ПРОИЗВОДНЫЕ ТАКСАНА, СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ, ФАРМКОМПОЗИЦИЯ Российский патент 1998 года по МПК C07C67/293 C07C67/00 C07C69/618 A61K31/22 

Изобретение касается новых производных 3,11- циклотаксана, их получения и использования в онкологии.

Новые соединения имеют общую формулу I:
,
в которой каждый из R' и R'', независимо друг от друга, является водородом или алканоилом с 2-7 углеродными атомами.

Циклотаксан формулы Ia (соединение формулы I, в котором R'=R''=H является новым природным соединением, получаемым по существу свободным от примесей других таксицинов и таксинов экстракцией хвои растений рода Taxus, например Taxus baccata L. Его строение было определено спектроскопическим анализом, а именно ядерным магнитным резонансом на ядрах H-1 и C-13 (¹H-ЯМР и ¹³C-ЯМР). Структура 5-0-циннамоил-10-ацетилфототаксицина была определена в действительности как соединение формулы Ia. Новый циклотаксан формулы Ia может быть выделен экстракцией растительных материалов спиртами при комнатной температуре, например метанолом или этанолом, или алифатическими кетонами, например ацетоном, или их смесями с водой. Экстракты после концентрирования в вакууме до удаления органического растворителя отфильтровывают от любого выпавшего в осадок нерастворимого материала и обрабатывают несмешивающимся с водой апротонным растворителем, таким как хлористый метилен, хлороформ или этилацетат. Органический экстракт, содержащий соединение формулы Ia, выпаривают досуха и очищают колоночной хроматографией, используя силикагель в качестве неподвижной фазы и смеси растворителей, таких как н-гексан, этилацетат, хлористый метилен с метанолом или ацетон с толуолом в качестве элюентов. Фракции, содержащие соединение формулы Ia, выпаривают досуха в вакууме и остаток кристаллизуют из этилацетата.

Соединение формулы Ia может быть также получено из природного соединения формулы II, которое может быть также выделено из растений Taxus облучением светом ртутной лампы при длине волны 240 нм в этаноловом растворе.

В этих условиях происходит образование связи между углеродными атомами в положении 3 и 11 и перемещение протона из положения 3 в положение 12.

.

Таким образом изобретение касается также соединения формулы II как промежуточного соединения для синтеза соединения формулы Ia. Соединение формулы II активно также само по себе как противоопухолевое средство, как описано ниже.

Фотохимическую перегруппировку соединения формулы II, имеющего E-конфигурацию на циннамоиловом остатке, осуществляют частичной изомеризацией олефиновой двойной связи. Продукт фотоциклизации в действительности содержит смесь E- и Z-изомеров в соотношении 5:1. Встречающееся в природе соединение формулы Ia имеет однородную стереоизомерию, как и соединение формулы II, имеющее E-конфигурацию.

Реизомеризация части Z-изомера, полученного фотосинтезом, в E-изомер может быть достигнута нагреванием с обратным холодильником смеси от фотоциклизации в тетрагидрофуране в присутствии дифенилсульфида.

Происходит полная конверсия соединения формулы II в соединение формулы Ia.

Реакция фотоциклизации таксицинов была описана K.Nakanishi, J.Chem.Soc. Chem. Com. , 1201, 1967 и она предположительно протекает через бирадикальное промежуточное соединение в положениях 3 и 11, полученное переносом водорода от углерода в 3-положении к углероду в положении 12. Однако метод Nakanishi, основанный на диоксане, как растворителе, дает низкий выход (около 50%) и, будучи применен к таксицинам, содержащим циннамоиловые остатки, приводит к получению стереоизомерных смесей, имеющих высокое содержание Z-изомера.

Мы установили, что можно получать соединение формулы Ia, содержащее по меньшей мере 85% E-изомера, путем проведения фотоциклизации в этанольном растворе и с ртутной лампой низкого давления. Мы также нашли, что можно достигнуть полного преобразования смеси в E-изомер путем нагревания с обратным холодильником в тетрагидрофуране в присутствии дифенилсульфида в количестве 0,1-0,4 моль на 1 моль соединения формулы II.

Стереохимически чистый продукт выделяют после удаления дифенилсульфида хроматографией на силикагеле, элюируя смесями растворителя, такими как смесь толуол-ацетон или смесь н-гексан-этилацетат.

Соединение формулы II экстрагируют из иголок T. baccatia L. методом, аналогичным описанному для соединения IA, например экстракцией растительного материала спиртами при комнатной температуре, затем несмешивающимися с водой растворителями, хроматографией на силикагеле и препаративной жидкостной хроматографией высокого давления.

Производные соединения формулы I, в которых R' и/или R'' представляют собой группы COR''', могут быть получены взаимодействием соединения формулы Ia (соединение формулы I, в котором R'=R''= H) с подходяще активированным производным кислоты R'''COOH, например хлорангидридом, ангидридом или в присутствии конденсирующего средства, такого как дициклогексилкарбодиимид. В первом случае этерификацию проводят предпочтительно в основном растворителе, например пиридине со стехиометрическим количеством ацилирующего реактива. Реакционную смесь разбавляют водой и экстрагируют хлорированным растворителем (например, хлористым метиленом или хлороформом) или эфиром (например, этиловым эфиром). Органическую фазу отделяют, промывают водой и выпаривают досуха в вакууме.

Остаток затем хроматографируют на силикагеле, чтобы получить желаемый сложный эфир. Если используют дициклогексилкарбодиимид, то этерификацию проводят в апротонном растворителе, таком как дихлорметан, хлороформ или диоксан.

После удаления фильтрацией образовавшейся дициклогексилмочевины реакционную смесь выпаривали досуха в вакууме и остаток хроматографировали на силикагеле, используя в качестве элюента смеси растворителей, такие как смесь н-гексан-этилацетат или смесь толуола с ацетоном.

Можно получить избирательное ацилирование, поскольку оксигруппы в положениях 2 и 9 соединения формулы Ia имеют различную реакционную способность.

В частности, оксигруппа в положении 9 может быть ацилирована в мягких условиях в интервале температур от -50^oC до комнатной температуры. Для ацилирования оксигруппы в положении 2 необходимо использовать более жесткие условия, например нагревание смеси до 30-80^oC, используя подходящие катализаторы, такие как 4-диметиламинопиридин, или более продолжительное время реакции.

Например, соединение формулы Ib (соединение формулы I, в котором R'=R''= COCH₃) получают взаимодействием соединения формулы Ia (R'=R''=H) с уксусным ангидридом в растворе сухого пиридина.

После выдерживания при комнатной температуре в течение всей ночи реакционную смесь разбавляли водой и экстрагировали хлороформом. Органическую фазу промывали водным раствором бикарбоната натрия, затем водой и выпаривали досуха. Остаток после колоночной хроматографии на силикагеле и элюирования смесью этилацетат-гексан в соотношении 7:3 давал соединение формулы Ib.

Соединения формул I и II обладают антимитотической активностью, сравнимой с активностью известных таксанов, таких как таксол или его производные, и противоопухолевой активностью in vivo.

In vitro они проявляют активность по отношению к мозговому табулини (Shelanski, Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 70, 765, 1973) к культуре лейкоцитов человека. Соединения согласно изобретению проявляют воздействие на табулин мозга вдвое выше, чем соответствующие производные баккатина III.

Эффект подавления опухолевых клеточных линий 5-0- циннамоил-10-ацетилциклотаксаном (пример 1) и 5-0-циннамоил- 10-ацетилтаксацина 1 (пример 2) приведен в таблице.

Соединения могут быть введены перорально или парентерально, одни или в сочетании с другими терапевтическими средствами, включая ангинеопластические средства, стероиды и так далее, млекопитающим при необходимости такого лечения. Парентеральные пути введения включают внутримышечный, внутриоболочечный, внутривенный и внутриартериальный. Что касается любого лекарства этого типа, то их дозирование должно назначаться с учетом конкретной опухоли, состояния больного и наблюдаемой реакции, но обычно доза будет составлять от 10 до 30 мг/м² в день в течение 5 дней или 150-250 мг/м² вводимых однократно каждые три недели. Имея низкую токсичность в сравнении с используемыми в настоящее время другими средствами, часто можно избежать токсической реакции либо снижением дневной дозы, либо введением соединения в альтернативные дни, например через каждые три-пять дней или более длительными интервалами введения. Пероральные дозированные формы включают таблетки и капсулы, содержащие от 1 до 10 мг лекарства на дозированную единицу. Изотонические солевые растворы, содержащие 20-100 мг/мл, могут быть использованы для парентерального введения.

Следующие ниже примеры поясняют основные аспекты изобретения.

Пример 1. Выделение 5-0-циннамоил-10-ацетилциклотаксана формулы Ia (соединение формулы I, в котором R'=R''=H) из листьев Taxus baccata.

500 кг листвы Taxus baccata экстрагировали 10 частями этанола по 1500 л каждая при комнатной температуре. Собранные экстракты концентрировали до получения объема 900 л и выдерживали при комнатной температуре 24 ч. Нерастворимый материал отделяли центрифугированием и раствор экстрагировали пятью порциями хлористого метилена по 300 л каждая. Органические фазы собирали и растворитель отгоняли при пониженном давлении. Полученный остаток (3,5 кг) растворяли в смеси, содержащей хлороформ и метанол в соотношении 98:2, и пропускали через хроматографическую колонку с 70 кг силикагеля, используя ту же смесь растворителей в качестве элюента.

Фракции, содержащие чистое соединение формулы Ia, собирали, элюент отгоняли при пониженном давлении и остаток кристаллизовали из этилацетата. Соединение Ia получали в форме микрокристаллического белого порошка, точка плавления 126^oC. [α]20D

= + 7,5^oC (CH₂Cl₂, c=0,77); УФ-спектр λ_макс (этанол): 279, 217, 201 нанометр. ИК-спектр λ_макс (KBr): 3475, 1700, 1630, 1450, 1370, 1245, 1040, 990, 900, 770, 710 см^-1.

Масс-спектр (аммиак): 556 (C₃₁H₃₈O₈ + NH₄)⁺.

¹H-ЯМР : Н2 д 4,76; Н5 м (уш) 5,57; Н β м 2,16; H6 α м 1,70; Н7а м 1,90; Н7b м 1,30; Н9 д 4,38; Н10 д 5,40; Н12 кв 3,48; Н14 α д 3,03; Н14 β д 2,35; Н16 с 1,10; Н17 с 1,38; Н18 д 1,29; Н19 с 1,38; Н20а с (уш) 5,84; Н20b с (уш) 5,59; Н2', 6' м 7,55; Н3', 4', 5' м 7,38; Н7' д 7,66; Н8' д 6,39; OAc с 2,15
Пример 2. Выделение 5-0-циннамоил-10-ацетилтаксицина 1 (соединение формулы II).

500 кг высушенных иголок и небольших веток с листьями T.baccatia экстрагировали этанолом при комнатной температуре. Остаток суспендировали в воде и экстрагировали гексаном и затем хлороформом. После выпаривания хлороформной фазы остаток (3,5 кг) подвергали колоночной хроматографии на силикагеле, используя хлористый метилен, содержащий возрастающие количества метанола в качестве элюента. Фракции смеси дихлорметана-метанола в соотношении 98:2 давали 12 г желтоватого порошка, который после жидкостной хроматографии высокого давления (смесь гексан-этилацетат в соотношении 1:1) давал 1,5 г соединения формулы II в форме порошка, точка плавления 145^oC, [α]15D

=+185 (хлороформ, c= 0,61); УФ-спектр λ_макс, этанол, нанометры: 280, 223, 217; ИК-спектр, λ_макс, бромистый калий, см^-1: 3450, 1720, 1670, 1645, 1320, 1230, 1010, 990; масс-спектр (аммиак) 140 эВ, m/z (отн.внутр. эталона): 556.

¹H-ЯМР : Н2 дд (7,1-7,0) 4,03; Н3 д (7,1) 3,40; Н5 т (2,8) 5,33; Н9 дд (9,6-3,7) 4,30; Н10 д (9,6) 5,87; Н14а д (19,4) 2,70; Н14b д (19,4) 2,64; Н16 с 1,52; Н17 с 1,26; Н18 с 2,26; Н19 с 1,19; Н20 с (уш) 5,47; Н20b т (1,2) 5,37; С-1 OH с 3,65; С-2 OH д (7,0) 2,42; С-9 OH д (3,7) 2,36; OAc с 2,16.

Пример 3. Получение 5-0-циннамоил-10-ацетилциклотаксана, соединение формулы Ia (соединение I, R'=R''=H) фотоциклизацией.

1,05 г 5-0-циннамоил-10-ацетилтаксицина I (соединение формулы II) растворяли в 500 мл этанола. Раствор помещали в кварцевую трубку и воздух полностью удаляли барботированием азотом. Трубку помещали в фотохимический реактор и раствор облучали при 240 нм 5 ч. Затем реакционную смесь отгоняли в вакууме досуха и остаток растворяли в 200 мл тетрагидрофурана. Добавляли 100 мг дифенилсульфида и смесь нагревали с обратным холодильником 5 ч.

Затем реакционную смесь отгоняли досуха и остаток очищали колоночной хроматографией на 250 г силикагеля, используя смесь н-гексан-этилацетат в соотношении 9: 1 в качестве элюента. Хроматографирование продолжали до полного удаления дисульфида. Последующее элюирование смесью н-гексан- этилацетат в соотношении 1:1 давало 1,0 г соединения Ia, которое кристаллизовали из этилацетата. Полученный продукт имел те же физико-химические характеристики, что и соединение, полученное по примеру 1.

Пример 4. Получение 5-0-циннамоил-2,9,10-триацетилциклотаксана формулы Ib (соединение I, R'=H, R''=COCH₃).

200 мг соединения Ia растворяли в 2 мл безводного пиридина и обрабатывали 2 мл уксусного ангидрида. Реакционную смесь выдерживали 12 ч при комнатной температуре, затем разбавляли 15 мл воды и экстрагировали двумя частями хлористого метилена по 5 мл каждая. Собранные органические фазы промывали насыщенным водным раствором бикарбоната натрия, затем водой и в завершение выпаривали досуха. Остаток подвергали колоночной хроматографии через 15 г силикагеля, используя смесь н-гексан-этилацетат в соотношении 3:7 в качестве элюента. Элюаты, содержащие соединение формулы Ib, отгоняли в вакууме досуха и получали 170 мг белого продукта, точка плавления 90^oC, масс-спектр (аммиак), m/z : 598 (C₃₁H₃₈O₈ + NH₄)⁺.

Примеры фармкомпозиций.

Пример А: раствор соединения Ia (пример 1) для парентерального введения
Соединение Ia (пример 1) - 2 мг
Кремофор EL - 17,5 мг
Спирт абсолют - До 0,4 мл
Пример В: таблетки, содержащие соединение Ia (пример 1)
Соединение Ia (пример 1) - 10 мг
Поперечно-сшитая Na-карбоксиметилцеллюлоза - 15 мг
Лактоза (сушка распылением) - 41,5 мг
Микрокристаллическая целлюлоза - 40 мг
Коллоидный SiO₂ - 0,5 мг
Стеарат магния - 1 мг
Пример С. Раствор для парентерального введения.

Соединение II (пример 2) - 3 мг
Кремофор EL - 250 мг
Спирт абсолют - q.s. до 0,5 мл
Пример Д Таблетки.

Соединение II (пример 2) - 20 мг
Поперечно-сшитая карбоксиметилцеллюлоза - 10 мг
Лактоза (высушенная распылением) - 48 мг
Микрокристаллическая целлюлоза - 30 мг
Двуокись кремния - 1 мг
Стеарат магния - 1 мги

Получение новых 3, 11-циклотаксанов, имеющих общую формулу I. Циклотаксан формулы Ia может быть выделен из растений рода Taxus (соединение формулы I, в котором R'=R''=H). Новые циклотаксаны формулы I обладают противоопухолевой активностью. 3 с. и 6 з.п. ф-лы, 1 табл.

1. Производные таксана общей формулы I

где R' и R'' каждый независимо - водород или алканоил с 2 - 7 атомами углерода,
проявляющее антимитотическую и противоопухолевую активность. 2. Соединение по п.1, формулы I, отличающееся тем что R' и R'' - водород. 3. Соединение по п.1, формулы, I, отличающееся тем, что R' - водород, а R'' - COCH₃. 4. Производные таксана формулы II,

проявляющее антимитотическую и противоопухолевую активность. 5. Способ получения соединения по п.2, отличающийся тем, что надземные части растений рода Taxus подвергают экстракции спиртом, или кетоном, или их смесями с водой при комнатной температуре с последующим концентрированием экстракта и обработкой его несмешивающимся с водой апротонным растворителем после отделения нерастворимого осадка с последующей очисткой органического экстракта с помощью хроматографии на силикагеле. 6. Способ получения соединений по пп.1 - 3, отличающийся тем, что этанольный раствор производного таксана по п.4 формулы II подвергают облучению ртутной лампой при 240 нм с последующей обработкой реакционной смеси тетрагидрофураном в присутствии дифенилсульфида при температуре кипения, после чего полученную реакционную смесь отгоняют досуха и остаток подвергают хроматографии на силикагеле, при этом при необходимости проводят ацилирование полученного соединения с помощью кислоты формулы
R²COOH,
где R² - низший алкил,
или ее активных производных. 7. Фармацевтическая композиция, обладающая антимитотической и противоопухолевой активностью, содержащая активный компонент и фармацевтически приемлемые добавки, отличающаяся тем, что в качестве активного компонента она содержит соединение формулы I по п.1 в эффективном количестве. 8. Фармацевтическая композиция, обладающая антимитотической и противоопухолевой активностью, содержащая активный ингредиент и фармацевтически приемлемые добавки, отличающаяся тем, что в качестве активного ингредиента она содержит соединение формулы I по п.4 в эффективном количестве.