ПРОИЗВОДНЫЕ АРАБИНОФУРАНОЗИЛ-ЦИТОЗИНА И СОДЕРЖАЩИЕ ИХ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ КОМПОЗИЦИИ Российский патент 2001 года по МПК A61K31/7068 A61P35/00 C07H19/06 C07H19/09 

Изобретение относится к некоторым нуклеозидным производным, которые, как было найдено, обладают ценными свойствами для лечения опухолей.

Нуклеозидные производные являются сложными эфирами 1 - β-D-арабинофуранозилцитозина (Ara-C) формулы A:

Ara-C иногда обозначают как цитозар.

Ara-C давно известен как химиотерапевтическое средство для лечения острого миелогенного лейкоза, но имеет ограниченную эффективность против твердых опухолей (Fre et al., Cancer Res. 29 (1969), 1325-1332; Davis et al. Oncology, 29 (1974), 190-200; Cullinan et al., Cancer Treat.Rep. 61 (1977), 1725-1726). Однако даже при лечении лейкоза Ara-C находил только ограниченное использование из-за его очень короткого биологического периода полураспада и его высокой токсичности.

С целью преодоления этих трудностей рядом исследователей были получены и испытаны пролекарственные производные Ara-C. Например, Hamamuca et al., исследовали 3'-ацил- и 3',5'-диацилпроизводные Ara-C (J.Med. Chem. 19 (1976) N 5, 667-674). Эти исследователи получили и испытали различные производные Ara-C с насыщенными или ненасыщенными сложными эфирными группами, содержащими от 2 до 22 атомов углерода, и они обнаружили, что многие из этих соединений проявляют более высокую активность против лейкемии L1210 у мышей, чем сам исходный нуклеозид.

Работа Hamamura et al. и другие работы по пролекарственным аналогам Ara-C описаны в Hadfield et al. в Advances in Pharmacology and Chemotherapy, 20, 1984, pages 21-67. При обсуждении сложных 5' эфиров Ara-C эти авторы пришли к заключению (с. 27), что:
"хотя многие из этих средств, по-видимому, действуют как очень эффективные формы депо Ara-C в мышах, аналогичное действие на человеке не было показано".

Хотя исследование продолжали на пролекарствах, основанных на Ara-C, включая 3' и 5'-ацилпроизводные (см., например, Rubas et al. в Int. J.Cancer, 37, 1986, pages 149-154, которые испытывали липосомные готовые препаративные формы, между прочими производными, 5'-олеил - Ara-C против лейкоза L1210 и меланомы В16), на сегодняшний день никакие подобные лекарственные средства не стали пригодными для клиницистов.

Механизм действия Ara-C основывается на его ферментативном узнавании как 2'-деоксирибозид и последующем фосфорилировании в нуклеозидтрифосфат, который конкурирует с нормальным СТР (цитозин-5'-трифосфат) за включение в ДНК. 2'-Гидроксильная группа вызывает стерическое затруднение для вращения пиримидинового основания вокруг нуклеозидной связи. Основания полиарабинонуклеотидов не могут "наращиваться" нормально, как это делают основания полидезоксинуклеотидов. Ara-C ингибирует восстановление ДНК и синтез ДНК как посредством замедления удлинения цепи "вниз по течению", так и движения вновь репликатированной ДНК посредством связанного с матрицей аппарата репликации. Механизм действия Ara-C приводит к "несбалансированному росту" в делящихся клетках. Ara-C действует в S-фазе клеточного цикла. Для непрерывного ингибирования синтеза ДНК и в конце концов смерти клетки необходимо, чтобы Ara-C присутствовало в достаточно высокой концентрации в течение по меньшей мере одного клеточного цикла.

Основной причиной, почему Ara-C не используют при лечении твердых опухолей, является опять быстрое выведение из активного лекарственного средства раковых клеток и плазмы. Очевидно, что невозможно достичь значительного внутриклеточного уровня лекарственного средства в опухолевой ткани, даже если рассматриваемая опухоль чувствительна к Ara-C in vitro. Неожиданно пролонгированное время полураспада и измененное распределение продуктов по данному изобретению в ткани будет иметь огромное значение для терапевтического действия этих продуктов.

Обнаружено, как показано на фиг. 7, 8 и 9, что в отличие от самого Ara-C, а также других сложных моно и диэфиров, 3' и 5'-O-эфиры Ara-C и некоторых насыщенных и ненасыщенных жирных кислот неожиданно проявляют высокую активность против различных опухолей.

Полагают, что модель для испытания, которую обычно используют (инъекция лейкозных клеток в брюшную полость и внутрибрюшинная обработка), более сравнима с моделью in vitro, чем с действительной клинической ситуацией, и может приводить к невозможности определения особенно ценных свойств выбранных сложных эфиров Ara-C, используемых в настоящем изобретении, как будет описано ниже.

Более конкретно, сложные 3'- и 5'-O-эфиры, которые используют по настоящему изобретению, являются эфирами, производными от насыщенных и мононенасыщенных C₁₈- или C₂₀- жирных кислот.

Таким образом, сложные эфиры, используемые в настоящем изобретении, можно представить формулой I:

где R₁ и R₂ независимо выбирают из водорода и C₁₈ - и C₂₀-насыщенных и мононенасыщенных ацильных групп, при условии, что R₁ и R₂ не могут быть оба водородом.

Двойная связь мононенасыщенных ацильных групп может быть либо в цис-, либо транс-конфигурации, хотя терапевтическое действие может изменяться в зависимости от того, какую конфигурацию используют.

Положение двойной связи в мононенасыщенных ацильных группах, по-видимому, также влияет на активность. В настоящее время предпочитают использовать сложные эфиры, имеющие ненасыщенность в ω- 9-положении. (В ω- системе номенклатуры положение (ω) двойной связи мононенасыщенной жирной кислоты считают от концевой метильной группы, так, например, эйкозеновая кислота (C₂₀: 1 ω -9) имеет 20 атомов углерода в цепи и единственная двойная связь образована между атомами 9 и 10, считая от концевой метильной группы цепи). Таким образом, предпочтительно использовать эфиры Ara-C, производные от олеиновой кислоты (C₁₈: 1, ω -9, цис), элаидиновой кислоты (C₁₈: 1, ω -9 транс) и эйкозеновой кислоты (C₂₀: 1, ω -9, цис) и (C₂₀: 1, ω -9, транс), и стеариновой кислоты (C₁₈: O), и эйкозановой кислоты (C₂₀: О).

При лечении различных опухолей в соответствии с настоящим изобретением можно использовать как сложные 3'-O- и 5'-O-моноэфиры, так и сложные 3', 5'-диэфиры, но вообще предпочтительны 5'-O-моноэфиры. Предполагается, что сложные 3',5'-O-диэфиры будут полезны в тех случаях, когда благоприятны липофильные свойства, например, при абсорбции или поглощении в липидных тканях.

Соединения формулы (1), где R₁ и R₂ независимо выбирают из группы, включающей водород, элаидоил, олеоил, стеароил, эйкозеноил (цис или транс) и эйкозаноил, при условии, что R₁ и R₂ не могут быть оба водородом, олеоилом или стеароилом. R₁ не может быть водородом, когда R₂ представляет олеоил или стеароил, и R₂ не может быть водородом, когда R₁ представляет элаидоил, олеоил или стеароил, являются новыми соединениями, ранее неописанными в известном уровне техники.

Более конкретно новые соединения формулы (1) определены в приведенной в конце описания таблице А, где указаны значения R₁ и R₂.

Ограничивающим использование Ara-C фактором является его разрушение цитидиндеаминазой и деоксицитидинмонофосфат (dCMP) деaминaзoй с образованием неактивных метаболитов. Было неожиданно обнаружено, что сложные моноэфиры этого изобретения являются плохими субстратами для этих деактивирующих ферментов. Это различие может означать, что эти эфирные производные являются более подходящими, чем сам Ara-C, для системного или локального лечения злокачественных опухолей, особенно злокачественных опухолей в RES (ретикулоэндотелиальной системе) и CNS (центральной нервной системе).

Это ясно продемонстрировано в модели лейкозных метастаз в головном мозге, показанных на фиг. 10, 11 и 12, и особенно с более агрессивной B-клеточной лимфомой, показанной на фигуре 11, где сам Ara-C лишен активности.

При клиническом лечении миелогенного лейкоза быструю деактивацию Ara-C компенсируют непрерывным вливанием его на протяжении 5-7 дней, чтобы установить разумно стабильный терапевтически активный уровень Ara-C в плазме. Обнаружено, что после внутривенного введения крысам эквимолярных количеств радиомеченого Ara-C и Ara-C-5'-элаидилового эфира достигается успешное изменение скорости метаболизма и профиля экскреции. Как можно видеть из данных таблицы 1 и фиг. 20, введение Ara-C-5'-элаидилового эфира дает как более высокую первоначальную концентрацию его в цельной крови и плазме, так и более медленное превращение в Ara-U. Деаминирование Ara-C в Ara-U сложных эфиров этого изобретения - здесь приведен пример введения элаидата - наблюдают как значительно более медленное и в то время как уровни как Ara-C, так и Ara-U в плазме находятся ниже предела обнаружения их в анализе в точке 48 ч, когда вводят чистый Ara-C, эти два соединения можно все же количественно определить в точке 72 ч после введения Ara-C-5'-элаидата. Как можно увидеть из таблицы 2, общее экскретированное количество Ara-U (AUC, 0-72 ч) одно и то же для обоих введенных соединений. В клинических ситуациях эти результаты отражаются в более широком временном интервале терапевтически активной концентрации Ara-C в крови. В модели лейкоза in vivo, показанной на фиг. 13, сравнивают Ara-C и 5'-элаидиновый эфир и противораковое действие, подобное такому действие, достигаемому с Ara-C, демонстрируют введением 1/20 молярной дозы эфира.

Если подобный профиль токсичности, который обнаруживают в клинике с Ara-C, наблюдают с эфирными производными, улучшение терапевтического индекса должно быть величиной такого же порядка (х20) как улучшение отношения доза/действие.

Основное значение при лечении лейкозных и других болезней, ограниченных ретикулоэндотелиальной системой (RES), имеет, конечно, временной интервал активной концентрации лекарственного средства в плазме, но кроме того, будет иметь огромное значение локализация активного соединения в ткани RES (определена как печень, селезенка, лимфа, легкие, стенки кишечника и свободные фагоцитарные клетки, присутствующие, например, в костном мозге и цельной крови). Наблюдали (фигура 21 и таблица 1), что при внутривенном введении эквимолярных количеств Ara-C и Ara-C-5'-элаидилового эфира концентрация активного лекарственного средства в тканях RES значительно выше и сохраняется более длительный интервал времени при введении эфирного производного. Характер распределения и метаболизма исследовали более детально и результаты для печени приводятся на фигуре 19. Терапевтически существенный уровень Ara-C сохраняется в течение по меньшей мере 72 ч после введения эфирного производного. Это может предоставить возможность лечения первоначального рака печени или метастаз в печень колоректального рака, рака молочной железы, меланомы или других форм рака. Лечение можно проводить как монотерапию или как паллиативное/помогающее лечение в сочетании с хирургией, облучением или другой химиотерапией.

Наблюдают также повышенные концентрации Ara-C в других тканях, и это в сочетании с меньшим объемом распределения может открыть путь для терапии Ara-C-эфирами форм рака, обычно не связанных с лечением Ara-C.

Кроме того, неожиданно обнаружено, что сложные эфиры по этому изобретению (фигура 15) стимулируют в до большой степени активацию NFkappaB, тогда как Ara-C не дает никакой стимуляции. Стимуляция является биологическим действием, обычно не наблюдаемым при использовании терапевтических химических агентов, в особенности с обычными цитостатическими агентами. Это позволяет предположить, что Ara-C-эфиры по этому изобретению обладают стимулирующим действием на определенные иммунные факторы, что позволяет объяснить неожиданное улучшение противоракового действия. Это является особенно важным при лечении опухолевых болезней, включающих иммунокомпетентные клетки, такие как лейкозные и лимфоматозные.

Развитие устойчивых раковых клеток является серьезной проблемой в современной химиотерапии рака. Обнаружено (фигуры 7-9), что производные Ara-C по этому изобретению проявляют такое же действие против клеток, устойчивых к цисплатине (NHIK 3025/DDP), и клеток, устойчивых к MDR (А549), как и против соответствующих нерезистентных клеточных линий. Можно предположить, что это обусловлено тем, что эти производные не являются субстратами для клеточных механизмов истечения лекарственного средства из клетки, таким как "насос MDR gp 120", ответственный за феномен, известный как резистентность ко многим лекарственным средствам.

C₁₈ - и C₂₀ - сложные моно- и диэфиры Ara-C можно использовать по настоящему изобретению для лечения ряда неопластических опухолей. Обнаружено особенно перспективное действие на опухоли молочной железы, таких как глиома, и метастаз из других опухолей, таких как саркомы, карциномы, а также лейкоз. В настоящее время глиому лечат хирургией, радиационной терапией и цитостатическими средствами, например N, N-бис-(2- хлорэтил)-N-нитрозомочевиной (BCNU). Однако прогноз таких лечений очень плохой.

Полезные действия сложных эфиров Ara-C по настоящему изобретению обнаружены также в метастатических опухолях, таких как карцинома, саркомы, лейкоз и меланомы.

Объем изобретения и его существенные и предпочтительные отличительные признаки определены в прилагаемой формуле изобретения.

Биологическое действие
Мицеллярная препаративная форма
Мицеллярную готовую препаративную форму 1 мг/мл получают смешиванием 1:1 (мас. /мас.) сложного эфира Ara-C (в DMSO) и лецитина (в этаноле) в стерильной воде.

Анализ клоногенной агарозы¹
Биопсию брали у пациента и сразу помещали в среду для выращивания. Ткань опухоли измельчали механически и отбирали живые клетки, добавляли химиотерапевтическое испытуемое вещество, BCNU (в воде) и Ara-C, и эфиры Ara-C (в мицеллах) и клетки культивировали в среде мягкой агарозы. За двадцать четыре часа до окончания культивирования (7 дней) добавляли ³H тимидин. Активность испытуемого вещества таким образом количественно определяли как число импульсов в минуту в сцинтилляционном счетчике.

¹G. Unsgaard et al., Acta Neurochir (Wien) (1988) 91:60-66.

Фигура 1
Показаны результаты, полученные с глиобластомой, взятой у пациента. Такая же картина ответа обнаружена в 8 других биопсиях глиобластомы. График показывает сравнение in vivo Ara-C и его 3'-элаидилового эфира и 5'-элаидилового эфира. Результаты приводятся как % от необработанного контроля. Значение 50% (CD₅₀) выбирают как перспективное для использования в терапии этой действительной раковой линии. По сравнению с элаидиловыми эфирами здесь не имеет практического значения концентрация Ara-C, более высокая, чем 10^1,5, необходимая для получения CD₅₀.

Фигура 2
Показаны результаты, полученные с той же глиобластомой, как на фигуре 1. График показывает сравнение радиационной терапии и химиотерапии (BCNU). Доза радиации выше чем 10 грэй (Гр), необходимая для получения CD₅₀, не имеет практического значения в терапии. Сравнение фигур 1 и 2 показывает, что концентрация BCNU, необходимая для получения CD₅₀, приблизительно в 10 раз выше, чем концентрация, которая необходима при использовании сложного эфира Ara-C, но приемлемо сравнима с концентрацией самого Ara-C.

Фигура 3
Показаны результаты, полученные с биопсией, взятой из метастаз меланомы головного мозга. Разница между Ara-C и 3'-и 5'-элаидиловыми эфирами не так резко выражена, как с глиомой, но все же на 10 порядков выше.

Фигура 4
Показана активность BCNU по отношению к клеточной линии меланомы. По сравнению с эфирами Ara-C для получения CD₅₀ требуется концентрация BCNU большая 1х10².

Фигура 5
Этот график показывает результаты с метастазой карциномы (легкого) головного мозга. Эти раковые клетки более устойчивы к химиотерапии, но разница между Ara-C и эфирами Ara-C все же присутствует.

Фигура 6
Результаты обработки BCNU метастазы карциномы (легкого), которые представлены здесь, схожи с результатами, уже продемонстрированными с другими клеточными линиями.

Что касается других исследованных клеточных типов, по-видимому, имеется явное различие активности сложных эфиров Ara-C, Ara-C и BCNU. Активность 1·10² очень перспективна для терапии. Полученные данные показывают, что 5'-эфиры более активные, чем 3'-эфиры.

Инактивация клеток - способность к образованию колоний
Инактивацию клеток, измеряемую по потере способности к образованию колоний, определяли для нескольких соединений.

Используемые клетки были установленными клеточными линиями происхождения in situ рака шейки матки человека, NHIK 3025, NHIK 3025/DDP, цис-DDP-резистентным вариантом тех же клеток или клетки А549 (карцинома легких человека). Эти клетки подвергали воздействию испытуемого соединения в течение от 4 вплоть до 24 ч. Испытуемые соединения вводили в виде мицеллярного раствора. Число колоний подсчитывали приблизительно через 12 дней после инкубации.

Фигура 7
График показывает сравнение in vitro испытуемых соединений Ara-C, Ara-C-5'-элаидилового эфира, Ara-C-5'-стеарилового эфира, Ara-C-5'-эйкозенового эфира и Ara-C-5'-петроселинового эфира. Результаты приведены в виде дозы, необходимой для снижения выживания клеток на 90% по отношению к необработанному контролю. Как видно из графика, наблюдается существенно более высокая инактивация клеток после воздействия на них указанных эфиров по сравнению с самим Ara-C. Дозу модифицирующей фактор при уровне выживания 10% находится в диапазоне от 3 до 5 для Ara-C эфиров по сравнению с Ara-C, который означает, что для получения той же пониженной способности к образованию колоний, как наблюдаемая для эфиров, требуется доза Ara-C в 3-5 раз выше.

Фигура 8
Получены результаты обработки клеток NHIK 3025/DDP в течение 4 час. Наблюдали усиление действия в клетках NHIK 3025, аналогичное обнаруженному усилению действия Ara-C-5'-элаидатного эфира по сравнению с действием Ara-C. Усиленное действие не зависит от резистентности к цис-DDP.

Фигура 9
График показывает сравнительные результаты по in vitro способности к образованию колоний клеток А549 (клетки карциномы легких человека) для испытуемых соединений Ara-C, Ara-C-5'-элаидилового эфира, Ara-C-5'-стеарилового эфира, Ara-C-5'-эйкозенового эфира и Ara-C-5'-петроселинового эфира. Клетки подвергали воздействию в течение 24 ч. Наивысшую инактивацию наблюдали для Ara-C-5'-стеарилового эфира, но повышенное действие наблюдали также для элаидилового и петроселинового эфиров.

B-лимфомные клетки Raji человека - модель лептоменингитного карциноматоза у голых крыс.

Используемая модель является моделью опухоли у голых крыс для лептоменингитного роста опухолей, 1·10⁶ клеток B-клеточной опухолевой линии Raji вводили инъекцией в цереброспинальную жидкость через cisterna magna (c.m.) (пространство между паутинной оболочкой и поперечной щелью мозжечка) голым крысам в возрасте 4-5 недель. У животных развивались неврологические симптомы через 12-14 дней, если их не лечили. Анестезированных животных обрабатывали интрацеребрально инъекцией 40 мкл в cisterna magna 3 или 4 болюсов. Обработку начинали через 1 день после клеточной инокуляции. Испытуемыми соединениями были Ara-C-5'-элаидиловый эфир (в мицеллах) и Ara-C. Ara-C вводили как в максимально переносимой дозе (MTD), так и в дозе, эквимолярной дозе Ara-C-5'-элаидилового эфира. У контрольных животных (обработанных NaCl или пустыми липосомами (мицеллы без эфиров Ara-C)) развивались симптомы нарушения центральной нервной системы приблизительно через 14 дней.

Фигура 10
Инъекции 3 болюсов с Ara-C элаидатом на 1, 2 и 4 день увеличивают латентный период без симптомов на 135% по сравнению с Ara-C, со средним днем смерти, задержанным со дня 13 до дня 30,5, как видно на фиг. 10. Одна крыса была жива в течение более чем 70 дней, ее рассматривали как вылечившуюся. При вскрытии ее на 76 день не было никаких видимых опухолей. Это повышение в продолжительности существования без болезни превосходит результаты, полученные с другими терапевтическими альтернативными средствами, испытанными в сравнимых моделях для различных типов опухолей человека.

Фигура 11
На этой фигуре показаны кривые выживания для дополнительного эксперимента с голыми крысами, инокулированными клетками Raji в головной мозг и обработанными дозами 4 болюсов. Суточную дозу в виде одного болюса вводили в 1, 2, 3 и 4 день в cisterna magna. Как и в предыдущем эксперименте, не наблюдали какого-либо действия для Ara-C как при максимально переносимой дозе Ara-C (MTD), так при дозе, эквимолярной дозе Ara-C-элаидата. Результаты для группы, получившей Ara-C-элаидат, были даже более удивительными, чем результаты в предыдущем эксперименте. 3 из 5 крыс были все еще живыми и не имели симптомов на 70 день. Их рассматривали как случаи выздоравливания. Это наиболее перспективный результат. 5 из 6 контрольных крыс погибли на 13 лень. Шестая контрольная крыса не имела обратного забрасывания цереброспинальной жидкости в шприц после инъекции опухолевых клеток и не имела неврологических симптомов через 70 дней. В соответствии с обычной методикой это животное не учитывают в результатах.

Лимфомные клетки Molt 4 человека - модель лептоменингитного карциноматоза в голых крысах
Используемая модель является моделью опухоли у голых крыс для лептоменингитного роста опухолей 1·10⁶ клеток T-клеточной опухолевой линии Molt 4 вводили инъекцией в цереброспинальную жидкость через cisterna magna (c.m.) голым крысам в возрасте 4-5 недель. У животных развивались неврологические симптомы через 20-22 дня, если их не лечили. Анестезированных животных обрабатывали интрацеребрально инъекцией 40 мкл в cisterna magna с инъекциями 4 болюсов. Обработку начинали через 1 день после клеточной инокуляции. Испытуемыми соединениями были Ara-C-5'-элаидиловый эфир (в мицеллах) и Ara-C. Ara-C вводили как в максимально переносимой дозе (MTD), так и в дозе, эквимолярной дозе Ara-C-5'-элаидилового эфира. У контрольных животных (обработанных NaCl) развивались симптомы нарушения в центральной нервной системе приблизительно через 20 дней.

Фигура 12
На фигуре 12 показано выживание как функция времени для крыс, которым инъецировали в головной мозг клетки лимфомы Molt 4 и обработанных 4 раза в cisterna magna. В этом первоначальном эксперименте начало гибели для животных, получающих Ara-C-элаидат, задерживалось по сравнению с животными, получающими Ara-C, или с контролем. Число животных на группу было следующим: контроль (7), Ara-C-элаидат (3) и Ara-C (5).

Модель лейкоза, в которой использовали B-лимфомные клетки Raji человека
Мышам SCID инъецировали внутривенного 1·10⁶ B-лимфомных клеток Raji человека. Мышей обрабатывали на 7, 9, 11, 13 и 15 день после инъекции опухолевых клеток либо 20 мг/кг/день Ara-C-элаидата или 200 мг/кг/день Ara-C, либо они являлись контролем. У животных в результате роста опухоли развивался паралич задних лап. Средний день смерти для животных, получавших различную обработку, показан на фигуре 13.

Фигура 13
На этой фигуре показано среднее выживание мышей SCID, инъецированных внутривенно B-лимфомными клетками Raji человека и либо обработанных внутривенно одной инъекцией Ara-C-элаидата или Ara-C в каждый из дней 7, 9, 11, 13 и 15, либо являющихся контролем. Эти дозы составляли 20 мг/кг Ara-C-элаидата и 200 мг/кг Ara-C. На эквимолярной основе доза Ara-C-элаидата, сниженная в 20 раз по сравнению с дозой Ara-C, повышала среднее выживание по сравнению с контролем и животными, обработанными Ara-C. Число животных в каждой группе составляло 7.

Фигура 14
На этой фигуре показано среднее выживание мышей, инфицированных внутривенно B-лимфомными клетками Raji человека и либо обработанных внутривенно одной инъекцией в каждый из дней 7-11 Ara-C-элаидатом или Ara-C, либо являющихся контролем. Среднее время выживания значительно пролонгировано для Ara-C-элаидата, когда обработку повторяют ежедневно вместо проведения ее через день.

Активация клеточного фактора транскрипции NFkappaB
Использовали клетки аденокарциномы ободочной кишки SW480 человека стабильно трансфикцированные промотор CMV/энхансер-содержащим геном β-галактозидазы. Активация фактора транскрипции NFkappaB приводит к повышенному содержанию фермента β -галактозидаза в цитоплазме. Количество β -галактозидазы количественно определяли, используя оптическую плотность при 570 нм как параметр. Клетки SW380 инкубировали 2-3 дня перед воздействием на них испытуемого соединения в течение 4 ч. Клетки промывали и готовили и регистрировали оптическую плотность для разных соединений.

Фигура 15
После воздействия Ara-C не наблюдали (определяли измерением) никакой активности β -галактозидазы, в то время как после воздействия Ara-C-элаидата наблюдали значительное повышение активности β -галактозидазы, как повышение оптической плотности при 570 нм. Это указывает на то, что с Ara-C-элаидатом получают неожиданно высокую индукцию транскрипционного активирующего белка NFkappaB. NFkappaB вовлекается в генный контроль ряда иммунных факторов, и эта активация Ara-C-элаидатом может объяснить повышенное антираковое действие, наблюдаемое для Ara-C-элаидата. Можно ожидать стимуляцию некоторых иммунных клеток Ara-C-элаидатом, которая может быть особенно интересной при лечении лейкоза и лимфом.

Антиопухолевая активность Ara-C-элаидата по сравнению с Ara-C против мышиной лимфомы TLX/5
Мышей CBA с массой 20-25 г инокулировали подкожно в области паха 1·10⁵ опухолевых клеток TLX/5 в день О. Ara-C-элаидат или Ara-C вводили внутрибрюшинно в дни 3, 4, 5, 6 и 7. Дозы были в диапазоне 6,25-50 мг/кг/день. Использовали по 5 мышей на каждую группу обработки и 10 контрольных мышей с опухолями. Активность определяли по повышению длительности жизни (ILS) относительно контроля.

Фигура 16
На этой фигуре показаны % повышения длительности жизни мышей, имеющих лимфомную опухоль TLX/5 (в среднем 5 на группу) после обработки Ara-C-элаидатом или Ara-C, внутрибрюшинная обработка в течение 5 дней. Ara-C проявлял активность только при дозе 25 мг/кг, тогда как Ara-C-элаидат проявлял активность при дозах 12,5 мг/кг и 25 мг/кг. Максимальное повышение длительности жизни составляло 47,2% по сравнению с 32,7% для Ara-C.

Антиопухолевая активность Ara-C-элаидата по сравнению с Ara-C у мышей SCID, инокулированных внутрибрюшинно клетками гемангиосаркомы
Мышей SCID инокулировали внутрибрюшинно клетками гемангиосаркомы PV/2b/35. Мышей обрабатывали 5 дней в неделю 25 мг/кг/день Ara-C-элаидата, приготовленного в мицеллах, Ara-C-элаидата, растворенного в DMSO (диметилсульфоксид), или Ara-C, растворенного в PBS (физиологический раствор с фосфатным буфером). Контрольные мыши получали пустые мицеллы, DMSO или PBS соответственно. Животных не обрабатывали с субботы до понедельника. Выживание было конечной точкой исследования.

Фигура 17
Выживание мышей SCID, инокулированых внутрибрюшинно клетками гемангиосаркомы PV/2b/35. Выживание значительно повышалось для животных, обработанных Ara-C-элаидатом. Повышенное выживание по сравнению с контролем наблюдали как для Ara-C-элаидата, приготовленного в мицеллах, так и для Ara-C-элаидата, растворенного в DMSO.

Фигура 18
Результаты, представленные здесь, получены при изучении влияния 5'-Ara-C-элаидилового эфира на рост глиобластомной опухоли у голых мышей. Тканевую культуру глиобластомной клеточной линии U-118 (Uppsala) инъецировали подкожно голым мышам. Небольшую часть (2х2 мм) растущей опухоли пересаживали новым мышам. Подкожные опухоли показывали до некоторой степени разную скорость роста в различных животных, но при размере 4-6 мм мицеллярный раствор 10 мг/мл эфира Ara-C вводили инъекцией внутрь опухоли. В зависимости от действительного размера опухоли животные получали то же самое относительное количество испытуемого вещества. Контрольные мыши получали водный солевой раствор. Рост опухоли регистрировали как относительный объем опухоли (RTV). Контрольная опухоль развивалась соответственно нормальной модели роста, типичной для этого типа рака. Отмечена полная остановка роста опухоли у обработанных животных. Кроме того, у животных не наблюдалось симптомов токсичного побочного действия, которым в случае Ara-C является повреждение костного мозга с развитием анемии или кровотечения, не было замечено также каких-либо симптомов расстройства ЦНС.

Сравнительная фармакокинетика, распределение, метаболизм и экскреция ¹⁴C-Ara-C-элаидата и ¹⁴C-Ara-C, введенных внутривенно самцам крыс
¹⁴C-Ara-C-элаидат (в мицеллах) или ¹⁴C-Ara-C вводили внутривенно самцам крыс в эквимолярных дозах, 5 мг/кг для ¹⁴C-Ara-C-элаидата и 2,4 мг/кг для ¹⁴C-Ara-C. Концентрацию в плазме общей радиоактивности и метаболитов определяли в разных временных точках (см. табл. 1 и 2). Концентрацию в ткани общей радиоактивности определяли для различных тканей в различных временных точках вплоть до 120 ч после инъекции. Ткани печени экстрагировали и концентрацию метаболитов определяли вплоть до 72 ч после инъекции. Распределение Ara-C-элаидата в тканях значительно изменялось по сравнению с распределением Ara-C. Максимальные концентрации в большинстве тканей были значительно выше и наблюдались в более поздних временных точках после введения ¹⁴C-Ara-C-алаидата, особенно в цельной крови/плазме, селезенке, печени и легких. Максимальные концентрации в мышцах, слюнных железах, коже и мочевом пузыре были ниже. Было установлено, что пропорция дозы в цельной крови в точке 0,08 часа после введения ¹⁴C-Ara-C-элаидата была 64,7%, значительно выше, чем пропорция, присутствующая в большом круге кровообращения в это время после введения ¹⁴C-Ara-C (7,76%). Экскреция через почечную систему была много медленней для элаидата, чем для самого Ara-C. Удаление из тканей было значительно медленней для ¹⁴C-Ara-C-элаидата по сравнению с удалением из тканей, введенного ¹⁴C-Ara-C.

Фигура 19
Показана зависимость концентрации в печени Ara-C-элаидата (P-Ara-C-el) и метаболитов Ara-C (P-Ara-C) и Ara-U(P-Ara-U) от времени после инъекции ¹⁴C-Ara-C-элаидата на фигуре 15, а также зависимость концентрации Ara-C-(Ara-C) и метаболита Ara-U (Ara-U) от времени после инъекции самого ¹⁴C-Ara-C. Инъекция Ara-C-элаидата вызывала существенно повышенное и пролонгированное воздействие на печень крыс как Ara-C-элаидата, так и Ara-C, без обнаружения Ara-U вплоть до 24 ч. Это сильно контрастировало с концентрацией Ara-C в печени после введения Ara-C как такового. Концентрация Ara-C в печени уменьшалась до неподддающегося определению уровня через 4 ч при присутствии метаболита Ara-U во всех временных точках.

Фигура 20
Зависимость уровней Ara-C-элаидата и метаболитов Ara-C и Ara-U в плазме после внутривенного введения ¹⁴C-Ara-C-элаидата от времени, также зависимость уровней Ara-C и метаболита Ara-U в плазме после внутривенного введения ¹⁴C-Ara-C от времени. Введение Ara-C-элаидата приводило к пролонгированию времени присутствия Ara-C в плазме при поддающемся определению уровне в течение до 72 ч после введения по сравнению с 24 часами после введения Ara-C. Метаболизм Ara-C в Ara-U менее продолжителен и начинается позднее у животных, которые получали Ara-C-элаидат.

Фигура 21
Показана зависимость концентрации общей радиоактивности в ткани от времени после внутривенного введения либо ¹⁴C-Ara-C-элаидата (P), либо ¹⁴C-Ara-C. Тканями, показанными на графике, являлись печень, селезенка, легкие, кость и костный мозг. Концентрация радиоактивности после инъекции ¹⁴C-Ara-C-элаидата была выше во всех временных точках вплоть до 120 ч для всех соответствующих тканей.

Эфиры Ara-C по настоящему изобретению можно сформулировать с обычными носителями и наполнителями для введения.

В качестве наиболее перспективного режима лечения глиом и других твердых опухолей головного мозга в настоящее время рассматривают локальное введение активных соединений в месте опухоли, на которую нужно воздействовать. Для этой цели активные соединения могут предпочтительно присутствовать в виде лецитиновой мицеллярной готовой препаративной формы. Например, предпочтительным лечением метастаз головного мозга может быть введение готовой препаративной формы эфира Ara-C в цереброспинальную жидкость или в область опухоли при помощи дозирующего насоса или подобного устройства.

Эфиры Ara-C по настоящему изобретению можно также вводить системно либо энтерально, либо парентерально.

Для энтерального введения активные соединения по настоящему изобретению могут присутствовать в виде, например, мягких или твердых желатиновых капсул, таблеток, гранул, крупинок или порошков, драже, сиропов, суспензий или растворов.

При парентеральном введении пригодны препараты эфиров Ara-C в виде растворов, суспензий или эмульсий для инъекции или инфузии.

Препарат может содержать инертные или фармакодинамически активные добавки, также известные специалистам в области готовых препаративных форм. Например, таблетки или гранулы могут содержать ряд связующих агентов, материалов-наполнителей, эмульгирующих агентов, веществ-носителей или разбавителей. Жидкие препараты могут присутствовать, например, в форме стерильного раствора. Капсулы могут содержать кроме активного ингредиента материал-наполнитель или загуститель. Кроме того, могут также присутствовать добавки, улучшающие вкус и запах препарата, а также вещества, обычно используемые в качестве консервирующих, стабилизирующих, удерживающих влагу и эмульгирующих агентов, соли для изменения осмотического давления, буферы и другие добавки.

Доза вводимого препарата по настоящему изобретению будет изменяться в соответствии со способом использования и путем введения, а также потребностями пациента. В общем суточная доза при системной терапии для взрослого среднего пациента будет составлять около 0.1-150 мг/кг массы тела/день, предпочтительно 1-50 мг/кг/день. Для местного введения мазь, например, может содержать от 0,1 до 10 мас.% от фармацевтической готовой препаративной формы, в особенности 0,5-5 мас.%.

При желании фармацевтический препарат, содержащий эфиры Ara-C, может содержать антиокислитель, например токоферол, N-метилтокоферамин, бутилированный гидроксианизол, аскорбиновую кислоту или бутилированный гидрокситолуол.

Предполагается также комбинированная терапия, т.е. терапия, в которой введение эфира Ara-C по настоящему изобретению проводят в сочетании с другими терапиями, например хирургией, радиационным лечением и химиотерапией. Например, предпочтительное лечение опухолей головного мозга, включающее сочетание хирургии и лечения эфиром Ara-C по настоящему изобретению при системном или местном введении.

Эфиры Ara-C, используемые в настоящем изобретении, можно в общем получить в соответствии со следующим уравнением реакции:

где Nu-OH означает Ara-C; О представляет кислород в положении 3' и/или 5' части сахара Ara-C; Fa представляет ацильную группу насыщенной или мононенасыщенной C₁₈- или C₂₀- жирной кислоты, и X может быть Cl, Br или OR', где R' представляет Fa, COCH₃, COEt или COCF₃.

Таким образом, реакция проходит посредством ацилирования нуклеозида. Ее проводят, используя подходящие реакционноспособные производные жирных кислот, особенно галогенангидридов кислот или ангидридов кислот. Когда используют галогенангидрид кислоты, такой как хлорангидрид, к реакционной смеси для связывания выделяющейся галогеноводородной кислоты добавляют катализатор, представляющий собой третичный амин, такой как триэтиламин, N,N -диметиланилин, пиридин или диметиламинопиридин. Реакцию предпочтительно проводят в нереакционноспособном растворителе, таком как N,N-диметилформамид или галогенированный углеводород, такой как дихлорметан. При желании любой из указанных выше третичных аминов, используемых в качестве катализаторов, можно использовать в качестве растворителя, следя за тем, чтобы он присутствовал в подходящем избытке. Реакцию предпочтительно проводят при температуре между 5 и 25^oC. Через от 24 до 60 ч реакция по существу завершается. За ходом реакции можно следить, используя тонкослойную хроматографию (ТСХ) и подходящие системы растворителей. Когда реакция завершается, как определено ТСХ, продукт экстрагируют органическим растворителем и очищают хроматографией и/или перекристаллизацией из подходящей системы растворителей. Когда в Ara-C присутствует более чем одна гидроксильная группа, а также аминогруппа, будет получена смесь ацилированных соединений. Требуемые индивидуальные моно- или ди-O-эфиры можно разделить, например, хроматографией, кристаллизацией, экстракцией в сверхкритических условиях и т.д.

Когда требуется получить диэфирное соединение формулы 1, где R₁ и R₂ являются одинаковой ацильной группой, предпочтительно применение указанного выше способа с использованием соответствующего хлорангидрида в избытке.

Чтобы получить диэфирное соединение формулы 1, где R₁ и R₂ разные, предпочтительно получить сначала 3' или 5'-моноэфир и затем моноэфир подвергнуть реакции с подходящим ацилхлоридом.

Получение будет далее показано в следующих рабочих примерах.

Пример 1
5'-O-(Элаидоил)-1- β -D-арабинофуранозилцитозин^1,2.

К суспензии I Ara-C-HCl (1,007 г, 3.6·10³ моль) в 15 мл диметилацетамида (ДМА) добавляют раствор элаидоилхлорида (1,26 г, 4,2 · 10^-3 моль) в 5 мл ДМА и смесь перемешивают при 30^oC в течение 22 ч. Растворитель выпаривают в высоком вакууме и остаток обрабатывают горячим этилацетатом и фильтруют. Сырой продукт обрабатывают 2 М водным NaHCO₃, фильтруют и очищают на колонке силикагеля с применением метанола (5-30%) в хлороформе в качестве системы элюентов. Однородные фракции перекристаллизовывают, получая 1,31 г (72%) указанного в за головке соединения в виде белого твердого продукта (т.пл. 133-134^oC).

¹H ЯМР (DMSO-d₆, 300 МГц) δ: 7,58 (1H, д, H-6), 7.18 (2H, шир.д, NH₂), 6,20 (1H, д, H-5), 5,77 (1H, д, H-1'), 5,65 (2H, м, OH-2' и OH-3'), 5,47 (2H, м, CH= CH), 4,43(1H, м, H-5'₁), 4,30 (1H, м, H-5'₂), 4,1-4,0 (3H, м, H-2', H-3' и H-4'), 2.45 (2H, т, CH₂-COO), 2,05 (4H, м, CH₂-C=), 1,63 (2H, м, CH₂-C-COO), 1.35 (20H, м, CH₂), 0,97 (3H, т, CH₃).

¹³C ЯМР (DMSO-d₆, 75 МГц) δ: 172,8 (COO), 165,59 (C4-N), 155,05 (C=O2), 142,86 (C-6), 130,11 (CH=CH), 92,54 (C-5), 86,23 (C-1'), 81,86 (C-4'), 76,83 (C-3'), 74,35 (C-2'), 63,77 (C-5'), 33,46. 31,95, 31,30, 29,03, 28,97, 28,85, 28,73, 28,52, 28,43, 28,36, 24,48 и 22,12 (CH₂), 13,97 (CH₃).

Пример 2
3'-O-(Элаидоил)-1- β -D-арабинофуранозилцитозин^2,3.

Смесь 2-гидроксиизомасляной кислоты (1,15 г, 12 · 10^-3 моль) и элаидоилхлорида (3,10 г, 10·10^-3 моль) перемешивают при 50^oC в течение 1 ч. Добавляют тионилхлорид (1,5 мл, 21·10^-3 моль) и перемешивание продолжают в течение 2 ч. Реакционную смесь выдерживают при 50^oC и пониженном давлении (40 мм рт.ст.) в течение 14 ч. Полученный 2-элаидоилокси-2-метилпропаноилхлорид используют без какой-либо дальнейшей очистки и суспендируют в 13 мл безводного ацетонитрила. Добавляют цитидин (0,608 г, 2,5·10^-3 моль) и реакционную смесь перемешивают при 60^oC в течение 24 ч. Растворитель выпаривают и остаток обрабатывают простым эфиром. Сырой продукт перемешивают в 40 мл смеси 1:1 пиридин-этанол при 80^oC в течение 20 ч, после чего его выпаривают досуха и продукт очищают на колонке с силикагелем. Однородные фракции перекристаллизовывают, получая 0,446 г (35%) указанного в заголовке соединения в виде белого твердого продукта (т.пл. 164-166^oC).

¹H ЯМР (DMSO-d₆, 300 МГц) δ: 7,71 (1H, д, H-6), 7,2 (2H, шир.д, NH₂), 6,1 (1H, д, H-5), 5,88 (1H, д, h-1'), 5,81 (1H, д, OH-2'), 5,45 (2H, м, CH= CH), 5,18 (1H, м, OH-5'), 5,06 (1H, дд, H-3'), 4.18 (1H, м, H-2'), 4,01 (1H, м, H-4'), 3,75 (2H, м, H-5'), 2,47 (2H, т, CH₂-COO), 2,06 (4H, м, CH₂-C=), 1,65 (2H, м, CH₂-C-COO), 1,35 (20H, м, CH₂), 0,97 (3H, т, CH₃).

¹³C ЯМР (DMSO-d₆, 75 МГц) δ: 172,15 (COO), 165,6 (C4-N), 154,95 (C=0), 142,72 (C-6), 130,11 и 130,08 (CH=CH), 92,59(C-5), 86,24 ( C-1^'), 82,75 (C-4'), 78,72 (C-3'), 72,29 (C-2'), 61,15( C-5'), 33,43, 31,97, 31,30, 29,03, 28,99, 28,85, 28,73, 28,53, 28,41, 28,36, 24,40, 22,12 (CH₂), 13,97 (CH₃).

Пример 3. 5'-O-(цис-11-эйкозеноил)-1- β -D-apaбинoфуpaнoзилцитoзин
К суспензии Ara-C-HCl (0,87 г, 3,1 · 10^-3моль) в 30 мл N, N-диметилформамида добавляют раствор цис-11-эйкозеноилхлорида (1,06 г, 3,22 · 10^-3 моль) в 30 мл ДМА и реакционную смесь перемешивают при 25^oC в течение 24 ч. Растворители выпаривают в высоком вакууме и остаток растворяют в 60 мл кипящего этанола, к которому добавляют 20 мл воды и 20 мл насыщенного раствора NaHCO₃. Сырой продукт фильтруют при комнатной температуре и растворяют в 100 мл кипящего этанола (60% в воде). Сырой продукт перекристаллизовывают из этилацетата, получая 1,1 г (66%) указанного в заголовке соединения в виде белого твердого продукта.

¹H ЯМР (DMSO-d₆, 300 МГц) δ: 7,45 (1H, д, H-6), 7,1 (2H, шир.д. NH₂), 6,08 (1H, д, H-1'), 5,65 (1H, д, H-5), 5,55 (2H, м, OH-2' и OH-3'), 5,32 (2H, м, CH=CH), 4,25 (1H, м, H-5'₁), 4,15 (1H, м, H-5'₂), 4,0-3,85 (3H, м, H-2', H-3' и H-4'), 2,33 (2H, т, CH₂-COO), 1,95 (4H, м, CH₂-C=), 1,5 (2H, м, CH₂-C-COO), 1,25 (24H, м, CH₂), 0,85 (3H, т, CH₃).

¹³C ЯМР (DMSO-d₆, 75 МГц) δ: 172,79 (COO), 165,59 (C4), 155,08 (C=02), 142,78 (C=6), 129,60 (CH=CH), 92,52 (C-5), 86,21 (C-1'), 81,82 (C-4'), 76,75 (C-3'), 74,25 (C-2'), 63,76 (C-5'), 33,41, 31,30, 29,11, 28,85, 28,72, 28,60, 28,42, 26,57, 24,46, 22,11 (CH₂), 13,94 (CH₃).

Источники информации
1. D.T. Gish et al., J. Med. Chem. 14 (1971) 1159.

2. E.K. Hamamura et al., J.Med.Chem. 19 (1976) 667.

3. E.K. Hamamura et al., J.Med. Chem. 19 (1976) 654.

Описываются новые производные арабинофуранозил-цитозина формулы I (Ara-C), где R₁ и R₂ независимо выбирают из водорода и С₁₈- и С₂₀-насыщенных и мононенасыщенных ацильных групп, при условии, что R₁ и R₂ независимо выбирают из водорода и С₁₈- и С₂₀-насыщенных и мононенасыщенных ацильных групп, при условии, что R₁ и R₂ не являются оба водородом; когда R₁ представляет водород, то R₂ не является элаидоилом, эйкозеноилом (цис, транс); когда R₁ представляет эйкозеноил (цис, транс), олеоилом, стеароилом, эйкозаноилом; когда R₁ представляет элаидоил, то R₂ не является эйкозеноилом (цис, транс), стеароилом, эйкозаноилом; когда R₁ представляет олеоил, то R₂ не является эйкозеноилом (цис, транс), стеароилом; когда R₁ представляет эйкозаноил, то R₂ не является стеароилом; когда R₁ представляет стеароил, то R₂ не является эйкозаноилом, олеоилом. Описывается использование производного Ara-C формулы I для получения фармацевтического препарата для лечения твердых опухолей и лимфом, описывается также фармацевтическая композиция для лечения твердых опухолей и лимфом. 3 с. и 9 з.п. ф-лы, 3 табл., 21 ил.

1. Применение производного Ara-C формулы I

где R₁ и R₂ независимо выбирают из водорода и С₁₈- и С₂₀-насыщенных и мононенасыщенных ацильных групп, при условии, что R₁ и R₂ не являются оба водородом;
когда R₁ представляет водород, то R₂ не является элаидоилом, эйкозеноилом (цис, транс);
когда R₁ представляет эйкозеноил (цис, транс), то R₂ не является водородом, элаидоилом, эйкозеноилом (цис, транс), олеоилом, стеароилом, эйкозаноилом;
когда R₁ представляет элаидоил, то R₂ не является эйкозеноилом (цис, транс), стеароилом, эйкозаноилом;
когда R₁ представляет олеоил, то R₂ не является эйкозеноилом (цис, транс), стеароилом;
когда R₁ представляет эйкозаноил, то R₂ не является стеароилом;
когда R₁ представляет стеароил, то R₂ не является эйкозаноилом, олеоилом,
в качестве средства для лечения твердых опухолей и лимфом. 2. Применение производного Ara-C формулы I по п.1, где R₁ и R₂ независимо выбирают из водорода и насыщенных или ω-9-мононенасыщенных С₁₈- и С₂₀-ацильных групп. 3. Применение производного Ara-C формулы I по п.2, где R₁ представляет водород. 4. Применение производного Ara-C формулы I по п.3, где R₂ представляет элаидоильную или эйкозеноильную (цис, транс) группу. 5. Применение производного Ara-C формулы I по любому предыдущему пункту в качестве средства для местного лечения твердых опухолей или лимфом. 6. Применение производного Ara-C формулы I по любому одному из пп.1 - 4 в качестве средства для системного лечения твердых опухолей или лимфом. 7. Применение производного Ara-C формулы I по любому предыдущему пункту в качестве средства для лечения твердых опухолей или лимфом в ретикулоэндотелиальной системе (RES). 8. Применение производного Ara-C формулы I по любому одному из пп.1 - 6 в качестве средства для лечения твердых опухолей или лимфом в центральной нервной системе (ЦНС). 9. Применение производного Ara-C формулы I по любому предыдущему пункту в качестве средства для лечения метастатических опухолей. 10. Производное Ara-C формулы I

где R₁ и R₂ независимо выбирают из группы, включающей водород, элаидоил, олеоил, стеароил, эйкозеноил (цис или транс) и эйкозаноил, при условии, что R₁ и R₂ не могут быть оба водородом, олеоилом, элаидоилом, стеароилом или эйкозаноилом; R₁ не может быть водородом, когда R₂ представляет олеоил или стеароил, и R₂ не может быть водородом, когда R₁ представляет элаидоил, олеоил, стеароил или эйкозаноил. 11. Соединения формулы I по п.10 для получения фармацевтической композиции для лечения твердых опухолей и лимфом. 12. Фармацевтическая композиция для лечения твердых опухолей и лимфом, содержащая производное Ara-C формулы I по п.10, и фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель.