СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОСТОЯНИЙ ШОКА И КОНТРОЛЯ ЗА ХОДОМ ЛЕЧЕНИЯ ПАЦИЕНТОВ В СОСТОЯНИИ ШОКА Российский патент 2001 года по МПК G01N33/68 A61K38/13 

Изобретение относится к методам диагноза состояний шока, более конкретно к способу определения состояний шока и контроля за ходом лечения пациентов в состоянии шока.

Каждый год в западных индустриальных странах тысячи людей умирают от разных видов шока или от его непосредственных последствий. Под шоком понимают остро появляющееся, отличающееся падением кровяного давления нарушение регуляции кровоснабжения жизненно важных органов. Вследствие этого остро появляющегося нарушения регуляции часто встречаются диффузные или селективные поражения органов, а также протрагированная недостаточность органов, которая в около 10 до 30% случаев приводит к смерти (см., например, W. Pschyrembel, Klin. Wurterbuch, из-во de Gruyter Berlin, 1992 г.). Такие шоковые явления могут встречаться на фоне острых и хронических инфекций, у предварительно поврежденных пациентов в послеоперационном периоде, при лечении цитостатическими препаратами и. т.д., а также без заметной причины, часто вследствие в остальном безвредных бактериальных инфекций. Различают анафилактические, бактериальные, септические, посттравматические, кардиогенные, геморрагические, гиповолемические, неврогенные и токсические виды шока. Общим признаком всех видов шока является измененная иммунная реакция организма на часто безвредные микробы на фоне одновременного или предварительного травматического, хирургического, иммуно- логического, лекарственного или токсического повреждений организма (см., например, Bochner, В. S. и др., в журнале "N. Engl. J. Med" 1991 г., N 3241, стр. 1785). Единого и надежного способа лечения, в частности посттравматического, послеоперационного, токсического или септического шоков пока не существует (Barren, R. L, "Clin Pharm", N 12, 1993 г., стр. 829). Отсутствуют надежные критерии оценки прогноза и результата лечения шока. Поэтому специфические, признанные и разумно обоснованные методы лечения не были до сих пор разработаны, наверно из-за отсутствия прогностических параметров.

Задачей изобретения является разработка надежного способа определения состояний шока и контроля за ходом лечения пациентов в состоянии шока.

Поставленная задача решается предлагаемым способом определения состояний шока и контроля за ходом пациентов в состоянии шока, заключающимся в том, что определяют концентрацию циклофилинов в крови пациентов:
а) энзимологическими методами,
б) иммунологическими методами с помощью специфических антител,
в) пептидхимическими методами,
г) радиохимическими методами,
и по ней оценивают степень тяжести шока, а именно, концентрацию циклофилина свыше 20 ед/мл оценивают как неблагоприятный показатель, а при концентрации свыше 50 ед/мл прогнозируют смертельный исход.

В качестве энзимологического метода используют определение активности ротамаз, в качестве иммунологического метода - радиоиммунные анализы, твердофазный иммуноферментный анализ, в качестве пептидхимического метода - аффинную хроматографию, в качестве радиологического метода - связывание радиоактивного циклоспорина при физико-химических условиях.

При анализе крови пациентов, страдающих шоковым состоянием, неожиданно установлено, что в сыворотке крови некоторых из них вскоре после начала или в дальнейшем протекании шока обнаруживают циклофилины в значительном количестве. Большинство пациентов, в сыворотке которых в любое время (за первые 15 суток) шока обнаруживают циклофилины в четко измеримом количестве, умирает, несмотря на интенсивные терапевтические усилия врачей. В бесклеточных частях крови (сыворотке, плазме, фракциях плазмы и т.д.) пациентов, которые выживают, до излечения не обнаруживают циклофилинов в измеримом количестве.

По сегодняшнему уровню знаний, все клетки человеческого организма и организма животных, но и многие бактерии, клетки растений и т. д., содержат особую группу цитоплазматических белков, так называемые циклофилины (см. Galat, A. , "Eur. J. Biochem", N 216, 1993 г., стр. 689). Они регулируют складчатость, стабильность, высвобождение, а также образование белков в связи с регуляцией функции клеток в нормальном состоянии или в состоянии стресса, как, например, в случае инфекции, отторжения трансплантата и т.д. (см. Galat, A. , "Eur. J. Biochem", N 216, 1993 г., стр. 689). Циклофилины обнаруживают и в цитоплазме и в ядре эукариотов (Galat, см. выше). Но обычно они не имеются во внеклеточной среде и они не проявляют существенных внеклеточных эффектов.

В отличие от известных наблюдений, в связи с шоком впервые установлено, что в крови пациентов, у которых состояние шока приводит к смерти, уже задолго до смерти (сутки или недели) обнаруживают циклофилины в значительных количествах. Хотя были найдены разные медиаторы, например, в связи с септическим шоком, циклофилины не увязывали с шоковыми явлениями.

Таким образом, обнаружение циклофилинов в плазме крови и в сыворотке пациентов в состоянии шока является патогнономично неблагоприятным показателем. Путем наблюдения за этим параметром в сыворотке крови можно прогнозировать и контролировать лечение. Снижение концентрации циклофилина указывает на возможный положительный результат лечения, а увеличение - на предстоящий смертельный исход. К тому же, при экспериментально вызванных состояниях шока концентрация циклофилинов может служить показателем действия новых форм лечения.

Из вышесказанного вытекает, что циклофилины в качестве медиаторов имеют отрицательное влияние на шоковые явления.

Циклофилины похожи на цитокины (см. Bang и др. Experientia, N 49, 1993 г. , стр. 533), которые вносят существенный вклад в систему иммунной защиты человеческого организма и организма животных. Поэтому их неожиданное появление вне клеток может приводить к огромному нарушению или изменению регуляции системы иммунной защиты человеческого организма и таким образом к косвенным последствиям состояний шока. Для лечения шока, следовательно, циклофилины необходимо инактивировать, антагонизировать или удалять. Для этого имеются в принципе следующие возможности:
а) Ингибирование или антагонизирование имеющихся в плазме крови циклофилинов ингибирующими и антагонизирующими фармацевтическими веществами.

б) Ингибирование и антагонизирование циклофилинов биологически активными началами, такими как специфические антитела, антиэнзимы и т. д.

в) Удаление и уничтожение находящихся в плазме крови и в сыворотке циклофилинов физическими и химическими методами, такими как гемодиализ и т.д.

Вышеуказанные методы обнаружения циклофилинов частично известны и применяются для обнаружения циклофилинов в клетках; их можно обнаруживать и другими методами, применяемыми для других показаний. Например, измерение концентрации циклофилина, которое проводится путем измерения активности ротамазы (пептидил-пролин- цис-транс-изомеразы) (см. Н. Bang, диссертацию, г. Халле, 1986 г. Wissenschaftsbereich Biochemie; Gatat (см. выше), и Fischer, G. и др., Biomed. Biochim. Acta, N 43, 1984 г., стр. 1101).

Определение активности изомеразы в жидкостях тела:
- система анализа основана на принципе связанной спектроскопической ферментной пробы, т. е. реакция вспомогательного энзима (химотрипсина) используется для обнаружения изомераз;
- посредством протеазы (химотрипсина) проводят специфичную в отношении конформации конверсию хромофорного пептида (субстрата) и наблюдают за ней спектроскопией;
- в ходе первой, очень быстрой реакции протеаза селективно расщепляет транс-конформацию;
- во второй, медленной фазе цис-конформация каталитически превращается в транс-форму, которая может быть расщеплена протеазой.

Такие изомеразы как циклофилины селективно ускоряют такое цис-транс-преобразование.

Таким образом, в бесклеточных жидкостях тела изомеразы можно анализировать вышеуказанной спектроскопией.

Предел обнаружения: нмоль изомеразы.

Соответственно, с помощью специфических антител против циклофилинов можно известным образом разработать иммунологические, радиохимические и другие способы обнаружения циклофилинов.

Для лечения принципиально возможно ингибирование циклофилина, например, циклоспорином A. Этот способ уже применяется в трансплантологии, при лечении ревматизма, астмы и псориаза. Его ингибирующее действие на циклофилины можно доказывать ин витро.

Дачей циклоспорина A (далее CsA) подопытным животным (мышам) можно остановить летальное состояние шока, вызванное инъекцией бактериального липополисахарида (далее LPS) или фактора а некроза опухоли (далее TNFa). При этом, степень недостаточности печени определяют количеством типичных для печени энзимов, таких как гуанозин-5'-трифосфат (далее ALT(GPT)), глютамат-оксалацетат-трансаминаза (далее AST (GOT)) и сорбитдегидрогеназа (далее SDH). Результаты сведены в таблице. Результаты получены через 8 часов после лечения. Вводили по 50 мг/кг CsA внутривенно за 15 ч и 1 ч до лечения.

Результаты клинических исследований
На чертеже изображена концентрация циклофилинов в сыворотке 6 пациентов, страдающих от шока. Установлено, что при определении наличия циклофилинов с помощью фермента пептидил-пролин-цис- транс-изомеразы (далее, энзиматический тест) имеются повышающиеся или повышенные количества циклофилинов в плазме только у тех пациентов, которые умирали. Неожиданно установлено, что эти внутриклеточные белки обнаруживаются в значительном количестве уже за одну неделю до смерти. Незадолго до смертельного исхода их количество значительно повышается. В отличие от этого, в сыворотке всех троих пациентов, которые пережили шок, не наблюдается измеримого повышения концентрации циклофилина.

Поэтому предполагается, что концентрации циклофилина свыше 50 ед./мл указывают на смертельный исход, а концентрации свыше 20 ед./мл представляют собой предупредительный сигнал.

Методика определения количества циклофилина:
В отношении структуры молекулы применяемых субстратов и протеолитической чувствительности пептидил-пролин-цис-транс-изомеразы, вышеупомянутый энзиматический тест является методом, с помощью которого можно определить активность пептидил-пролин-цис- транс-изомеразы даже в недостаточно подготовленных биологических пробах. Человеческий рекомбинантный циклофилин можно обнаруживать при концентрации - около 0,5 нг циклофилина на 1 мл сыворотки. Около 1 нмоль циклофилина соответствует примерно концентрации в 1 ед./мл. Из вышесказанного следует, что повышение на 5 ед./мл представляет собой значительное увеличение концентрации циклофилина и четко отлично от значения 0 ед./мл.

Кроме этого, в сыворотке пациентов, страдающих от сепсиса, обнаруживают не только измеримое количество циклофилинов (что на чертеже соответствует положительным значениям), но и модуляторов циклофилинов. В случае отрицательного значения (-40 ед./мл) речь идет о ингибиторах. Эти значения получены путем исследования влияния септической крови на циклофилины, добавленные в пробирке к пептидил-пролин-цис-транс-изомеразе.

Пример определения активности изомеразы:
применение бесклеточной сыворотки;
употребление спектрофотометра типа UV/VIS с термостатированным держателем кюветы (нагревание до 10^oC);
1 мл буфера Hepes смешивают с 1-20 мкл сыворотки и предварительно инкубируют в течение 30 секунд, затем добавляют 200 мкл раствора химотрипсина и реакцию начинают сразу же путем добавления 5 мкл раствора субстрата;
- за ходом реакции непрерывно наблюдают при длине волны в 390 им в течение 3 мин;
- константу скорости наблюдавшейся реакции 1-го порядка устанавливают посредством программы оценки, она соответствует приведенным на чертеже значениям в ед./мл;
- для измерения и оценки требуется около 10 минут для данного способа.

Изобретение относится к области медицины и направлено на диагностику состояний шока и контроля за ходом лечения пациентов в состоянии шока. Способ заключается в том, что определяют концентрацию циклофилинов в крови пациентов а) энзимологическими методами, б) иммунологическими методами с помощью специфических антител, в) пептидхимическими методами, г) радиохимическими методами. Оценивают степень тяжести шока при концентрации циклофилина свыше 29 ед/мл как неблагоприятный показатель. При концентрации свыше 50 ед/мл прогнозируют смертельный исход состояния шока. Способ надежен. 1 з.п. ф-лы, 1 табл., 1 ил.

1. Способ определения состояний шока и контроля за ходом лечения пациентов в состоянии шока, отличающийся тем, что определяют концентрацию циклофилинов в крови пациентов а) энзимологическими методами, б) иммунологическими методами с помощью специфических антител, в) пептидхимическими методами, г) радиохимическими методами и по ней оценивают степень тяжести шока, а именно концентрацию циклофилина свыше 20 ед/мл оценивают как неблагоприятный показатель, а при концентрации свыше 50 ед/мл прогнозируют смертельный исход. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что а) в качестве энзимологического метода используют определение активности ротамаз, или б) в качестве иммунологического метода используют радиоиммунные анализы, твердофазный иммуноферментный анализ, или в) в качестве пептидхимического метода используют аффинную хроматографию, или г) в качестве радиохимического метода используют связывание радиоактивного циклоспорина при физикохимических условиях.