БОГАТЫЕ ГИДРОКСИПРОЛИНОМ БЕЛКИ И СОДЕРЖАЩИЕ ИХ КОСМЕТИЧЕСКИЕ ПРЕПАРАТИВНЫЕ ФОРМЫ Российский патент 2001 года по МПК C12P21/00 C07K14/78 

Изобретение относится к обогащенным гидроксипролином гликопротеинам, которые могут быть получены из растительных источников, и к их фармацевтическому и косметическому использованию.

Более конкретно, изобретение относится к богатым гидроксипропином гликопротеинам, которые могут получаться с помощью кислотно-спиртовой экстракции из культур клеток Taxus spp., Gingko biloba, Lycopersicum esculentum и Daucus carota, имеющим следующие характеристики:
- средняя молекулярная масса 20000 Дальтон с интервалом изменчивости от 12000 до 38000, определенная гель-фильтрацией и электрофорезом;
- растворимость в кислотных водных растворах.

Известно, что некоторые гликопротеины животного происхождения, такие как коллаген и протеогликаны, проявляют благотворное действие на кожу при местном нанесении как таковые или будучи включенными в подходящие препаративные формы.

Коллаген, являющийся гликопротеином, богатым пролином и гидроксипролином, применяют особенно, как таковой или в комбинации с другими полипептидными основаниями при лечении от морщин и других неэстетичных пятен, связанных с плохой гидратацией и эластичностью кожи. Однако коллаген животного происхождения имеет ограничения в его использовании вследствие риска загрязнения вирусами и токсинами. Хотя соединения растительного происхождения не связаны с подобным риском, до сих пор их использование в косметике было крайне ограниченным: например, известны косметические препаративные формы, которые содержат неочищенные экстракты таких растений, как Aloe или даже целые измельченные растительные продукты, такие как авокадо.

Известны растительные гликопротеины, называемые эстенсинами, которые получают из клеток растений в стадии пролиферации и которые имеют структуру, подобную коллагену животных. В EP-A-05334078 описывается косметическое применение экстенсинов, имеющих среднюю молекулярную массу более 100000 Дальтон. Однако способы экстракции экстенсинов, описанные до настоящего времени, которые предусматривают экстракцию растительных материалов различного происхождения с помощью водных солевых растворов с последующей очисткой сильными кислотами, такими как трихлоруксусная кислота, не позволяют получать продукты, подходящие для косметики, вследствие проблем, относящихся к растворимости, воспроизводимости и стойкости их химико-физических характеристик.

В настоящее время обнаружено, что можно получить богатые гидроксипролином гликопротеины, структурно сходные с вышеописанными экстенсинами, но с меньшей мол. массой и более высокой растворимостью в кислотных водных растворах, при помощи способа, включающего культивирование in vitro клеток выбранных растений и экстракцию кислотно-спиртовыми растворами клеток, растущих в подходящей среде.

Гликопротеины, получаемые согласно данному изобретению, имеют гидратирующие, пленкообразующие, тонирующие и способствующие рубцеванию свойства, более высокого уровня, чем свойства коллагена. Гликопротеины данного изобретения могут, следовательно, применяться в косметических или дерматологических препаративных формах для лечения сухой кожи, псориаза, ихтиоза, перхоти, кератоза, морщин, угрей, экземы, воспалительного дерматоза, старения кожи и во всех других областях применения, для которых предполагалось применение животного коллагена.

Водные растворы гликопротеинов данного изобретения остаются стабильными без какой-либо полимеризации гликопротеинов, ведущей к образованию нерастворимых продуктов. Кроме того, вязкость этих растворов особенно высока и не зависит от концентраций; 0,1% концентрации неожиданно имеют ту же самую пленкообразующую и гидратирующую силу, какую имеют растворы 1% коллагена или 5% растительного альбумина.

Подлежащий экстракции растительный материал получают из культивируемых в ферментере культур клеток Taxus spp., Gingko biloba, Lycopersicum esculentum и Daucus carota. Особенно предпочтительно, использование клеток из видов Taxus spp., Gingko biloba и Lycopersicum esculentum. Приемы культивирования клеток являются обычными и включают использование суспензионной культуры, получаемой, исходя из культур каллусов из раз личных частей этих растений, таких как листья, кора, корни, ствол или семена, как описано авторами Dobbs и Roberts, Experiments in Plant Tissue Culture, 2nd ed. Cambridge University Press, New York, 1985.

Растительную ткань каллуса после стерилизации и необязательного добавления антибактериальных агентов обычно используют для инокулюма подходящих жидких культуральных сред, как описано в вышеупомянутом руководстве Dobbs и Roberts. Особенно подходящей средой для данного изобретения является среда Скуга и Мурашиге. Добавление специфических добавок, таких как пролин, восстанавливающие агенты, этилен или соединения, способные высвобождать этилен, такие как Ethephon или L- аминоциклопропанкарбоновая кислота, могут быть подходящими для увеличения продуктивности или выработки желательных гликопротеинов.

Предпочитается использованием нафтилуксусной кислоты, такой как ауксин, 6-(γ,γ-диметиламино)-пурина в качестве цитокинина, витаминов и 3% сахарозы в качестве источника углерода.

В зависимости от выбранного материала может быть полезным добавление витамина C для предотвращения приобретения конечным продуктом коричневого цвета.

Время ферментации может варьировать от 3 до 12 дней и составляет предпочтительно, между 5-6 дней. Сразу же по завершении ферментации культуральную среду центрифугируют и клеточную массу экстрагируют спиртами, предпочтительно этанолом, в присутствии разбавленных минеральных кислот, предпочтительно, соляной или серной кислоты. Данная процедура инактивирует некоторые ферменты, которые могут подвергать опасности стабильность гликопротеинов данного изобретения, в частности, полифенолоксидазу и тирозиноксидазу, которые способствуют полимеризации гликопротеинов с последующим образованием нерастворимых продуктов.

Спиртовая экстракция в присутствии минеральных кислот делает возможной полную экстракцию основных гликопротеинов, и оказалась в конечном итоге крайне избирательной. Помимо этанола можно использовать другие смешиваемые с водой спирты, такие как метанол или изопропанол. Полученные водно-спиртовые экстракты нейтрализуют и затем концентрируют и нагревают до температуры 70-100^oC, предпочтительно около 80^oC, до завершения осаждения денатурированных белков. Затем суспензию осветляют концентрированием и жидкость подвергают фракционной ультрафильтрации для удаления высокомолекулярных и низкомолекулярных веществ. Ультрафильтрацию выполняют с применением полисульфоновых мембран, имеющих отсечение молекулярных масс 10000-40000 Дальтон, таких как Centricon^R или Romicon^R, волокна которых могут быть полыми или альтернативно скрученными. Полученный отфильтрованный продукт подвергают электродиализу для удаления нежелательных веществ, таких как соли и низкомолекулярные сахара. После фильтрования и диализа полученный раствор можно использовать как таковой в косметических или фармацевтических препаратах или его можно сконцентрировать до меньшего объема и затем лиофилизировать или тонко измельчать.

Аналитическую характеристику продуктов данного изобретения проводили с помощью гель-фильтрации с применением жидкостного хроматографа высокого давления, состоящего из насосной установки (Waters pump unit) и снабженного батареей колонок (Ultrahydrogel Linear Waters^R) 30х0,5 см и УФ-детектором поглощения (Waters UV absorbtion detektor, model 484). В качестве элюента использовали водный раствор, содержащий 0,067 М монокалийфосфат, 0,1 М NaCl и 6·10^-4 М NaN₃. Анализируемые пробы гликопротеина растворяли в том же растворе элюента (3 мг/10 мл) и ступенчатых количествах вещества, а также стандартных веществах, выбранных в качестве стандартов молекулярных масс, между цитохромом C (12400 Дальтон) и декстраном синим (2000000 Дальтон), продукты или их промежуточные продукты могут определяться альтернативно или одновременно при помощи электрофореза на 12,5% попиакриламидном геле и 4% концентрирующем геле. Анализируемые пробы растворяют в буфере, содержащем ДСН и 0,1% меркаптоэтанол, выбирая количества между 100 мг и 300 г. Миграцию проводят при постоянном токе при 20 мА в течение 4 ч. Калибровочную кривую строят с использованием 5 стандартов молекулярных масс (7, 14, 24, 54 и 66 кД). Молекулярные массы 22,5 и 25 кД вычисляют на основании этой калибровочной кривой для двух основных полос, а молекулярные массы 31 и 34 кД вычисляют для менее интенсивных полос. Описанные здесь процедуры дают смеси продуктов со сравнимыми молекулярными массами и сравнимыми аминокислотными составами из различных клеточных эксплантатов, происходящих из различных растений. Результаты аминокислотного анализа гликопротеинов, экстрагированных из клеток Gingko biloba, представлены ниже в качестве примера.

Аминокислота - Площадь пика, %
Asp - 4,399
Glu - 4,328
Hyp - 17,505
Ser - 7,065
Gly - 6,056
Hys - 1,782
Arq - 2,471
Thr - 4,739
Pro - 10,036
Ala - 8,2
Туг - 2,388
Val - 6,162
Met - 1,154
Ile - 2,479
Leu - 5,525
Phe - 1,862
Lys - 14,254
Представленные выше данные относятся к проценту от общего количества аминокислот, присутствующих в смеси гликопротеинов. Сахара в этой смеси представляют собой арабинозу и галактозу. Отношение аминокислот к сахарам равно в среднем 2:1 для различных продуктов.

Как упоминалось выше, продукты данного изобретения можно использовать как в области фармацевтики, так и в области косметики. Для фармацевтики продукт может включаться в гели или мази или наноситься на насыщаемые медицинским препаратом марли для специальной обработки ожогов или ран. В данном случае продукт обычно подвергают стерилизации или стерильному фильтрованию и лиофилизации.

Косметические и дерматологические препараты данного изобретения могут быть приготовлены согласно традиционным способам. Примерами форм введения являются водные спреи, лосьоны, растворы, эмульсии, гели, мази и кремы.

Косметические и дерматологические препараты данного изобретения могут содержать богатые гидроксипролином гликопротеины в количестве от приблизительно 0,01 до приблизительно 50 мас.%, предпочтительно от 0,05 до 5 мас.%, а также обычные наполнители. С данной высокой стабильностью гликопротеинов данного изобретения могут быть получены фармацевтические и косметические препараты, содержащие более 50% растворимых богатых гидроксипролином гликопротеинов.

Гликопротеины данного изобретения могут добавляться к фармацевтическим и косметическим препаратам как таковые или они могут микроинкапсулироваться таким образом, чтобы обеспечить долговременное гидратирующее действие. Микрокапсулы могут быть или гидрофильными или липофильными. Препараты данного изобретения могут включать другие активные ингредиенты, имеющие дополняющую или полезную активность для желаемых целей.

Далее данное изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1
Получение каллуса и жидкой культуры Gingko biloba для производства гликопротеинов
Приготавливают эксплантат молодых листьев Gingko biloba промыванием листьев в растворе 0,1% Твина 80 (Tween 80^R). Листовые пластинки разрезают на участки примерно 0,5 см и предварительно стерилизуют в течение 1 мин 75%-ным этанолом. Затем стерилизацию завершают 2%-ным раствором гипохлорита натрия и трехкратным промыванием эксплантата в стерильной воде. Полученные эксплантаты переносят в чашку Петри в среде Мурашиге и Скуга, содержащей 3%-ную сахарозу, с добавлением витаминов Линсмейера и Скуга и гормонов, таких как 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота и нафтилуксусная кислота. Продукты инкубируют в темноте при 23^oC в течение 20 дней. В конце данного периода получают рыхлые каллусы, которые легко растут и развиваются непрерывными рядами при субкультивировании в тех же самых условиях, в которых они могут использоваться для размножения в жидкой среде. Каллусы используют для иннокулирования колб Эрленмейера, содержащих 200 мл среды Мурашиге и Скуга, с добавлением нафтипуксусной кислоты и 6-(γ,γ-диметиламино)-пурина, витаминов Линсмейера и Скуга и 3% сахарозы в качестве источника углерода. Колбы инкубируют с перемешиванием на непрерывном свету в течение 4 дней, после чего биомассу клеток собирают для экстракции гликопротеинов.

Пример 2
Получение гликопротеинов из клеток Gingko biloba
5 л культуры, полученной согласно примеру 1, центрифугируют при низкой скорости и собранные клетки (1,5 кг сырого веса) экстрагируют 1,5 л 70%-ного этанола, содержащего 1%-ную серную кислоту. Экстракцию повторяют дважды, извлекая тем самым количественно основные гликопротеины. После нейтрализации экстракты фильтруют для удаления мути и концентрируют в вакууме при 50^oC до полного удаления этанола. Водный концентрат нагревают при 85^oC в течение 30 мин и центрифугируют снова для удаления осадка, который отбрасывают. Полученный прозрачный раствор ультрафильтруют с использованием мембраны Centricon^R с границей отсечения 40000 Дальтон для исключения веществ с высокими молекулярными массами.

Затем отфильтрованный продукт ультрафильтруют с использованием мембраны с полыми волокнами с отсечением 10000 дальтон для удаления не-гликопротеиновых, низкомолекулярных веществ. Затем фильтрат подвергают диализу и концентрируют до 1% твердого остатка. Получают 1,5 л слегка вязкого продукта, который используют как таковой в косметических препаративных формах. При анализе с применением электрофореза продукт содержал 6 полос, 4 из которых имели молекулярные массы 16000, 22000, 33000 и 36000 Дальтон.

Пример 3
Получение гликопротеинов из Lycopersicum esculentum
Следуя процедуре примера 1, приготавливают клеточную массу из стерильных почек Lycopersicum esculentum в 14-литровом ферментере, содержащем 10 л среды Мурашиге и Скуга с добавлением нафтилуксусной кислоты и 6-(γ,γ-диметиламино)-пурина, витаминов Линсмейера и Скуга и 3% сахарозы в качестве источника углерода. Ферментацию проводят в течение 5 дней при 23^oC при перемешивании при 150 об/мин в присутствии дрожжевого экстракта с концентрацией 0,05% и с концентрацией растворенного кислорода, равной приблизительно 70%. В конце ферментации бульон собирают и микрофильтруют через керамическую мембрану 0,2 мкм для концентрирования клеток. К полученной таким образом клеточной пасте добавляют некоторое количество изопропанола, и для экстракции используют способ, описанный в примере 2. Получают 3,5 л раствора с 0,5% сухого остатка. Анализ лиофилизированных растворов давал соответственно содержание пролина 10% и содержание гидроксипролина 31%.

Пример 4
Косметическая препаративная форма
100 г эмульсии масло в воде содержит, г:
Раствор примера 2 или 3 - 10,0
Ацетилированный ланолиновый спирт PEG-10 - 2,0
Цетиловый-стеариловый спирт - 1,5
Цетилпальмитат - 2,0
Стеариновую кислоту - 7,0
Октилоктаноат - 7,5
Цетилфосфат калия - 0,5
Консерванты - По необходимости
Ароматизатор - По необходимости
Очищенную воду - Сколько необходимо до 100
Пример 5
Косметическая препаративная форма
100 г эмульсии масло в воде содержит, г:
Раствор примера 2 или 3 - 10,0
Цетилстеарилглюкозид - 5,0
Масло жожоба - 10,0
Изопропилмиристат - 8,0
Диметикон - 0,5
Антиоксидант - По необходимости
Консерванты - По необходимости
Ароматизатор - По необходимости
Очищенную воду - В количестве необходимом до 100
Дополнительные экспериментальные данные.

Пример 6
Косметическая препаративная форма
Раствор в воде, г:
Раствор смеси примера 2 или 3 - 2,00
Имидазолидинилмочевина - 0,30
Метилпарабен - 0,20
Гидроксиэтилцеллюлоза - 2,00
Пример 7
Косметическая препаративная форма
Гель, г:
Раствор смеси примера 2 или 3 - 1,00
Пропиленгликоль, диазолидинилмочевина, метилпарабен, пропилпарабен - 1,00
Очищенная вода - По необходимости до 100 млт

Изобретение относится к богатым гидроксипролином гликопротеинам, которые имеют среднюю молекулярную массу 20000 Дальтон и высокую растворимость в воде. Гликопротеины получают кислотно-спиртовой экстракцией из культур клеток Taxus spp., Gingko biloba, Lycopersicum esculentum и Daucus carota. Гликопротеины данного изобретения могут применяться в косметических препаративных формах, в которых ранее предполагалось использование животного коллагена. 2 c. и 1 з.п. ф-лы.

1. Смесь обогащенных гидроксипролином гликопротеинов (HPRG), получаемая кислотно-спиртовой экстракцией из Gingko biloba, Lycopersicum esculentum или из культур их клеток в соответствии со способом, который включает а) культивирование Gingko biloba, Lycopersicum esculentum и клеток в жидкой среде в течение 3 - 12 дней, б) экстракцию полученной массы клеток смешиваемыми с водой спиртами в присутствии разбавленных минеральных кислот, с) нейтрализацию, концентрирование и нагревание экстрактов при температуре 70 - 100^oC, д) центрифугирование с отбрасыванием осадка, фракционную ультрафильтрацию и диализ супернатанта, причем указанные обогащенные гидроксипролином гликопротеины (HPRG) имеют среднюю молекулярную массу 20000 дальтон с интервалом изменчивости 12000 - 38000 дальтон, определенную с помощью гель-фильтрации и электрофореза. 2. Косметический препарат для гидратации кожи, включающий в качестве активного агента смесь гликопротеинов по п.1. 3. Косметический препарат по п.2 в форму водного спрея, лосьона, раствора, эмульсии, геля, мази, крема.