СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИНГИБИРУЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ ВЕЩЕСТВ НА КОМПЛЕМЕНТ Российский патент 2002 года по МПК G01N33/53 G01N33/58 

Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения прямого воздействия на функциональную активность компонентов комплемента различных веществ, в том числе лекарственных препаратов, в частности к способам определения ингибирующего действия веществ на компонент С3 комплемента в момент его активации.

Изобретение может быть использовано в медицине для определения механизма действия лекарственных веществ, для поиска потенциальных лекарственных веществ, изучения побочного действия лекарственных препаратов и воздействия экологически вредных веществ на организм.

В литературе имеются сведения о прямом влиянии различных лекарственных или диагностических препаратов на систему комплемента в крови больного. Возможно, что такое взаимодействие с системой комплемента и является механизмом лечебного действия препарата. Наиболее яркими примерами в этом отношении является действие лекарственных препаратов бластолизина, МДП (N-ацетилмурамоилаланил-D-изоглутамина),ликопида(N-ацетилглюкозаминил-(β1-->4)-N-ацетилмурамоил-D-изоглутамина) [1], адреналина [2, 3], интерферонов, этилового спирта [3] на компонент С3 комплемента человека. Помимо лекарственных средств, прямое действие на систему комплемента могут оказывать вещества эндогенной природы, собственные метаболиты организма, оказывающие регуляторное влияние, например серотонин, гистамин [3], также экзогенные вещества, в том числе загрязняющие окружающую среду, т.е. экологически вредные.

Для определения способности веществ взаимодействовать с компонентом С3 комплемента известен способ, основанный на ингибировании связывания компонента С3 с С3-конвертазой, сформированной на сенсибилизированных эритроцитах барана, т. е. ингибировании образования С5-конвертазы и последующего лизиса эритроцитов [1, 3]. Недостатком этого способа является трудность получения воспроизводимых результатов, связанная с необходимостью приготовления стандартной гемолитической системы на основе эритроцитов барана и сложных в получении реагентов, таких, например, как R3^оху - сыворотки человека, лишенной компонента С3, но содержащей окисленный компонент С2 с повышенной активностью. Поэтому на основе гемолитического метода трудно создать простую в обращении тест-систему, позволяющую характеризовать ингибирующие вещества в стандартных условиях.

Нами на основе иммуноферментного метода разработан способ, позволяющий определять ингибирование различными веществами функциональной активности компонента С3, состоящей в связывании активированного компонента С3 с естественной мишенью - иммуноглобулином и формируемой на его поверхности С3-конвертазой. Преимуществами предложенного метода является возможность получения индивидуальных констант ингибирования, простота определения и хорошая воспроизводимость результатов.

Способ осуществляется следующим образом: проводят сорбцию в лунках микропанели иммуноглобулина G, затем в лунки вносят сыворотку морской свинки и буферный раствор, содержащий ионы Са²⁺ и Ni²⁺, и проводят инкубацию для формирования на поверхности лунок стабильной С3-конвертазы классического пути комплемента, после чего, вылив содержимое, в лунки вносят сыворотку крови человека в качестве источника компонента С3, содержащую ряд определенных концентраций тестируемого ингибитора в серии экспериментов, и проводят инкубацию. Для контроля исходной активности компонента С3 проводят эксперимент без ингибитора. Количество ковалентно связавшегося в результате активации компонента С3 определяют по продукту ферментативной реакции с помощью антител к С3-фракции иммуноглобулинов G, ковалентно связанных с ферментом, и, сравнивая данные о количестве связавшегося компонента С3 в присутствии различных концентраций ингибитора и в контроле без ингибитора, определяют константу ингибирования связывания активированного компонента С3, характеризующую ингибирующую способность тестируемого вещества. Величина константы ингибирования, имеющая размерность концентрации, численно равна той концентрации тестируемого вещества; при которой функциональная активность компонента С3 - его способность ковалентно связываться с мишенью снижается вдвое. Эффективным ингибитором комплемента могут считаться вещества, для которых константа ингибирования, определенная этим способом, лежит в области реальных концентраций этих веществ в крови.

В качестве вещества, способного взаимодействовать с системой комплемента, выбран адреналин, для которого известна константа ингибирования образования С5-конвертазы [3]. Полученные по этому способу (двумя методами) константы ингибирования практически совпадают и соответствуют по порядку величин терапевтическим дозам препаратов.

Пример. Определение ингибирования связывания активированного С3b. Растворяют иммунохимически чистый IgG в 0,05 М натрий-карбонатном буфере, рН 9,5, в концентрации 100 мкг/мл и вносят по 100 мкл раствора в каждую лунку плоскодонной полистироловой 96-луночной микропанели. Закрывают крышкой и оставляют на ночь при 4^oС. Два раза отмывают планшет вероналовым буферным раствором, рН 7,4, содержащим 0,15 М NaCl, 0,15 мМ Са²⁺ (VBS-Ca²⁺), по 150 мкл в каждую лунку, затем планшет осушают путем вытряхивания остатка жидкости. Во все лунки планшета вносят по 75 мкл VBS-Ca²⁺, 15 мкл 0,1 М нитрата никеля (II) и 10 мкл сыворотки морской свинки. После инкубации в термостате в течение 30 мин при 37^oС, двукратной отмывки VBS, содержащим 5 мМ ЭДТА, (VBS-E) содержимое лунок удаляют вытряхиванием. В другой микропанели с круглодонными лунками готовят серии двукратных разведений свежей сыворотки крови человека в VBS-Е, общий объем в лунке 50 мкл. Затем во все лунки каждой серии вносят по 50 мкл раствора адреналина в своей для каждой серии концентрации, а в контроле 50 мкл буфера без ингибитора, содержимое лунок этой микропанели переносят в первую микропанель. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37^oС, двукратной отмывки фосфатным буфером, рН 7,4, содержащим 0,15 М NaCl и 0,05% твин-20, и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл конъюгата пероксидазы с антителами против компонента С3 человека в том же буфере в подобранном разведении. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37^oС и двукратной отмывки с детергентом и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл субстратного буфера (10 мг ортофенилендиамина в 25 мл цитратно-фосфатного буфера, рН 5,0, и 50 мкл 3% перекиси водорода). После 30 мин инкубации в темноте реакцию останавливают внесением в каждую лунку 50 мкл 14% серной кислоты. Результаты реакции учитывают с помощью спектрофотометра с вертикальным лучом измерением светопоглощения при 492 нм. Функциональную активность препарата С3 для каждой концентрации ингибитора рассчитывают по стандартной кривой. Константу ингибирования К_i, определяют по линейному уравнению l/z = [I] /(z₀ K_i) + l/z [4], где [I] - конечная концентрация ингибитора в лунках данной серии, z - активность компонента С3, определенная при данной концентрации ингибитора, a z₀ - активность компонента С3 в отсутствие ингибитора, строя график зависимости l/z от [1]. При этом точка пересечения графика с осью абсцисс соответствует значению -К_i. Для адреналина получено значение К_i, равное 71,2 ± 21,0 мкг/мл или 0,32 ± 0,09 мМ, что совпадает с константой, полученной гемолитическим методом, 0,30 ± 0,07 мМ [3]. Таким образом, адреналин успешно ингибирует активированный С3b и может обладать противовоспалительным действием благодаря блокированию образования анафилатоксина С5а. В офтальмологической и оториноларингологической практике употребляют адреналин как сосудосуживающее (и противовоспалительное) средство в составе капель и мазей. При этом возникающая локальная концентрация адреналина лежит в области концентраций, достаточных для ингибирования активированного С3b и может объяснять его местное противовоспалительное действие.

ЛИТЕРАТУРА
1. Козлов Л.В., Ростовцева Л.И., Ломака Т.С., Сутовская Н.С., Сорокина И.Б., Баркова Т.И. //Биоорган. химия. 1985. Т. 11. С. 1510-1518.

2. Sim R.B., Twose T.M., Paterson D.S., Sim. E. // Biochem. J. 1981. V. 193.P. 115-127.

3. Козлов Л.В., Лебедева Т.В. // Биоорган. химия. 1998. Т. 24. С. 350-355.

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и касается способа определения прямого воздействия на функциональную активность компонентов комплемента различных веществ, в том числе лекарственных препаратов. Сущностью способа является определение ингибирующего действия веществ на комплемент по ингибированию связывания активированного компонента С3 системы комплемента человека на основе иммуноферментного метода, основанного на способности функционально активного компонента С3 образовывать С5-конвертазу классического пути при взаимодействии с С3-конвертазой. Ингибирующее действие того или иного вещества определяют по константе ингибирования. Техническим результатом является возможность получения индивидуальных констант ингибирования, простота определения и хорошая воспроизводимость результатов.

Способ определения ингибирующего действия веществ на комплемент, отличающийся тем, что сорбируют в лунках микропанели иммунохимически чистый иммуноглобулин G, в лунки микропанелей вносят цельную сыворотку морской свинки, проводят инкубацию, жидкое содержимое лунок удаляют, затем в серии лунок вносят в выбранных разведениях сыворотку человека, содержащую определенную для каждой серии концентрацию тестируемого вещества, в контрольной серии тестируемое вещество не вносят, после инкубации и удаления жидкого содержимого лунок вносят конъюгат фермента с антителами против компонента С3 человека и субстрат этого фермента, после чего проводят определение количества связавшегося компонента С3 по продукту ферментативной реакции и сравнивают данные о количестве связавшегося компонента С3 в присутствии определенных концентраций тестируемого вещества и в отсутствии тестируемого вещества определяют константу ингибирования этим веществом связывания активированного компонента С3.