СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДЕЙСТВИЯ ВЕЩЕСТВ НА КОМПЛЕМЕНТ (ВАРИАНТЫ) Российский патент 2001 года по МПК G01N33/544 

Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения прямого воздействия на функциональную активность компонентов комплемента различных веществ, в том числе лекарственных препаратов, в частности к способам определения ингибирующего действия веществ на компонент C4 комплемента в момент его активации.

Изобретение может быть использовано в медицине для определения механизма действия лекарственных веществ, для поиска потенциальных лекарственных веществ, изучения побочного действия лекарственных препаратов и воздействия экологически вредных веществ на организм.

В литературе имеются сведения о прямом влиянии различных лекарственных или диагностических препаратов на систему комплемента в крови больного, что может иметь своим результатом либо отрицательное побочное действие лекарственных препаратов, либо положительный эффект, возможно, что такое взаимодействие с системой комплемента в последнем случае и является механизмом лечебного действия препарата. Наиболее яркими примерами в этом отношении является действие лекарственных препаратов апрессина (гидралазина), купренила (пеницилламина) и каптоприла на компонент C4 комплемента человека [1-3] . Помимо лекарственных средств прямое действие на систему комплемента могут оказывать вещества эндогенной природы, собственные метаболиты организма, оказывающие регуляторное влияние, а также экзогенные вещества, в том числе загрязняющие окружающую среду, т.е. экологически вредные.

Как было показано в литературе [2], терапевтический эффект купренила, связанный с препятствием отложению иммунных комплексов, в частности в суставах, обусловлен его действием на компонент C4 комплемента системы комплемента в момент его активации. Тот же механизм в случае гидралазина [1] и каптоприла [51, т. е. действие на C4 и подавление способности комплемента обрабатывать иммунные комплексы может приводить к побочному действию этих препаратов. Известна способность гидралазина вызывать лекарственную волчанку.

Для определения способности веществ взаимодействовать с компонентом C4 комплемента известен способ, основанный на ингибировании связывания радиоактивно меченного компонента C4 с сефарозой с иммобилизованным активированным субкомпонентом Cls [1- 3]. Недостатками этого способа является необходимость получения чистых препаратов функционально активного компонента C4 и активного субкомпонента Cls и применения радиоактивности. С использованием этого способа авторы определили константы скорости реакции взаимодействия веществ с активированным C4, но не получили индивидуальных констант ингибирования, которые могли бы служить количественной характеристикой эффективности ингибирующих веществ. Кроме того, на основе этого способа трудно создать простую в обращении тест-систему, позволяющую характеризовать ингибирующие вещества в стандартных условиях.

Нами на основе иммуноферментного метода разработан способ, позволяющий определять ингибирование различными веществами функциональной активности компонента C4, состоящей в связывании активированного компонента C4 с естественной мишенью - иммуноглобулином или альбумином. Преимуществами предложенного метода является возможность получения индивидуальных констант ингибирования, простота определения, хорошая воспроизводимость результатов и отсутствие необходимости использования радиоактивности.

Способ осуществляется следующим образом: проводят сорбцию в лунках микропанели сначала активатора компонента C4, каковым являются активированный субкомпонент Cls или комплекс IgG с компонентом C1, при этом мишенью для связывания активированного компонента C4 в первом случае служит бычий сывороточный альбумин, а во втором - иммуноглобулин, затем в лунки микропанели вносят сыворотку крови человека в качестве источника компонента C4, содержащую ряд определенных концентраций тестируемого ингибитора в серии экспериментов, и проводят инкубацию. Для контроля исходной активности компонента C4 проводят эксперимент без ингибитора. Количество ковалентно связавшегося в результате активации компонента C4 определяют по продукту ферментативной реакции с помощью антител к C4 - фракции иммуноглобулинов G, ковалентно связанных с ферментом, и сравнивая данные о количестве связавшегося компонента C4 в присутствии различных концентраций ингибитора и в контроле без ингибитора определяют константу ингибирования связывания активированного компонента C4, характеризующую ингибирующую способность тестируемого вещества. Величина константы ингибирования, имеющая размерность концентрации, численно равна той концентрации тестируемого вещества, при которой функциональная активность компонента C4 - его способность ковалентно связываться с мишенью снижается вдвое. Эффективным ингибитором комплемента могут считаться вещества, для которых константа ингибирования, определенная этим способом, лежит в области реальных концентраций этих веществ в крови.

Способ основан на способности активированного компонента C4 ковалентно связываться с мишенью, расположенной в непосредственной близости от активатора, или с нуклеофильной группой конкурирующей молекулы ингибитора.

В качестве вещества, способного взаимодействовать с системой комплемента, выбрана салициловая кислота - известное противовоспалительное и антиревматическое средство. Действующим началом самого распространенного лекарства, аспирина, является салициловая кислота, в которую в результате гидролиза в организме превращается аспирин. Полученные по этому способу (двумя методами) константы ингибирования практически совпадают и соответствуют по порядку величин терапевтическим дозам препаратов.

Пример 1. Определение действия салициловой кислоты на комплемент. Растворяют иммунохимически чистый IgG или IgM в 0,05 М натрий-карбонатном буфере, pH 9,5, в концентрациях белка 10-100 мкг/мл и вносят по 100 мкл раствора в каждую лунку плоскодонной полистироловой 96-луночной микропанели. Закрывают крышкой и оставляют на ночь при 4^oC. Два раза отмывают планшет вероналовым буферным раствором, pH 7,4, содержащим 0,15 М NaCI, 0,15 мМ Ca²⁺ и 0,5 мМ Mg²⁺ (VBS²⁺), по 150 мкл в каждую лунку, затем планшет осушают путем вытряхивания остатка жидкости. Во все лунки планшета вносят по 100 мкл VBS²⁺ по 10 мкл сыворотки морской свинки и оставляют при комнатной температуре на 30 мин, затем содержимое лунок удаляют вытряхиванием. В другой микропанели с круглодонными лунками готовят серии двукратных разведений свежей сыворотки крови человека в VBS²⁺, общий объем в лунке 50 мкл. Затем во все лунки каждой серии вносят по 50 мкл раствора изучаемого ингибитора в определенной для каждой серии концентрации, а в контроле 50 мкл буфера без ингибитора, содержимое лунок этой микропанели переносят в первую микропанель. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37^oC, двукратной отмывки фосфатным буфером, pH 7,4, содержащим 0,15 М NaCI и 0,05% твин-20, и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл конъюгата пероксидазы с антителами против компонента C4 человека в том же буфере в подобранном разведении. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37^oC и двукратной отмывки с детергентом и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл субстратного буфера (10 мг ортофенилендиамина в 25 мл цитратно- фосфатного буфера, pH 5,0, и 50 мкл 3% перекиси водорода). После 30 мин инкубации в темноте реакцию останавливают внесением в каждую лунку 50 мкл 14% серной кислоты. Результаты реакции учитывают с помощью спектрофотометра с вертикальным лучом измерением светопоглощения при 492 нм. Функциональную активность препарата C4 рассчитывают по стандартной кривой для каждой концентрации ингибитора. Константу ингибирования K_i, определяют по линейному уравнению l/z = [1]/(z_oK_i) + l/z[4], где [1] - конечная концентрация ингибитора в лунках данной серии, z - активность компонента C4, определенная при данной концентрации ингибитора, a z_о - активность компонента C4 в отсутствие ингибитора, строя график зависимости l/z от [1]. При этом точка пересечения графика с осью абсцисс соответствует значению - K_i Для салициловой кислоты получено значение K_i = (0,46±0,05) мг/мл или K_i = (3,32±0,38) мМ. Поскольку эта концентрация салициловой кислоты лежит в области значений, реально достижимых в крови при применении ее качестве лекарственного средства, можно считать, что она эффективно действует на комплемент.

Пример 2. Определение действия салициловой кислоты на комплемент. Раствор 1 мкг/мл активированного субкомпонента Cls [5] в 0,05 М натрий-карбонатном буфере, pH 9,5, вносят по 100 мкл раствора в каждую лунку плоскодонной полистироловой 96-луночной микропанели. Закрывают крышкой и оставляют на ночь при 4^oC. Отмывают планшет вероналовым буферным раствором, pH 7,4, содержащим 0,15 М NaCl, 0,15 мМ Ca²⁺ и 0,5 мМ Mg²⁺ (VBS²⁺) и 0,3% бычьего сывороточного альбумина, по 150 мкл в каждую лунку, затем планшет осушают путем вытряхивания остатка жидкости. В другой микропанели с круглодонными лунками готовят серии двукратных разведений свежей сыворотки крови человека в VBS²⁺, общий объем в лунке 50 мкл. Затем во все лунки каждой серии вносят по 50 мкл раствора изучаемого ингибитора в определенной для каждой серии концентрации, а в контроле 50 мкл буфера без ингибитора, содержимое лунок этой микропанели переносят в первую микропанель. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37^oC, двукратной отмывки фосфатным буфером, pH 7,4, содержащим 0,15 М NaCl и 0,05% твин-20, и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл конъюгата пероксидазы с антителами против компонента C4 человека в том же буфере в подобранном разведении. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37^oC и двукратной отмывки с детергентом и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл субстратного буфера (10 мг ортофенилендиамина в 25 мл цитратно-фосфатного буфера, pH 5,0, и 50 мкл 3% перекиси водорода). После 30 мин инкубации в темноте реакцию останавливают внесением в каждую лунку 50 мкл 14% серной кислоты. Результаты реакции учитывают с помощью спектрофотометра с вертикальным лучом измерением светопоглощения при 492 нм. Функциональную активность препарата C4 рассчитывают по стандартной кривой для каждой концентрации ингибитора. Константу ингибирования K_i, определяют по линейному уравнению l/z = [1]/(z_oK_i,) + l/z[4], где [1] - конечная концентрация ингибитора в лунках данной серии, z - активность компонента C4, определенная при данной концентрации ингибитора, a z_o - активность компонента C4 в отсутствие ингибитора, строя график зависимости l/z от [1]. При этом точка пересечения графика с осью абсцисс соответствует значению - K_i. Для салициловой кислоты получено значение K_i, равное (0,39±0,07) мг/мл или (2,85± 0,50) мМ. Поскольку эта концентрация салициловой кислоты лежит в области значений, реально достижимых в крови при применении ее качестве лекарственного средства, можно считать, что она эффективно действует на комплемент.

Литература
1. Sim E., Law S.K.A. Hydralazin binds covalently to complement component C4. Dilfferent reactivity оf C4A and C4B gene products. FEBS Letters. 1985. V. 184. N 2. P. 323-327.

2. Sim E., Dodds A.W., Goldin A. Inhibition oh the covalent binding reaction of complement component C4 by penicillamine, an anti-rheumatic agent. Biochem. J. 1989. V. 259. P. 415-419.

3. Edmonds S., Gibb A., Sim E. Effect of thiol compound on human complement component C4. Biochem. J. 1993. V. 289. P. 801 - 805.

4. Козлов Л.В., Сизой М.Н., Зинченко А.А., ЛевковскийА.В. Ингибирование связывания и активация первого компонента комплемента человека. Действие синтетических пептидов, фрагментов иммуноглобулинов и некоторых белков. Биохимия. 1986. Т. 51. N 5. С. 707-718.

5. Козлов Л. В. , Шойбонов Б.Б., Иванов А.E., Зубов В.П., Антонов В.К. Ступенчатая диссоциация субкомпонентов C1, первого компонента комплемента человека, при активации на аффинном сорбенте. Биохимия. 1989. Т. 54. N 10. С. 1754-1760.

Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения прямого воздействия на функциональную активность компонентов комплемента различных веществ, в том числе лекарственных препаратов. Способ позволяет определять действие вещества на комплемент по ингибированию связывания активированного компонента C4 системы комплемента человека на основе иммуноферментного метода. Проводят сорбцию в лунках микропанели сначала активатора компонента C4, в качестве которого используют активированный субкомпонент Cls или комплекс IgG с компонентом Cl. Затем в лунки микропанели вносят сыворотку крови человека в различных разведениях в качестве источника компонента C4, содержащую в серии экспериментов определенные концентрации тестируемого вещества, а в контрольной серии - не содержащую ингибитор. Проводят инкубацию. Количество ковалентно связавшегося в результате активации компонента C4 определяют по продукту ферментативной реакции с помощью антител к C4 - фракции иммуноглобулинов G, ковалентно связанных с ферментом. Сравнивая данные о количестве связавшегося компонента C4 в присутствии и в отсутствие ингибитора определяют константу ингибирования тестируемым веществом связывания активированного компонента C4. По величине константы ингибирования судят о действии вещества на комплемент. Способ позволяет получить индивидуальные константы ингибирования, прост, обладает высокой воспроизводимостью результатов и отсутствием необходимости использования радиоактивности. 2 с.п. ф-лы.

1. Способ определения действия веществ на комплемент, отличающийся тем, что сорбируют в лунках микропанели неспецифические иммуноглобулины G или M человека или животных, в лунки микропанелей вносят цельную сыворотку морской свинки, проводят инкубацию, жидкое содержимое лунок удаляют, затем в серии лунок вносят в выбранных разведениях сыворотку человека, содержащую определенную для каждой серии концентрацию тестируемого вещества, в контрольной серии тестируемое вещество не вносят, после инкубации и удаления жидкого содержимого лунок вносят конъюгат фермента с антителами против компонента C4 человека и субстрат этого фермента, после чего проводят определение количества связавшегося компонента C4 по продукту ферментативной реакции и, сравнивая данные о количестве связавшегося компонента C4 в присутствии определенных концентраций тестируемого вещества и в отсутствие тестируемого вещества, определяют константу ингибирования этим веществом связывания активированного компонента C4, по величине константы судят о действии тестируемого вещества на комплемент. 2. Способ определения действия веществ на комплемент, отличающийся тем, что сорбируют в лунках микропанели активированный субкомпонент CIs комплемента и сывороточный альбумин, затем в серии лунок вносят в выбранных разведениях сыворотку человека, содержащую определенную для каждой серии концентрацию тестируемого вещества, в контрольной серии тестируемое вещество не вносят, после инкубации и удаления жидкого содержимого лунок вносят конъюгат фермента с антителами против компонента C4 человека и субстрат этого фермента, после чего проводят определение количества связавшегося компонента C4 по продукту ферментативной реакции и, сравнивая данные о количестве связавшегося компонента C4 в присутствии определенных концентраций тестируемого вещества и в отсутствие тестируемого вещества, определяют константу ингибирования этим веществом связывания активированного компонента C4, по величине константы судят о действии тестируемого вещества на комплемент.