БИОЛОГИЧЕСКАЯ ИСКУССТВЕННАЯ ПЕЧЕНЬ Российский патент 2001 года по МПК A61M1/36 

Изобретение относится к медицине и медицинской технике. Из литературы известно о разработке и экспериментальном клиническом применении систем, предназначенных для компенсации функций пораженной печени. Такие системы содержат биологически активные клетки печени (гепатоциты), размещенные в биореакторе, который подключается к кровотоку пациента. Предполагается, что гепатоциты при этом выполняют функции вспомогательной печени, и, возможно, стимулируют регенеративные процессы в печени больного. В ряде случаев показана эффективность использования таких систем для лечения печеночной недостаточности (ПН).

Основным элементом системы "Биологическая искусственная печень" является биореактор. Биореактор, с одной стороны, должен обеспечивать содержание достаточно большого количества гепатоцитов, 5-10% от веса печени пациента, поскольку, согласно экспериментальным данным. именно такое количество необходимо для поддержания функций печени. С другой стороны, биореактор должен иметь небольшой объем заполнения жидкостью, не более 5-10% объема крови пациента. Следовательно, биореактор должен обеспечивать поддержание высокой функциональной активности большого количества гепатоцитов в малом объеме, то есть, при плотности распределения клеток, приближающейся к тканевой.

Известен биореактор для лечения ПН, включающий в себя корпус, содержащий пучок полупроницаемых полых волокон, вокруг которых размещены живые изолированные гепатоциты, а внутри волокон осуществляется проток крови (плазмы) больного (см.: Патент США N 5,043.260, 27.08.1991).

Недостатком биореактора является то, что в нем используются изолированные гепатоциты, технология получения которых достаточно трудоемкая и дорогостоящая. Другим недостатком является усложнение технологии подготовки биореактора к использованию, связанное с необходимостью иммобилизации клеток при помощи специальных агентов, поскольку без этой процедуры изолированные гепатоциты быстро утрачивают функциональную активность.

Известен также аппарат для лечения ПН, в котором использованы срезы ткани печени с живыми клетками в них, размещенные слоями в перфузируемом биореакторе (см. : Am. J. Surg., 1973, vol. 126, July, p.20-24). Приготовление срезов ткани является более простой и менее дорогостоящей процедурой, чем выделение изолированных гепатоцитов. При этом сохраняется естественное тканевое микроокружение гепатоцитов, что обеспечивает длительное сохранение ими высокой функциональной активности.

Недостатком биореактора является способ размещения срезов ткани в биореакторе, что приводит к ограниченному массообмену между биологической жидкостью и гепатоцитами. Срезы не распределены равномерно по всему объему реактора, а скомпонованы в виде плат. Это ухудшает обтекание жидкостью каждого среза в отдельности. Кроме того, массообмен между жидкостью и плоской поверхностью среза, а тем более платы, осуществляется в одном направлении, перпендикулярном к поверхности ткани, т.е. является одномерным, следовательно - ограниченным.

Наиболее близким, принятым за прототип, является Искусственная печень (см.: Патент США N 5,270,192, 14.12.93). Аппарат представляет собой биореактор колоночного типа. Он состоит из корпуса с патрубками для подвода и отвода биологической жидкости, заполненного частицами нейтрального носителя и гепатоцитами. В качестве частиц носителя используются стеклянные шарики диаметром 1-3 мм. Частицы носителя создают объемную матрицу, в которой в пустотах между частицами формируются и удерживаются многоклеточные агрегаты гепатоцитов. Биологическая жидкость перфузируется через колонку сверху вниз и непосредственно омывает клеточные агрегаты, распределенные с помощью носителя по всему объему реактора.

Недостатками аппарата являются использование в нем изолированных гепатоцитов и необходимость формирования клеточных агрегатов в реакторе путем пропускания через него суспензии клеток в течение 2-х или более часов. При этом размеры формирующихся агрегатов не контролируются, что может приводить к возникновению некрозов в центре больших агрегатов. Кроме того, существует возможность неравномерного пространственного распределения клеточных агрегатов в реакторе. Это может создать неоднородности в потоке жидкости через реактор, т. е. неодинаковое смывание клеточных агрегатов, и ухудшить массообмен между гепатоцитами и жидкостью. Пространственное распределение агрегатов клеток в данном аппарате обеспечивается носителем - шариками из стекла, в пустотах между которыми формируются агрегаты. Каждый агрегат непосредственно прилегает к одному или к большему числу стеклянных шариков. При этом стекло изолирует агрегат от жидкости и таким образом существенно ограничивает его массообмен.

Целью настоящего изобретения является создание биологической искусственной печени, которая позволяет упростить использование биологически активных гепатоцитов, обеспечить эффективный массообмен между гепатоцитами и биологической жидкостью (кровью, плазмой) и добиться улучшения биохимических показателей крови и выживаемости при лечении острого поражения печени.

Поставленная цель достигается тем, что в известной биологической искусственной печени, содержащей корпус с патрубками для подвода и отвода биологической жидкости, частицы нейтрального носителя и гепатоциты, согласно предлагаемому изобретению, гепатоциты находятся во фрагментах ткани печени, частицы носителя выполнены из диффузионно проницаемого материала, фрагменты ткани и частицы носителя берутся в количественном соотношении 1:2 - 1:10 и имеют размеры a·a·b, где a=0,4-0,6 мм, b=0.4-3 мм. В частном случае частицы носителя выполнены из агарозного геля.

Использование тканевых фрагментов печени существенно упрощает применение гепатоцитов в биологической искусственной печени. Нарезка ткани печени является быстрым и технологически отработанным процессом, при этом не нужны дорогостоящие ферменты и ростовые среды. При нарезке сохраняется природный межклеточный матрикс, что обуславливает длительную высокую функциональную активность гепатоцитов.

Применение частиц, выполненных из диффузионно проницаемого материала, позволяет улучшить массообмен между гепатоцитами и биологической жидкостью. Это обеспечивается тем, что массообмен происходит теперь не только при непосредственном контакте ткани и жидкости, но и в местах тесных контактов частиц ткани и носителя путем диффузии веществ через материал носителя и далее в жидкость.

Фрагменты ткани и частицы носителя берутся в количественном соотношении 1: 2 - 1:10 и имеют размеры а·а·в, где а=0.4-0.6 мм, в=0.4-3 мм. Фрагменты ткани указанных размеров содержат всего несколько тысяч клеток, что позволяет избежать ограничений для массообмена между гепатоцитами, расположенными внутри фрагментов, и биологической жидкостью. При количественном соотношении фрагментов ткани и частиц носителя 1:2 - 1:10 обеспечивается сохранение их однородного пространственного расположения в биореакторе в потоке биологической жидкости. При меньшем соотношении ухудшается пространственная изоляция фрагментов друг от друга, возрастает количество непосредственных контактов между фрагментами. Такое слипание фрагментов ухудшает массообмен гепатоцитов с биологической жидкостью. Кроме того, с увеличением доли тканевых фрагментов возрастает вероятность образования больших пластов ткани в результате деформации и слипания фрагментов, что приводит к остановке потока и отказу системы. Соотношение между частицами носителя и фрагментами ткани больше 1:10 приведет к неоправданному увеличению объема реактора, который, как упоминалось, должен быть небольшим.

В частном случае в качестве материала частиц носителя используется агарозный гель. Агарозный гель хорошо проницаем даже для высокомолекулярных соединений, например белков, а для низкомолекулярных соединений скорость диффузии в агарозном геле практически не отличается от скорости диффузии в воде. Агароза биологически инертна, обладает низкой тромбогенностью. Плотность частиц носителя, изготовленных из агарозного геля, близка к плотности фрагментов ткани, что определяет их однородное распределение после перемешивания и оседания. Гель агарозы легко приготавливается и нарезается до нужных размеров. Преимуществом использования геля является также то, что в него можно ввести в процессе приготовления антикоагулянты, например гепарин, с целью уменьшения тромбогенности частиц носителя, что может оказаться важным при его практическом использовании.

Таким образом, предлагаемая биологическая искусственная печень позволяет использовать гепатоциты в технологически наиболее простом варианте - в виде фрагментов ткани печени. Использование пористого носителя из агарозного геля и выбор указанных размеров частиц носителя и фрагментов ткани, а также их количественного соотношения обеспечивают эффективный массообмен между гепатоцитами и потоком биологической жидкости (крови, плазмы), что является необходимым условием для лечения ПН.

На чертеже приведена схема аппарата.

Предложенная биологическая искусственная печень состоит из корпуса 2 с патрубками для подвода 1 и отвода 6 биологической жидкости и фильтром 5. Биореактор содержит частицы носителя 3 и размещенные между ними фрагменты печени 4.

Аппарат работает следующим образом. Фрагменты ткани печени размерами a·a·b, где a=0.4-0.6 мм, b=0.4-3 мм, приготавливаются с помощью специального прибора, обеспечивающего стандартность размеров фрагментов при нарезке мягких тканей и сохранение жизнеспособности клеток в них (Н. McIlwain, H.L. Buddle, Biochem. J. , 1953, v.53, 3, 412-420). Частицы носителя таких же размеров и формы нарезаются из застывшего агарозного геля (2-5% агарозы в 0.8%-ном растворе NaCl с добавлением 100 ед гепарина на 1 мл геля). В аппарат вносят взвесь частиц носителя в фосфатном буфере, затем взвесь фрагментов ткани в объемном соотношении 2:1 - 10:1 и перемешивают их. После оседания частиц осуществляется проток 0.8%-ного раствора NaCl через биореактор с помощью перистальтического насоса в течение 30 мин. После этого гепаринизированная кровь (артериальная или оксигенированная венозная) или плазма крови подается в аппарат с помощью перистальтического насоса, пропускается через слой носителя с фрагментами ткани и возвращается в венозное русло. Фильтр обеспечивает удержание фрагментов ткани и частиц носителя в биореакторе. Продолжительность процедуры - несколько часов. После завершения цикла экстракорпоральной перфузии аппарат отключается от кровотока.

Пример 1. Крыса линии Wistar, вес 360 г, самец, экспериментальное острое токсическое поражение печени, вызванное введением интраперитонеально четыреххлористого углерода за 24 часа до подключения. В момент подключения к биологической искусственной печени уровень аланинтрансаминазы (АЛТ) в крови увеличен в 57 раз и уровень лактатдегидрогеназы (ЛДГ) - в 11 раз по сравнению с нормой. Размеры фрагментов ткани печени и частиц носителя -0.4 x 0.4 x 0.4-1 мм. Соотношение фрагментов ткани и частиц носителя - 1:6. Объем биореактора - 6 мл, длительность подключения 4 ч, скорость перфузии крови 30 мл/ч. В ходе подключения анализировались содержание в крови аммония, повышение уровня которого в крови при острой ПН играет основную роль в развитии энцефалопатии с последующей гибелью. Наблюдалось снижение уровня аммония в крови с 343 мкМ в начале до 200 мкМ в конце подключения при норме 40 мкМ. В дальнейшем животное выжило. Люминесцентный микроскопический анализ показал сохранение жизнеспособности гепатоцитов в биореакторе после 4 ч подключения к животному. Подключение другого животного с аналогичными параметрами острого токсического поражения печени к биореактору, заполненному частицами носителя, без фрагментов печени, не вызвало уменьшение аммония в крови. Содержание аммония в крови продолжало возрастать и животное погибло.

Пример 2. Крыса линии Wistar, вес 380 г, самец, экспериментальное острое токсическое поражение печени, вызванное введением интраперитонеально четыреххлористого углерода за 24 ч до подключения. В момент подключения уровень АЛТ увеличен в 24 раза по сравнению с нормой, уровень ЛДГ - в 5.5 раза по сравнению с нормой. Размеры фрагментов ткани печени и частиц носителя - 0.6 x 0.6 x 1-3 мм, соотношение фрагментов ткани и частиц носителя - 1:2. Объем биореактора - 4.5 мл, длительность подключения 4 ч, скорость перфузии крови 30 мл/ч. В ходе подключения анализировалось содержание в крови глюкозы, уровень которой в норме поддерживается печенью на постоянном уровне и снижается при ПН пропорционально тяжести поражения. Наблюдалось повышение уровня глюкозы в крови с 7.4 мМ в начале до 10.0 мМ в конце подключения при нормальном значении 11.4 мМ. В дальнейшем животное выжило. Подключение другого животного с аналогичными параметрами острого токсического поражения печени к биореактору, заполненному частицами носителя без фрагментов печени, не обеспечило нормализацию уровня глюкозы. Содержание глюкозы в крови продолжало падать и животное погибло.

Пример 3. Крысы-самцы линии Wistar весом 350-410 г с экспериментальным острым токсическим поражением печени, вызванным введением интраперитонеально четыреххлористого углерода за 24 ч до подключения, подключались к аппарату, содержащему фрагменты ткани и частицы носителя (опыт, 6 животных) и к аппарату, содержащему только частицы носителя (контроль, 5 животных). Объем биореактора - 5-6 мл, отношение количества фрагментов ткани и частиц носителя 1: 4, размеры фрагментов ткани печени и частиц носителя - 0.5 x 0.5 x 1-3 мм, длительность подключения 4 ч, скорость перфузии крови 30 мл/ч. Показано статистически достоверное улучшение биохимических параметров крови (аммоний, глюкоза, ряд аминокислот), гибель животных составила в опыте 17%, в контроле - 60%.

Таким образом, предлагаемый аппарат позволяет упростить использование биологически активных гепатоцитов за счет применения фрагментов печени, обеспечить эффективный массообмен между гепатоцитами и потоком биологической жидкости (крови, плазмы) за счет выбора пористого носителя, размеров частиц носителя и фрагментов ткани, а также их количественного соотношения, и позволяет добиться улучшения биохимических показателей крови и выживаемости при лечении острого поражения печени.

Изобретение относится к медицине и медицинской технике и предназначено для компенсации дисфункций печени. Биологическая искусственная печень содержит корпус с патрубками для подвода и отвода биологической жидкости, заполненный однородной смесью частиц нейтрального носителя, выполненного из диффузионно проницаемого материала, и фрагментов ткани печени. Фрагменты ткани и частицы носителя берутся в количественном соотношении 1 : 2 - 1 : 10 и имеют размеры а·а·в, где а = 0,4 - 0,6 мм, в = 0,4 - 3 мм. Технический результат: улучшение биохимических показателей крови и выживаемости при лечении острого поражения печени. 1 з.п. ф-лы, 1 ил.

1. Биологически искусственная печень, содержащая корпус с патрубками для подвода и отвода биологической жидкости, включающий гепатоциты и частицы нейтрального носителя, отличающаяся тем, что гепатоциты расположены во фрагментах ткани печени, частицы носителя выполнены из диффузионно проницаемого материала, при этом фрагменты ткани и частицы носителя смешаны в количественном соотношении 1 : 2 - 1 : 10 и имеют размеры а·a·b, где а = 0,4 - 0,6 мм, b = 0,4 - 3 мм. 2. Биологически искусственная печень по п.1, отличающаяся тем, что частицы носителя выполнены из агарозного геля.