ПРОИЗВОДНЫЕ ГЕМЦИТАБИНА Российский патент 2002 года по МПК C07H19/73 A61K31/7068 A61P35/00 

Изобретение относится к определенным 2', 2'-дифтордезоксицитидиновым (гемцитабиновым) производным насыщенных и мононенасыщенных жирных кислот с длинной цепью и фармацевтическим композициям, содержащим их. Гемцитабин имеет формулу:

Гемцитабин представляет собой нуклеозидный аналог, который в исследованиях in vitro и in vivo показал активность при лечении неопластических состояний. (New anticancer agents, Weiss et al, Cancer Chemotherapy and Biological Response Modifiers Annual 16, editors Pinedo, Longo and Chabner, 1996. Elsevier Science B.V., Supplement to Seminars in Oncology, vol.22, 4, Suppl. 11, 1995, editors Yarbro et al. Gemcitabine Hydrochloride: Status of Preclinical Studies). При клинических испытаниях гемцитабина также наблюдается выгодный эффект. В этих исследованиях как клинические, так и побочные воздействия гемцитабина являются высоко зависимыми. (Seminars in Oncology, vol.22, 4, Suppl.11, 1995, p.42-46).

Гемцитабин активируется внутри клетки дезоксицитидинкиназой до его активной формы - трифосфата гемцитабина (dFdCTP). Параллельно с этим дезоксицитидиндезаминаза инактивирует гемцитабин до соответствующего производного урацила (неактивного).

Заявители неожиданно обнаружили, что определенные производные жирных кислот гемцитабина характеризуются полностью измененной фармакокинетикой и распределением в тканях. Это происходит особенно в случае злокачественных заболеваний RES (ретикулоэндотелиальной системы), легких, поджелудочной железы, кишечника, пищевода, матки, яичников, молочной железы и при меланоме.

Соединения данного изобретения представлены формулой 1:

где R₁, R₂ и R₃ независимо выбирают из водорода и C₁₈ и С₂₀ насыщенных и мононенасыщенных ацильных групп, при условии, что R₁, R₂ и R₃ - все не могут быть водородом.

Гемцитабин имеет три функциональные группы, а именно 5'- и 3'-гидроксильные группы и N⁴-аминогруппу. Каждую группу избирательно превращают в эфирное или амидное производное, однако также образуются ди-аддукты (ди-эфиры и эфир-амиды) и три-аддукты. В случае ди- и три-аддуктов нет необходимости, чтобы ацильные заместители были одинаковыми.

В данный момент предпочтительны моноацильные производные данного изобретения, то есть с двумя из R₁, R₂ и R₃, являющимися водородом. Особенно предпочтительно, что монозамещение ацильной группой происходит в 3'-0 и 5'-0 положениях сахарного фрагмента, наиболее предпочтительно 5'-0 замещение.

Двойная связь мононенасыщенных ацильных групп может находиться в цис или транс конфигурации, хотя терапевтический эффект может отличаться в зависимости от используемой конфигурации.

Положение двойной связи в мононенасыщенных ацильных группах также оказывает влияние на активность. В данном случае предпочтительно использовать эфиры или амиды, имеющие ненасыщенные связи в ω-9 положении. В ω-системе номенклатуры ω положение двойной связи мононенасыщенной жирной кислоты считают от концевой метильной группы так, что, например, эйкозеновая кислота (C₂₀: 1 ω-9) содержит 20 атомов углерода в цепи и образует единственную двойную связь между 9 и 10 углеродами, считая от метильного конца цепи. В изобретении предпочитают использовать эфиры, эфир-амиды и амиды, производные олеиновой кислоты (C₁₈:1 ω-9, цис), элаидиновой кислоты (C₁₈:1 ω-9, транс), эйкозеновой кислоты (т) (С₂₀:1 ω-9, цис) и (С₂₀:1 ω-9, транс), а наиболее предпочтительными производными данного изобретения являются амиды и 5'-эфиры.

В некоторых случаях с пользой используют эфиры, эфир-амиды и амиды гемцитабина, производные стеариновой кислоты (C₁₈:0) и эйкозановой кислоты (C₂₀: 0).

Согласно настоящему изобретению производные гемцитабина обычно получают по следующему уравнению реакции:

где Nu-YH означает гемцитабин, Y представляет собой кислород в 3' или 5' положении сахарного фрагмента, или азот в 4 положении пиримидинового фрагмента гемцитабина; Fa представляет собой ацильную группу мононенасыщенной C₁₈ или С₂₀ жирной кислоты, и Х представляет собой удаляемую группу, например Сl, Вr, 3-тиазолидин-2-тион или OR¹, где R¹ представляет собой Fa, СОСН₃, COEt или СОСF₃. Таким образом, реакция происходит посредством ацилирования нуклеозида. Это сопровождается использованием приемлемых реактивных производных жирных кислот, галоидангидридов или ангидридов кислоты.

Обычно необходимо присутствие акцептора протонов для поглощения кислого НХ, который выделяется реакцией. Поэтому может быть добавлено основание в реакционную смесь. Например, если используют голоидангидрид, такой как хлорангидрид, к реакционной смеси добавляют основание третичного амина, такое как триэтиламин, N,N-диметиланилин, пиридин или N,N-диметиламинпиридин, для связывания выделяемой галоидводородной кислоты. В других случаях, применяемый в реакции растворитель служит в качестве акцептора протонов.

Как правило, реакция ацилирования протекает без катализатора. В некоторых случаях реактивное производное жирной кислоты FaX может быть образована in situ в результате соединения реагентов, таких как N,N-дициклогексилкарбодиимид (ДСС), N-этил-N'-(3-диметиламинопропил)карбодиимид (ЕДС) или О-(1Н-бензотриазол-1-ил)-N,N,N',N'-тетраметилуроний тетрафторборат (TBTU).

Предпочтительно реакции проводят в нереактивном растворителе, таком как N, N-диметилформамид, или галоидированном углеводороде, таком как дихлорметан. При необходимости, любое из вышеупомянутых оснований третичного амина используют в качестве растворителя, следя за присутствием соответствующего избытка. В этом случае отдельный акцептор протонов не требуется. Предпочтительно реакцию поддерживают при температуре между 5^oС и 25^oС. После периода от 1 часа до 60 часов реакция по существу завершается. Результат реакции анализируют тонкослойной хроматографией (TLC=TCX) и соответствующей системы растворителей. После завершения реакции, что устанавливают с помощью ТСХ, продукт экстрагируют органическим растворителем и очищают хроматографией и/или перекристаллизацией из соответствующей системы растворителей. Так как в гемцитабине присутствуют больше одной гидроксильной группы и аминогруппа может быть получена смесью ацилированных соединений. При необходимости, индивидуальные моно- и мультиацилированные производные могут быть разделены с помощью, например, хроматографии, кристаллизации и крайне необходимой экстракции, и так далее.

Когда необходимо получить мультиацильное соединение формулы I, в котором R₁, и/или R₂, и/или R₃ представляют собой ту же самую ацильную группу, то предпочтительно применяют вышеупомянутый способ(ы), используя подходящий ацил-реагент(ы) в избытке.

Для получения мультиацильных соединений формулы I, в которых R₁, и/или R₂, и/или R₃ различаются, предпочтительно применяют вышеприведенные способы ступенчато при соответствующем отборе реагента. Также для проведения специфической реакции используют должным образом выбранные защищающие группы. Выбор этих способов представлен на схеме 1 (см. в конце текста). Используют любое сочетание способов для получения специфического продукта.

Следующие примеры иллюстрируют получение двух предпочтительных производных гемцитабина этого изобретения.

В примерах используют следующие сокращения:
DMF - диметилформамид (ДМФ)
NMR - ЯМР
d - дублет
br - широкий
S - синглет
t - триплет
m - мультиплет
Пример 1
Эфир элаидиновой кислоты (5')-гемцитабина
К раствору 2',2'-дифтордезоксирибофуранозилцитозина (гемцитабина) (0,42 г, 1,6 ммоль) в 30 мл ДМФ добавляют 0,81 мл ДМФ, содержащего 1,6 ммоль НСl (г) с последующим добавлением раствора хлорангидрида элаидиновой кислоты (0,51 г, 1,7 ммоль) в 3 мл ДМФ и реакционную смесь перемешивают при температуре окружающей среды в течение 12 часов. Растворитель выпаривают под высоким вакуумом, а неочищенный (сырой) продукт очищают на колонке с силикагелем 15% метанолом в хлороформе в качестве элюирующей системы. Неочищенные фракции повторно очищают, чтобы получить в итоге 0,25 г (30%) названного соединения.

¹H ЯМР (DMSO-d₆, 300 МГц) δ: 7,5 (1Н, д, ArH), 7,45 (2Н, шир.с, NH₂), 6,45 (1Н, д, -ОН), 6,17 (1Н, т, СН-1'), 5,8 (1Н, д, ArH), 5,35 (2Н, м, СН= СН), 4,4-4,05 (3Н, м, CH₂-5' и СН-4'), 3,95 (1Н, м, СН-3'), 2,35 (2Н, т, CH₂-COO), 1,95 (4Н, м, СН₂-СН= ), 1,55 (2Н, м, СН₂-С-СОО), 1,25 (20Н, м, СН₂), 0,85 (3Н, т, СН₃).

¹³С ЯМР (DMSO-d₆, 75 МГц) δ: 172,67 (COO), 165,63 (С-4), 154,51 (С-2), 141,12 (С-6), 130,08 и 130,03 (С-9"/С-10"), 126,09, 122,67 и 119,24 (т, С-2'), 94,86 (С-5), 83,90 (С-1'), 77,36 (С-4'), 70,41, 70,11 и 69,80 (т, С-3'), 62,53 (С-5'), 33,24, 31,95, 31,29, 29,00, 28,94, 28,84, 28,72, 28,50, 28,43, 28,33, 24,34, 22,11 (CH₂), 13,94 (СН₃).

Кроме того, небольшое количество эфира элаидиновой кислоты (3')-гемцитабина (0,05 г) выделяют из неочищенных фракций.

¹H ЯМР (DMSO-d₆, 300 МГц) δ: 7,65 (1H, д, АrН), 7,40 (2Н, д, NH₂), 6,25 (1H, т, СН-1'), 5,82 (1H, д, АrН), 5,4-5,2 (4Н, м, ОН-5'), СН=СН и СН-3'), 4,15 (1H, м, СН-4'), 3,85-3,55 (2Н, м, СН2-5'), 2,45 (2Н, т, СН₂-СОО), 1,95 (2Н, м, CH₂-C=), 1,55 (2Н, м, СН₂-С-СОО), 1,25 (20Н, м, CH₂), 0,85 (3Н, т, СН₃).

¹³С ЯМР (DMSO-d₆, 75 МГц) δ: 171,70 (COO), 165,69 (С-4), 154,46 (С-2), 141,30 (С-6), 130,10 и 130,03 (C-9"/C-10"), 125,17, 121,72 и 118,27 (т, С-2'), 94,78 (С-5), 83,78 (С-1'), 78,41 (С-4'), 69,93, 69,60 и 69,30 (т, С-3'), 59,15 (С-5'), 32,95, 31,93, 31,26, 28,98, 28,90, 28,81, 28,69, 28,46, 28,28, 28,23, 24,26, 22,09 (CH₂), 13,95 (СН₃).

Пример 2
Амид элаидиновой кислоты (N⁴)-гемцитабина
К раствору 2',2'-дифтордезоксирибофуранозилцитозина (гемцитабина) (0,38 г, 1,3 ммоль) в 5 мл пиридина добавляют хлорангидрид элаидиновой кислоты (0,57 г, 1,9 ммоль) и реакционную смесь перемешивают при температуре окружающей среды в течение 2,5 часов. Растворитель выпаривают под высоким вакуумом и неочищенный продукт очищают на колонке с силикагелем 15% метанолом в хлороформе в качестве элюирующей системы. Фракции, содержащие продукт, выпаривают и остаток обрабатывают эфир-гексаном в ультразвуковом устройстве. Кристаллический материал высушивают до получения 0,1 г (15%) названного соединения.

¹H ЯМР (DMSO-d₆, 300 МГц) δ: 10,95 (1H, с, NHCO), 8,25 (1H, д, ArH), 7,25 (1H, д, ArH), 6,30 (1H, д, -ОН), 6,15 (1H, т, СН-1'), 5,35 (2Н, м, СН= СН), 5,30 (1H, т, -ОН), 4,2 (1H, м, СН-4'), 3,9-3,6 (3Н, м, СН-3' и СН2-5'), 2,35 (2Н, т, CH₂-CON), 1,95 (2Н, м, СН₂-С=), 1,55 (2Н, м, СН₂-С-СОО), 1,25 (20Н, м, СН₂), 0,85 (3Н, т, СН₃).

¹³С ЯМР (DMSO-d₆, 75 МГц) δ: 174,06 (CONH), 162,89 (С-4), 154,22 (С-2), 144,69 (С-6), 130,04 (С-9"/С-10"), 122,94 (J_CF=259 Гц, С-2'), 95,91 (С-5), 84,11 (J_CF= 31 Гц, C-1'), 81,02 (С-4'), 68,35 (J_CF=22 Гц, C-3'), 58,76 (С-5'), 36,38, 31,94, 31,28, 28,99, 28,83, 28,71, 28,56, 28,48, 28,30, 24,34, 22,10 (CH₂), 13,94 (СН₃).

Предпочтительные производные гемцитабина этого изобретения имеют большее терапевтическое значение, чем сам гемцитабин. Это демонстрируют на двух моделях in vivo с как однократными, так и многократными дозами. При лечении однократной дозой воздействие производных оказывается лучшим или сравнимым с действием гемцитабина. Это особенно определенно проявляется для амидного производного, когда превосходный эффект получают с дозой, составляющей только 25% дозы гемцитабина.

При применении многократной дозы различия в действии производных гемцитабина и гемцитабина оказываются еще более поразительными. Это отражается как в увеличении периода доживания, так и в увеличении продолжительности жизни выживших. Другой важной характеристикой является токсичность, наблюдаемая при использовании самого гемцитабина как в высших, так и средних диапазонах многократной дозировки. Хотя эффект, полученный с низким нетоксичным диапазоном доз (1 мг/кг), считают хорошим, этот эффект превосходят как N⁴-амидные, так и 5'-эфирные производные. Гемцитабин оказывает оптимальное действие при концентрации в плазме приблизительно 20 мкМ, но более высокие концентрации, свыше 35 мкМ, ингибируют противораковый эффект, что обусловлено механизмом фосфорилирования. (Gandhi, Cellular Pharmacology of Gemcitabine in Gemcitabine: Rationales for Clinical Trial Design and Evaluation, Mini Symposium, 12.3.96, Vrije Universiteit Amsterdam). В отличие от этого предпочтительные производные гемцитабина создают оптимальные уровни (концентрации) в плазме гемцитабина в течение более длительного периода времени без достижения ингибиторных концентраций (>35 мкМ). Это происходит потому, что производные не подергаются фосфорилированию и, вероятно, не участвуют в механизме ингибирования также.

Главной проблемой лечения рака является развитие резистентности к терапии. Множественная резистентность к лекарственному средству (MDR) составляет одну из главных причин несостоятельности в других случаях эффективных лекарственных средств. Заявители обнаруживают, что предпочтительные производные этого изобретения как-то блокируют (MDR) и, следовательно, преодолевают эту проблему.

Поглощение клеткой нуклеозидов и нуклеозидных аналогов, таких как гемцитабин, осуществляется главным образом через избирательный рецептор нуклеозидного транспорта (NT=HT).

Модуляцию/ингибирование этого рецептора рассматривают как резистентность к лекарственному средству в клинической ситуации. Этот феномен наблюдают in vitro при добавлении ингибиторов НТ (нуклеозидного транспорта). В этом проекте выявляют, что на производные данного изобретения не оказывает влияние присутствие ингибиторов НТ, так как предпочтительные производные сохраняют цитостатическую активность в присутствии таких ингибиторов.

Период полураспада гемцитабина в плазме составляет приблизительно 10 минут вследствие быстрого его дезаминирования эндогенным ферментом - дезоксицитидиндезаминазой до соответствующего производного урацила (P. G. Johnston et al. Cancer Chromatography and Biological Response Modifiers, Annual 16, 1996, Chap.1, ed. Pinedo H.M. et al.).

Производные этого изобретения являются плохими субстратами для инактивирующего фермента и поэтому их период полураспада увеличивается. Следовательно, производные данного изобретения более подходят для системного или местного лечения злокачественных опухолей, чем сам гемцитабин.

Новые соединения этого изобретения не только вероятно полезны при лечении рака, но они также активны как противовирусные агенты.

БИОЛОГИЯ
Эксперимент
Цитотоксическую активность амида гемцитабин-N⁴-элаидиновой кислоты и эфира гемцитабин-5'-элаидиновой кислоты исследуют на 2 парах грызунов и линиях клеток опухолей человека, каждая из которых состоит из исходной (родительской) линии и сублинии или устойчивой, или перекрестно-устойчивой (резистентной) к гемцитабину.

Клеточные линии представляют собой линию А2780 опухоли яичников человека и сублинию AG6000, которая резистентна к гемцитабину и характеризуется недостаточностью дезоксицитидинкиназы, и линию С26А опухоли прямой кишки мыши и сублинию C26G с неизменной дезоксицитидинкиназой, но с 10-кратным снижением тимидинкиназы I. Цитотоксичность каждого соединения оценивают, наблюдая за непрерывной экспозицией лекарственного средства в течение 72 часов. Число клеток определяют посредством SRB-анализа и процент ингибирования роста рассчитывают для каждой опухолевой линии как величину IC₅₀, выраженную в мкМ, что составляет концентрацию соединения, дающую увеличение до 50% ингибирования роста по сравнению с контролем.

Результаты
Значение IC₅₀ цитотоксической активности гемцитабина, в мкМ, по сравнению с цитотоксической активностью амида гемцитабин-N⁴-элаидиновой кислоты и эфира гемцитабин-5'-элаидиновой кислоты представляют в табл. 1. Активность производных гемцитабина значительно выше, чем цитотоксическая активность гемцитабина в исследуемых клеточных линиях.

Цитотоксическую активность гемцитабина и эфира гемцитабин-5'-элаидиновой кислоты определяют в СЕМ-клетках (целлюлозно-мембранная клетка) с и без модификаторов нуклеозидного транспорта нитробензилтиоинозина (NBMPR) или персантина (пиридамола). Как видно из табл. 2, величина IC₅₀ для гемцитабина оказывается в два раза выше, чем IC₅₀ эфира гемцитабин-5'-элаидиновой кислоты. При добавлении ингибиторов НТ (нуклеозидного транспорта) происходит десятикратное повышение величины IC₅₀ для гемцитабина, в то время как IC₅₀ для эфира гемцитабин-5'-элаидиновой кислоты изменяется незначительно (1,3-1,5 раз увеличение). В случае "резистентности" предпочтительное производное оказывается в 15-20 раз более эффективным, чем исходное лекарственное средство.

Противоопухолевое действие амида гемцитабин-N⁴-элаидиновой кислоты или эфира гемцитабин-5'-элаидиновой кислоты исследуют in vivo на мышах с двумя различными типами опухолей как с однократной, так и многократной дозой.

Влияние амида гемцитабин-N⁴-элаидиновой кислоты или эфира гемцитабин-5'-элаидиновой кислоты на Со-26, инокулированную мышке внутриселезеночно
Самкам мышей Balb/c прививают Со-26 раковую опухоль прямой кишки в селезенку на 0 день. В этой модели опухоли развиваются, главным образом, в печени. Внутрибрюшинную обработку начинают с 1 дня. Исследуют действие однократной дозы соединения по сравнению с однократной дозой гемцитабина. Физиологический раствор используют в качестве контроля (см. табл. 3).

Среднее время доживания для животных, которые погибают, располагается в одной и той же области для исследуемых соединений. Амид гемцитабин-N⁴-элаидиновой кислоты превосходит эфир гемцитабин-5'-элаидиновой кислоты и гемцитабин с 5/8 оставшимися в живых животными при дозе только 25 мкг/кг по сравнению с дозой гемцитабина 100 мг/кг.

В параллельном эксперименте введение дозы повторяют в течение с 1 по 11 день (см. табл. 4).

В этом эксперименте результаты, полученные с амидом гемцитабин-N⁴-элаидиновой кислоты и низкой дозой эфира гемцитабин-5'-элаидиновой кислоты, оказываются лучше или одинаковыми с результатами, полученными с низкой дозой гемцитабина. Хотя высокая доза эфира гемцитабин-5'-элаидиновой кислоты проявляет некоторую токсичность, эта токсичность меньше, чем токсичность при высокой дозе самого гемцитабина.

Влияние однократных и многократных доз амида гемцитабин-N⁴-элаидиновой кислоты и эфира гемцитабин-5'-элаидиновой кислоты на Р-388 клетки, имплантированные внутрибрюшинно мышке
Самке мыши B6D2F1 внутрибрюшинно имплантируют клетки Р-388 лимфатического лейкоза мыши. Обработки начинают с 1 дня после имплантации клеток внутрибрюшинно. Средний период доживания, остающихся длительно в живых и токсическую смерть регистрируют после обработки однократной дозой и обработки многократной дозой в течение 5 дней, а также обработки многократной дозой в течение 10 дней. Обработка однократной дозой эфира гемцитабин-5'-элаидиновой кислоты эффективна в пролонгировании времени выживания и в длительно остающихся в живых по сравнению с такой же дозой гемцитабина.

Обработка однократной дозой приведена в табл. 5.

Обработка многократной дозой, дни 1-4, приведена в табл. 6.

При применении многократной дозы в течение 1-4 дней активность амида гемцитабин-N⁴-элаидиновой кислоты четко проявляется в отношении наблюдаемых длительно остающихся в живых и пролонгированного среднего периода доживания как при дозе 1 мг/кг, так и 4 мг/кг. В контрольной группе, обработанной гемцитабином в дозе 15 мг/кг, все животные погибают в результате токсичности.

Обработка многократной дозой, обработка в течение 1-11 дней, приведена в табл. 7.

Обработка в течение 10 дней увеличивает противоопухолевую активность по сравнению с более кратковременной обработкой. Токсичность гемцитабина, исходя из мг/кг, оказывается более высокой со смертностью 6/6 при дозе 4 мг/кг. Отмечают количество остающихся длительно в живых после обработки многократной дозой как амидом гемцитабин-N⁴-элаидиновой кислоты, так и эфиром гемцитабин-5'-элаидиновой кислоты, а также наблюдают значительно увеличенный период доживания как для амида гемцитабин-N⁴-элаидиновой кислоты, так и эфира гемцитабин-5'-элаидиновой кислоты.

Эфиры или амиды гемцитабина данного изобретения вводят системно или энтерально, или парентерально.

Для энтерального введения активные соединения данного изобретения представляют в виде, например, мягких или твердых желатиновых капсул, таблеток, гранул, мелких гранул или порошков, драже, сиропов, суспензий или растворов.

Для парентерального введения приемлемы композиции эфиров или амидов гемцитабина в виде растворов для инъекций или вливаний, суспензий или эмульсий.

Композиции содержат инертные или фармакодинамически активные добавки, хорошо известные специалистам в области приготовления лекарственных средств. Например, таблетки или гранулы содержат ряд связывающих агентов, наполнителей, эмульгирующих реагентов, носителей или разбавителей. Жидкие композиции существуют, например, в форме стерильного раствора.

В дополнение к активному ингредиенту капсулы содержат наполнитель или загуститель. К тому же, также присутствуют добавки, улучшающие вкус, как и вещества, обычно используемые в качестве консервирующих, стабилизирующих, сохраняющих влажность и эмульгирующих агентов, соли для изменения осмотического давления, буфера и другие добавки.

Дозу, в которой вводят композиции согласно данному изобретению, изменяют в соответствии с формой применения и способом применения, а также потребностью пациента. Обычно ежедневная доза для системной терапии для взрослого среднего (нормального) пациента составляет приблизительно 0,1-150 мг/кг веса тела/день, предпочтительно 1-40 мг/кг день. Для местного введения мази, например, содержат от 0,1 до 10% по весу фармацевтической композиции, особенно 0,5-5% по весу.

Если необходимо, фармацевтическая композиция, содержащая эфиры и амиды гемцитабина, содержит антиоксидант, например токоферол, N-метилтокофермин, бутиловый гидроцианизол, аскорбиновую кислоту или бутиловый гидрокситолуол.

Также предусматривают проведение комбинированной терапии, то есть терапии, при которой введение гемцитабинового эфира или амида данного изобретения осуществляют в сочетании с другими видами лечения, например хирургией, облучением и химиотерапией. Например, для предпочтительного лечения опухолей мозга применяют сочетание хирургического лечения и лечения гемцитабиновым эфиром или амидом этого изобретения посредством системного или местного введения.

Композиции производных жирных кислот гемцитабина (общая процедура).

Пример 3
Суспензия микрочастиц
Следующие эксципиенты и компоненты композиции предварительно смешивают с помощью биогомогенизатора при низкой скорости в течение 10 минут, мг/мл:
Производное гемцитабина - 50
Фосфолипон 90Н - 30
Маннит - 55
Твин 80 - 20
Дистиллированная вода - 900 г
Величину рН предварительной смеси во время гомогенизации доводят с помощью 1 н. NaOH от 5,1 от 7,5, и полученную предварительную смесь переносят в приемный сосуд микрофлюидизатора М-110ЕН. Микроожижение осуществляют при внешнем охлаждении в течение 110 проходов при внутреннем давлении 21000 фунтов/кв.дюйм (14,448•10⁴ кПа).

Аликвотами по 5 мл заполняют 20-мл стеклянные флаконы, неплотно закрывают, замораживают при температуре ниже -40^oС и лиофилизуют при следующих условиях:
- помещают замороженные образцы в лиофилизатор при -40^oС и выдерживают при этой температуре в течение 12 часов;
- поддерживают во время лиофилизации вакуум между 50 и 120 миллиторр;
- поднимают температуру хранения до 0^oС и выдерживают в течение 12 часов;
- поднимают температуру хранения до +20^oС и выдерживают в течение 32 часов.

Плотно закрытые флаконы стерилизуют (облучение дозой γ-лучей 2,0 Мрад).

Воссоздание лиофилизованного материала с 4,2 мл 5% маннита в воде дает 5 мл суспензии микрочастиц концентрации 50 мг/мл производного жирной кислоты гемцитабина.

Пример 4
Раствор липосом
Следующие эксципиенты и компоненты композиции предварительно смешивают с помощью биогомогенизатора при низкой скорости в течение 10 минут, мг/мл:
Производное гемцитабина - 15
Яичный лецитин - 100
Глицерин - 22
NaOH, 1M - 0,75
Олеат натрия - 1,7
Вода для инъекций - До 1,0 мл
Смесь гомогенизируют под высоким давлением в течение 10 минут, заполняют в стеклянные флаконы, плотно закрывают, стерилизуют в автоклаве. Это дает 15 мг/мл композиции липосом производного жирной кислоты гемцитабина.

Изобретение относится к производным гемцитабина формулы (I), где R₁, R₂, R₃ независимо выбирают из водорода и C₁₈ и С₂₀ насыщенных и мононенасыщенных ацильных групп, при условии, что R₁, R₂, R₃ не могут все быть водородом. Соединения по изобретению обладают противораковой активностью и могут входить в состав фармацевтической композиции с аналогичным назначением. Также предлагается способ получения производных гемцитабина, включающий взаимодействие гемцитабина с производным мононенасыщенной С₁₈ или С₂₀ жирной кислоты FaX, где Х представляет собой удаляемую группу, a Fa является ацильным остатком указанной кислоты. 3 с. и 8 з.п.ф-лы, 7 табл.

1. Производное гемцитабина, имеющее формулу (I)

где R₁, R₂ и R₃ независимо выбирают из водорода и С₁₈ и С₂₀ насыщенных и мононенасыщенных ацильных групп, при условии, что R₁, R₂ и R₃ - все не могут быть водородом. 2. Соединение по п. 1, в котором только один из R₁, R₂ и R₃ представляет собой ацильную группу. 3. Соединение по п. 2, в котором моноацильный заместитель находится в 3'-0 или 5'-0 положении сахарного фрагмента. 4. Соединение по п. 3, в котором моноацильный заместитель находится в 5'-0 положении сахарного фрагмента. 5. Соединение по любому предшествующему пункту, в котором R₁, R₂ и R₃ выбирают из олеоила, элаидоила, цис-эйкозеноила и транс-эйкозеноила. 6. Производное гемцитабина по п. 1, представляющее собой эфир элаидиновой кислоты (5')-гемцитабина. 7. Производное гемцитабина по п. 1, представляющее собой амид элаидиновой кислоты -(N⁴)-гeмцитaбинa. 8. Фармацевтическая композиция, обладающая противораковой активностью, содержащая эфир или амид гемцитабина по любому предшествующему пункту и фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель. 9. Эфир или амид гемцитабина по любому одному из пп. 1-7 для применения в качестве противоракового агента. 10. Эфир или амид гемцитабина по любому одному из пп. 1-7 для производства фармацевтической композиции, обладающей противораковой активностью. 11. Способ получения производного гемцитабина, определенного в п. 1, отличающийся тем, что осуществляют реакцию гемцитабина с соединением формулы
FaX,
где Fa представляет собой ацильную группу мононенасыщенной C₁₈ или С₂₀ жирной кислоты;
Х представляет собой удаляемую группу.