СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОДИСПЕРСНОГО СИНТЕТИЧЕСКОГО ПОЛИМЕРНОГО ЛАТЕКСА С КАРБОКСИЛИРОВАННОЙ ПОВЕРХНОСТЬЮ ЧАСТИЦ Российский патент 2001 года по МПК C08F2/22 C08F112/08 C08F118/08 C08F120/10 

Изобретение относится к химии высокомолекулярных соединений, точнее, к способу получения монодисперсных синтетических полимерных латексов с заданным диаметром частиц.

Получаемые в результате реализации заявляемого изобретения латексы могут быть использованы в коллоидной химии, биохимии, биотехнологии и медицине. Так, они могут выступать в качестве носителей иммунореагентов в иммуноанализе и модельных коллоидов, калибровочных эталонов в дисперсионном анализе.

Латексы, используемые в иммуноанализе, должны отвечать ряду требований:
1. Оптимальный диаметр латексных частиц (микросфер) - 0,5 - 2,0 мкм, поскольку частицы с такими размерами образуют в иммунохимической реакции крупные агглютинаты, что облегчает учет реакции, который в большинстве случаев производится визуально [Чайка Н.А. // Иммунологическая диагностика вирусных инфекций. - М.: Медицина. 1985. С. 121].

2. Монодисперсность микросфер (однородность по заданному размеру).

3. Наличие поверхностных функциональных групп (ионогенных и неионогенных) [Прокопов Н.И., Грицкова И.А., Черкасов В.Р., Чалых А.Е. // Успехи химии. 1996. Т. 65. С. 178.].

4. Частицы должны иметь высокую емкость к присоединяемым иммунореагентам при отсутствии "рыхлого" поверхностного слоя полимера, поглощающего и экранирующего присоединяемые вещества при проведении иммунохимической реакции [Kondo A. // J. Immunol. Methods. 1990. V. 135. P. 111].

Безэмульгаторная эмульсионная полимеризация в настоящее время является основным методом синтеза монодисперсных латексов [Елисеева В.И. Полимерные дисперсии. - М: Химия. 1980. С. 126].

Известен способ получения монодисперсного синтетического сополимерного латекса с карбоксилированной поверхностью путем безэмульгаторной эмульсионной сополимеризации неполярного мономера - стирола и полярного мономера - метакриловой кислоты в присутствии инициатора [Елисеева В.И., Асалмазова Т. Р. // Успехи химии. 1991. Т. 60. N 2. С. 308].

Латекс, полученный известным способом, используется в качестве носителя иммунореагентов, так как позволяет производить как адсорбционную иммобилизацию белков на поверхности частиц, так и их химическое связывание с карбоксигруппами. Однако при получении латекса в результате статистического распределения звеньев метакриловой кислоты по цепи сополимера происходит обогащение поверхностного слоя частиц этими гидрофильными звеньями и образуется "рыхлый" поверхностный слой [Muroi S., Hosoi К., Ishikawa Т. // J. Appl. Polym. Sci. 1967. V. 11. P. 1963; Vizayendran B.R. // J. Appl. Polym. Sci. 1979. V. 23. P. 893]. Структура такого поверхностного слоя зависит от многих условий синтеза частиц и их последующей обработки [Okubo М., Kanaida К. , Matsumoto T. // J. Appl. Polym. Sci. 1987. V. 33. N 5. P. 1511], что приводит, во-первых, к плохой воспроизводимости параметров латекса (диаметр, монодисперсность, однородность поверхности, заряд частиц), а во-вторых, к экранированию гидрофилизованными участками полимерных цепей иммунореагентов в поверхностном слое частиц, что снижает эффективность иммунохимических реакций [Kondo A. // J. Immunol. Methods. 1990. V. 135. P. 111].

Известен способ получения монодисперсного синтетического гомополимерного латекса с карбоксилированной поверхностью путем безэмульгаторной эмульсионной полимеризации стирола, инициированной персульфатами [Kamel A.A. // J. Dispers. Sci. Technol. 1981. V. 2. P. 183].

Поверхность полученного латекса полифункциональна: наряду с сульфоэфирными группами в результате их частичного гидролиза присутствуют карбокси- и гидроксигруппы, количество и расположение которых трудно контролировать. Для того чтобы избежать этого недостатка и, тем самым, улучшить качество и воспроизводимость свойств полученного латекса, сульфоэфирные группы гидролизуют кипячением латекса с последующим окислением гидроксигрупп. Однако эта операция не обеспечивает полного перевода гидроксигрупп в карбоксильные, а многоступенчатая обработка ведет к существенной потере конечного продукта.

Известен способ (прототип) получения монодисперсного синтетического полимерного латекса с карбоксилированной поверхностью путем безэмульгаторной эмульсионной полимеризации стирола в щелочной среде (pH 7,2 - 11,6) при массовом соотношении фаз стирол : вода = 1:(5-10) в присутствии карбоксилсодержащего азоинициатора - 4,4'-азобис-(4-цианвалериановой кислоты) (ЦБК) с концентрацией 0,010-0,007 М в расчете на водную фазу при 80±1^oC. В этом способе карбоксилирование поверхности частиц происходит за счет инициатора [Лишанский И. С. , Меньшикова А.Ю., Евсеева Т.Г., и др. Высокомолек. соед., 1991, А 32, С. 413]. Диаметр латексов составляет 0,25-0,45 мкм (при min относительной дисперсии 4,7% - диаметр 0,36 мкм), что недостаточно для получения качественного иммунодиагностикума (см. выше - требования к латексам для иммуноанализа), поэтому в прототипе нет указаний на проведение испытаний известных латексов в качестве носителей для иммунореагентов.

При попытках получения известным способом латексов с диаметром частиц, большим 0,45 мкм, латексы теряют монодисперсность (относительная дисперсия превышает 20%).

Анализ вышеприведенных аналогов позволяет утверждать, что проблема создания латексов с карбоксилированной поверхностью частиц - носителей для иммунореагентов в настоящее время остается актуальной.

Задачей заявленного изобретения является создание синтетического полимерного латекса, отвечающего требованиям, предъявляемым к носителям иммунореагентов.

Эта задача решается заявленным способом получения монодисперсного синтетического полимерного латекса с карбоксилированной поверхностью частиц.

Заявляемое изобретение обладает совокупностью следующих существенных признаков:
1. Проводят безэмульгаторную эмульсионную полимеризацию винильного мономера.

1.1. В качестве винильного мономера используют одно или смесь соединений из ряда: стирол, винилацетат, (мет)акрилаты.

1.2. Процесс проводят при массовом соотношении фаз мономер : вода=1: (5-25).

1.3. Процесс проводят в щелочной среде (pH исходной смеси 7-14).

1.4. Полимеризацию проводят в присутствии карбоксилсодержащего инициатора с концентрацией в расчете на водную фазу 0,001-0,020 М.

1.5. Полимеризацию проводят при нагревании (75-95^oC) в атмосфере инертного газа.

1.6. В исходную реакционную смесь дополнительно вводят соль со способностью создавать буферные растворы в области щелочных значений pH или смесь таких солей при концентрации соли в расчете на водную фазу 0,005-0,150 М.

Указанная совокупность существенных признаков заявляемого способа обеспечивает получение технического результата - получения монодисперсного полимерного латекса с оптимальными для носителя иммунореагентов свойствами за счет увеличения диаметра частиц до 0,5-2,5 мкм с более узким распределением по размерам частиц по сравнению со способом-прототипом и достижения карбоксилированной поверхности с более широким интервалом заданной и контролируемой поверхностной концентрации карбоксильных групп (1 - 6 мг-экв/м²) и более высокой верхней границей этого интервала, чем у латексов, полученных по способу-прототипу (2,0-2,6 мг-экв/м²).

Дополнительный технический результат: заявляемый способ может быть распространен на случай получения латекса с полифункциональной поверхностью (например, сочетание -карбокси- и эпокси-групп - см. пример N 4).

Отличительными признаками заявляемого способа от способа-прототипа являются признаки 1.1, 1.6, т.е. ряд используемых мономеров и их сочетание, а также введение в исходную реакционную смесь дополнительного ингредиента - соли со способностью создавать буферные растворы в области щелочных значений pH или смесь таких солей при концентрации соли в расчете на водную фазу 0,005-0,150 М.

Анализ известного уровня техники не позволил обнаружить решение, полностью совпадающее по совокупности существенных признаков с заявляемым способом. Это подтверждает новизну предложения.

Только совокупность существенных признаков заявляемого способа позволяет достичь указанного выше эффекта. Из известности отдельных признаков изобретения не вытекает с очевидностью возможность получения латекса с оптимальными для носителя иммунореагентов свойствами. Так, до сих пор не удавалось достичь оптимума, несмотря на попытки варьирования известных условий получения латекса: концентрационных, pH-среды, т.к. изменение одного параметра приводит к улучшению, например, выхода латекса, но нарушению монодисперсности [Лишанский И.С. и др., Высокомолек. соед., 1991, А 32, С. 413]. Известный факт, что введение в реакционную систему солей сильных электролитов приводит к повышению размера частиц, формирующихся в процессе безэмульгаторной полимеризации [Goodwin J. W., Colloid. Polym. Sci., 1974, V. 252, P. 464], в заявляемом случае себя не оправдал. Авторами заявляемого изобретения были проведены специальные опыты с использованием NaCl в качестве добавки в исходную реакционную смесь (по вышеупомянутой методике Goodwin J. W.). Действительно, удавалось получать латексы со средним диаметром частиц латекса около 0,5 мкм, однако при этом уширялось распределение частиц латекса по размерам, то есть они теряли свойство монодисперсности, и в целом эффект заявляемого изобретения не был достигнут. Использованные в заявляемом изобретении соли обладают известными для них буферными свойствами, и первоначально предполагалось, что их дополнительное введение в реакционную смесь будет способствовать возможности контролировать смещение кислотно-основного равновесия в процессе синтеза. Действительно, авторами заявляемого изобретения обнаружено положительное влияние этих солей на сохранение щелочного значения pH в течение реакции, особенно в случае заданного начального pH 7-8. Однако совершенно неожиданным и заранее непредсказуемым оказался тот факт, что введение этих солей, причем только в заявляемых интервальных значениях концентрации, приводит к получению латексов с выдающимися характеристиками по размеру (диаметр частиц до 2,5 мкм), качеству поверхности (поверхностная концентрация карбоксигрупп при отсутствии "рыхлого" поверхностного слоя достигает 6 мг-экв/м²), монодисперсности. Достигнутый эффект нельзя объяснить только буферными свойствами этих солей. Таким образом, в заявляемом способе реализована новая функциональная зависимость "состав - свойство". Это позволяет утверждать о соответствии предлагаемого изобретения условию охраноспособности "изобретательский уровень" ("неочевидность").

Для подтверждения соответствия решения условию охраноспособности "промышленная применимость" и для лучшего понимания сущности изобретения приводим примеры конкретного выполнения.

Материалы:
Технические инициаторы очищали двукратной перекристаллизацией из этилового спирта, сушили в вакууме.

Очистка мономеров осуществлялась стандартной вакуумной перегонкой. [Goodwin J.W. Brit. Polymer J., 1973, V. 5, N 2, p. 347].

Соли применяли отечественного производства марок "х.ч." и "ч.д.а.".

Диаметры частиц латексов измеряли с помощью электронной микроскопии (Электронный микроскоп JEM 100 S фирмы "JEON" Япония), коэффициент полидисперсности латексов и относительную дисперсию диаметров частиц рассчитывали, исходя из диаметров 300- 500 частиц каждого образца латекса по методике [Фокс Н.А., Сутягин А.Г. // Успехи химии. 1965, Т. 34, N 2, С. 276].

Поверхностную концентрацию карбоксильных групп латексов определяли после их трехкратной отмывки от водорастворимых примесей последовательным центрифугированием и редиспергированием кондуктометрическим титрованием по методике [Labib М.Е., Robertson A.A. // J. Colloid Polym. Sci. 1980. V. 15. P. 2193].

Суспензии бактериальных клеток Neisseria meningitidis А получены из коллекции Государственного научного центра прикладной микробиологии.

1-Этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид - "Sigma", США.

Бычий сывороточный альбумин -"Sigma", США.

Поликлональные антитела: для их получения использовали сыворотку животных (кролики), иммунизированных суспензиями бактериальных клеток Neisseria meningitidis A, с титрами в реакции диффузионной преципитации по Оухтерлони не ниже 1:8 [Фримель X., Брок Й. // Основы иммунологии. - М.: Мир. 1986. С. 100]. Выделение проводили на белок A - сефарозе. Анализ проводили в аналитическом электрофорезе на полиакриламидном геле [Новые методы анализа аминокислот, пептидов и белков. - М.: Мир. 1974. С. 277]. Определение концентрации антител проводили спектрофотометрически, определяя оптическую плотность раствора антител на длине волны 280 нм (A₂₈₀). Расчет концентрации проводили по формуле: К (мг/мл)= A₂₈₀ · 0,77.

Пример N 1
В трехгорлую колбу с мешалкой, обратным холодильником и термометром в атмосфере азота при перемешивании вводили 100 мл воды (бидистиллят), 0,2 г ЦВК (концентрация 0,00714 М в расчете на водную фазу) 2,2 мл раствора NaOH концентрации 1,55 М, 1,43 г Na₂HPO₄ (концентрация 0,040 М в расчете на водную фазу), и 7,7 мл свежеперегнанного стирола (массовое соотношение стирол/вода = 1 : 14), pH = 11,3, полимеризацию проводили при 80^oC в течение 12 часов. Отгоняли остаточный мономер с водяным паром. Конверсия мономера составила 98%. Размер частиц латекса 0,82 мкм, коэффициент дисперсности 1,008, относительная дисперсия 5,12%. Поверхностная концентрация карбоксильных групп латекса - 2,6 мг-экв/м².

Пример N 2
Проведен в условиях примера N 1 при массовом соотношении стирол/вода = 1 : 5, концентрации ЦВК 0,010 М, Na₂B₄O₇ 0,005 М, добавлен раствор NaOH концентрации 1,55 моль/л до pH 10,7. Размер частиц латекса 1,06 мкм, коэффициент дисперсности 1,015, относительная дисперсия 7,2%. Поверхностная концентрация карбоксильных групп латекса - 3,1 мг-экв/м².

Пример N 3
Проведен в условиях примера N 1 при массовом соотношении бутилметакрилат/вода = 1 : 10, концентрации 5,5'-азобис-(5-цианпентановой кислоты) 0,010 М, Na₂HPO₄ 0,150 М. Добавлен раствор NaOH концентрации 1,55 М до pH 9,5. Размер частиц латекса 0,63 мкм, коэффициент дисперсности 1,002, относительная дисперсия 2,8%. Поверхностная концентрация карбоксильных групп латекса - 1,0 мг- экв/м².

Пример N 4
Проведен в условиях примера N 1 при массовом соотношении (стирол + глицидилметакрилат) / вода = (0,8+0,2) : 10, концентрации ЦВК 0,010 М, KHC₈H₄O₄ (гидрофталат калия) 0,020 М. Добавлен раствор NaOH концентрации 1,55 моль/л до pH 9,5. Размер частиц латекса 0,62 мкм, коэффициент дисперсности 1,006, относительная дисперсия 3,4%. Поверхностная концентрация карбоксильных групп латекса - 4,3 мг-экв/м².

Пример N 5
Проведен в условиях примера N 1 при массовом соотношении стирол/вода = 1 : 25, концентрации ЦВК 0,020 М, NaHCO₃ 0,010 М, добавлен раствор NaOH концентрации 1,55 М до pH 7,0. Размер частиц латекса 0,52 мкм, коэффициент дисперсности 1,007, относительная дисперсия 4,9%. Поверхностная концентрация карбоксильных групп латекса - 5,7 мг-экв/м².

Пример N 6
Проведен в условиях примера N 1 при массовом соотношении метилметакриат/вода= 1: 7, концентрации ЦВК 0,010 М, NaH₂C₆H₅O₇ (цитрат натрия) 0,005 М, Na₂HPO₄ 0,005 М, добавлен раствор NaOH концентрации 1,55 М до pH 10,2. Размер частиц латекса 1,52 мкм, коэффициент дисперсности 1,012, относительная дисперсия 8,2%. Поверхностная концентрация карбоксильных групп латекса - 3,8 мг-экв/м².

Пример N 7
Проведен в условиях примера N 1 при массовом соотношении стирол/вода = 1 : 10, концентрации ЦВК 0,001 М, Na₂PO₄ 0,005 М, добавлен раствор NaOH концентрации 1,55 М до pH 14,0. Размер частиц латекса 2,50 мкм, коэффициент дисперсности 1,019, относительная дисперсия 9,6%. Поверхностная концентрация карбоксильных групп латекса - 1,4 мг-экв/м².

Пример N 8
Сенсибилизация латекса с карбоксилированной поверхностью, полученного в условиях примера N 1: 1% суспензию латексных частиц в деионизированной воде обрабатывали раствором 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимида 5-10 мг/мл, смешивали в соотношении 1:1 по объему с раствором поликлональных антител к Neisseria meningitidis A (100 мкг/мл), инкубировали в течение 2-6 часов при 37^oC. Сенсибилизированные латексы переводили в 0,1 М глициновый буфер (0,9% NaCl, pH 8,3) с 1% бычьего сывороточного альбумина. Конечная концентрация латекса в диагностикумах доводилась разбавлением буфером до 0,25%.

Пример N 9
Сенсибилизация латекса с карбоксилированной поверхностью, полученного в условиях примера N 2, производилась в условиях примера N 8.

Пример N 10
Испытания полученных диагностикумов, полученных в условиях примеров NN 8 и 9 производилось по следующей методике:
1. Готовили суспензию бактериальных клеток в фосфатно-солевом буфере (0,9% NaCl, pH 7,2) от 10⁹ до 10⁴ кл./мл.

2. 20 мкл латекса смешивали на стекле с 20 мкл бактериальной суспензии и инкубировали при круговом покачивании.

3. Для контроля (определение спонтанной агглютинации) 20 мкл латекса смешивали на стекле с 20 мл фосфатно-солевого буфера.

4. Учет результатов реакции производили визуально по шкале от (++++) до (-), агглютинация на (++++) означала образование крупных агрегатов латексных частиц в течение 1-2 мин, на (+++) образование крупных агрегатов латексных частиц в течение 5 мин, на (++) - образование агрегатов среднего размера, (+) - образование агрегатов мелкого размера и (-) - отсутствие агрегации (cм. таблицу).

Анализ примеров конкретного выполнения показывает, что заявляемый способ позволил решить поставленную задачу. Полученные латексы характеризуются диаметром частиц в интервале 0,5 - 2,5 мкм, при этом относительная дисперсия не превышает 10%; достигается поверхностная концентрация карбоксильных групп в интервале 1 - 6 мг-экв/м². Использование полученных латексов при конструировании иммунодиагностикумов позволяет получать препараты с высокой чувствительностью на уровне лучших известных зарубежных аналогов [Bangs L.B. Commercial latex diagnostic tests. The latex course. 1994. V. 12/1].

Изобретение не ограничивается вышеприведенными примерами.

Выход за пределы интервала заявленной концентрации солей приводит к ухудшению характеристик латексов, получаемых заявляемым способом:
1. При снижении концентрации солей до 0,004 М в расчете на водную фазу размер латексов не превышает 0,45 мкм.

2. При увеличении концентрации солей до 0,16 М наблюдается уширение распределения частиц латекса по размерам и увеличение количества коагулюма, что снижает выход целевого продукта.

Описывается способ получения монодисперсного синтетического полимерного латекса с карбоксилированной поверхностью частиц путем безэмульгаторной эмульсионной полимеризации винильного мономера в водно-щелочной среде в присутствии карбоксилсодержащего инициатора при нагревании. Он отличается тем, что в качестве винильного мономера используют один или смесь мономеров из ряда: стирол, винилацетат, (мет)акрилаты и в исходную реакционную смесь дополнительно вводят соль со способностью создавать буферные растворы в области щелочных значений pH или смесь таких солей при концентрации соли в расчете на водную фазу 0,005-0,150 М. Изобретение может найти применение в коллоидной химии, биохимии, биотехнологии и медицине, в основном, для получения носителей иммунореагентов в иммуноанализе. Технический результат - создание способа получения полимерного латекса, отвечающего требованиям, предъявляемым к носителям иммунореагентов.

Способ получения монодисперсного синтетического полимерного латекса с карбоксилированной поверхностью частиц путем безэмульгаторной эмульсионной полимеризации винильного мономера в водно-щелочной среде в присутствии карбоксилсодержащего инициатора при нагревании, отличающийся тем, что в качестве винильного мономера используют один или смесь мономеров из ряда стирол, винилацетат, (мет)акрилаты и в исходную реакционную смесь дополнительно вводят соль со способностью создавать буферные растворы в области щелочных значений pH или смесь таких солей при концентрации соли в расчете на водную фазу 0,005 - 0,150 М.