₀ - активность C1q в отсутствие ингибитора [1], строя график зависимости 1/z от [I]. При этом точка пересечения графика с осью абсцисс соответствует значению К_i. Для лизоцима получено значение К_i= 0,46±0,12 мМ, что близко значению 0,29±0,09 мМ, полученному ранее гемолитическим методом [I].

Из полученных данных следует, что константы, полученные двумя методами, согласуются между собой, т.е. заявленным способом действительно определяется ингибирование функциональной активности C1q субкомпонента комплемента. Небольшие расхождения в полученных константах могут объяснятся тем, что при определении гемолитическим методом в процесс задействованы все стадии активации комплемента, и о функциональной активности C1q судят по конечной стадии - лизису эритроцитов, при этом на все стадии процесса и на эритроциты могут оказывать влияние исследуемый ингибитор. Определение ингибирования C1q иммуноферментным методом включает только первую стадию каскада активации комплемента.

Источники информации
1. Козлов Л.В., Сизой М.Н., Зинченко А.А., Левковский А.В. Ингибирование связывания и активация первого компонента комплемента человека. Действие синтетических пептидов, фрагментов иммуноглобулинов и некоторых белков. Биохимия. 1986. Т. 51. 5. С. 707-718.

2. Kolb W.R., Kolb L.M., Podack E.R. C1q: isolation from human serum in high yield by affinity chromatography and development of a highly sensitive hemolytic assay. J. Immunol. 1979. V. 122. 5. Р. 2103-2111.

Способ может быть использован в области медицины, в частности в иммунологии. Сорбируют в лунках микропанели неспецифический иммуноглобулин G, затем в лунки вносят в выбранных разведениях сыворотку человека, содержащую определенную для каждой серии концентрацию тестируемого вещества, в контрольной серии тестируемое вещество не вносят, после инкубации и удаления жидкого содержимого лунок вносят конъюгат фермента с антителами против субкомпонента С1q человека и субстрат этого фермента, после чего проводят определение количества связавшегося компонента С1q по продукту ферментативной реакции и, сравнивая данные о количестве связавшегося компонента С1q в присутствии определенных концентраций тестируемого вещества и в отсутствии тестируемого вещества, определяют константу ингибирования этим веществом связывания субкомпонента С1q. Способ позволяет повысить точность действия веществ на комплемент на стадии связывания субкомпонента С1q.

Способ определения действия веществ на комплемент на стадии связывания субкомпонента С1q, отличающийся тем, что сорбируют в лунках микропанели неспецифический иммуноглобулин G, затем в лунки вносят в выбранных разведениях сыворотку человека, содержащую определенную для каждой серии концентрацию тестируемого вещества, в контрольной серии тестируемое вещество не вносят, после инкубации и удаления жидкого содержимого лунок вносят конъюгат фермента с антителами против субкомпонента С1q человека и субстрат этого фермента, после чего проводят определение количества связавшегося компонента С1q по продукту ферментативной реакции и, сравнивая данные о количестве связавшегося компонента С1q в присутствии определенных концентраций тестируемого вещества и в отсутствии тестируемого вещества, определяют константу ингибирования этим веществом связывания субкомпонента С1q.