ДВУСЛОЙНЫЕ ПРЕПАРАТЫ Российский патент 2001 года по МПК A61K47/26 A61K47/44 A61K9/127 A61K9/50 

Изобретение относится к двуслойным препаратам липидов в полярных растворителях. Такие препараты применимы в качестве носителей активных веществ в фармацевтических композициях, а также при производстве пищевых, косметических и сельскохозяйственных продуктов.

Натуральные амфифильные липидные наполнители находят лишь ограниченное применение в производстве фармацевтической и косметической продукции. Причинами тому служат недостаток сырья, высокие производственные расходы, а также плохая наполняемость получаемого липидного материала.

Среди природных полярных липидов, способных к образованию бислоя, т.е. амфифильных липидов, чаще всего находят применение в фармацевтическом и косметическом производстве фосфолипиды. В связи со своей способностью образовывать двойной слой (бислой) такие полярные липиды могут использоваться для получения различного вида агрегатов и частиц, таких как везикулы и жидкие кристаллы, которые находят применение в различных областях техники.

Однако использование липидных гелей фосфолипидной природы ограничено только фармацевтической технологией, в основном, в связи с их недостаточной гелеобразуюцей способностью и слабой химической стабильностью. Фосфатидилхолин из яичного желтка или соевых бобов как наиболее часто используемый натуральный липид, образующий двойной слой (бислой), обладает лишь незначительной липофильностью для оптимального набухания в воде и образования гибких двойных слоев (бислоев), построенных из жидких кристаллических ламеллярных структур.

Поскольку липосомы представляют собой дисперсии бислойной или ламеллярной фаз в избытке водного раствора, способ использования ламеллярных фаз фосфолипидной природы через образование липосом не является оптимальным. Процедура набухания протекает медленно, и образование липосом и везикул из фосфолипидного материала в течение подходящего периода времени требует высоких затрат механической энергии.

Натуральные фосфолипиды, такие как фосфатидилхолин из яичного желтка, являются высоконенасыщенными веществами. А ненасыщенность ацильных цепей фосфолипида служит условием образования жидкой кристаллической ламеллярной фазы при комнатной температуре. Кроме того, это означает, что двуслойные мембраны, образуемые натуральными фосфолипидами, обладают высокой проницаемостью для водорастворимых лекарств, поскольку ацильные цепи находятся в неупорядоченном жидком состоянии. Липосомы, образованные из натуральных фосфолипидов, характеризуются низкой капсулирующей эффективностью в связи с протеканием включенного лекарственного средства через липосомные бислои. Обычно, если проводят включение лекарственных средств в натуральные фосфолипидные липосомы, их следует стабилизировать добавлением большого количества холестерина в количестве 30-50 мол.% от общего состава липидной композиции.

Все сказанное справедливо также в отношении иных активных веществ, не лекарств, которые также по различным соображениям могут включаться в липосомы или другие двуслойные структуры.

Везикулы и липосомы фосфолипидной природы имеют обычно очень короткое время жизни после введения их в ток крови.

Быстрое выведение из крови связано с поглощением их ретикуло-эндотелиальной системой (РЭС) печени и селезенки. Чтобы обойти это затруднение, липосомы следует стерически стабилизовать добавлением ганглиозидов, содержащих несколько углеводных единиц, или гидрофильных полимеров, таких как полиэтиленоксид или пуллулан. Последние агенты обычно связывают ковалентно с фосфатидилэтаноламином. В принципе такой подход является очень эффективным, поскольку модифицированные липосомы могут избежать поглощения РЭС. Однако практическая реализация этого способа сопряжена с недостатками как экономического характера, так и с точки зрения безопасности, связанными с необходимостью вносить в липосомную формулу дополнительные компоненты либо натуральные и редкие, что приводит к его удорожанию, либо синтетические, которые не всегда являются биологически совместимыми.

Использование фосфолипидов и других полярных липидов для получения жидких кристаллов и липосом хорошо известно.

Патент EP-B1-0126751 раскрывает композицию с контролируемым высвобождением, которая может включать амфифильное вещество, относящееся, в частности, к галактолипидам, фосфолипидам и моноглицеридам. Упомянутый патент относится к кубическим и обратимым гексагональным жидким кристаллическим фазам, стабильным при избытке водного раствора.

Другой патент (WO 91/11993) раскрывает спиртово-водную фосфолипидную композицию гелевого типа. Спирт представлен этанолом, 1-пропанолом или 2-пропанолом. Содержание фосфолипидов варьирует от 15 до 30 вес.%. Кроме того, в патенте раскрывается использование фосфолипидной композиции для приготовления липосом при разбавлении водным раствором, а также гельсодержащих препаратов местного действия.

Патент WO 91/04013 раскрывает гибридные низколамеллярные липидные везикулы, содержащие в липидных бислоях фосфо- или гликолипид и неионное, анионное или цвиттер-ионное поверхностно-активное вещество. К предпочтительным гликолипидам относятся цереброзиды, ганглиозиды и сульфатиды, каждое из которых принадлежит к семейству гликосфинголипидов.

Гликозилглицериды представляют собой вид гликолипидов, которые, как известно, входят в состав клеточных мембран растений. Наиболее распространены два таких типа, построенных на основе галактозы: моногалактозилдиацилглицерин - МГДГ (MGDG) и дигалактозилдиацилглицерин - ДГДГ (DGDG), которые составляют до 40% сухого веса тилакоидных мембран.

Растительные гликолипиды несут углеводные единицы, в основном галактозные, связанные с глицерином. В МГДГ 1-я позиция галактозного кольца соединяется β- связью с глицерином, а в ДГДГ между сахарами имеется α,1→6 связь. Минорная составляющая представлена растительным сульфолипидом, называемым более точно сульфохиновозилдиацилглицерином - СХДГ (SQDG), который содержит скорее сульфонатную, а не гидроксильную группу, которая связывается с 6-м атомом углерода терминирующего дезоксиглюкозного остатка. Большая часть растительных гликолипидов может быть описана основной формулой

где R₁ и R₂ независимо друг от друга являются насыщенными или ненасыщенными остатками жирной кислоты, содержащей 2-24 атома углерода и 0-6 двойных связей, этерифицированных оксикислотами, что дает эстолиды или водород; углевод представляет собой моносахаридную единицу; n = 1-5; и R₃ обозначает гидроксильную или сульфонатную группу.

В исследованиях взаимодействия гликозилглицеридов с водой и другими полярными растворителями авторы неожиданно обнаружили, что специфический гликолипидный материал из злаковых характеризуется такими особенностями, которые упрощают использование упомянутого материала в качестве носителя, в первую очередь в случае фармацевтических композиций, но также и для приготовления других препаратов, в частности, косметического, сельскохозяйственного, диетического и пищевого назначения.

Хорошо известно, что липиды злаковых могут взаимодействовать с водой в связи с наличием в них в относительно высокой пропорции полярных компонентов с образованием ламеллярной жидкой кристаллической фазы (G. Jayasinghe et al. , J. Disp. Sci. Technol., 1991, vol. 12, 443-451).

В документе SE 9400368-8 раскрывается промышленно применимый способ получения из растений, преимущественно из злаковых, гликолипидного материала, с применением экстракции и хроматографического разделения. Приготовленный таким образом гликолипидный материал может быть затем использован в качестве амфифильного материала в производстве фармацевтических средств, косметики и пищевой продукции.

Изобретение относится к двуслойному липидному препарату в полярном липидном растворителе, состоящем на 0.01-90 вес.%, предпочтительно на 0.1-50 вес. %, из образующего двойной слой (бислой) материала в полярном растворителе, который отличается тем, что упомянутый образующий двойной слой материал представляет собой галактолипидный материал из злаковых, состоящий по меньшей мере на 50% из дигалактозилдиацилглицеринов, а остаток заполнен другими полярными липидами.

В предпочтительном препарате галактолипидный материал состоит примерно на 70-80% из дигалактозилдиацилглицеринов, а на 20-30% из других полярных липидов.

В другом предпочтительном препарате галактолипидный материал состоит вплоть до 100% из дигалактозилдиацилглицеринов.

Дигалактозилдиацилглицерины могут быть описаны общей формулой

где R₁ и R₂ независимо друг от друга являются насыщенными или ненасыщенными остатками жирной кислоты, содержащей 10-22 атома углерода и 0-4 двойных связей или водород; и R₃ обозначает гидроксильную или сульфонатную группу.

В качестве предпочтительных жирнокислотных остатков, обозначаемых R₁ и R₂, можно упомянуть натуральные ацильные группы жирных кислот, такие, например, как остатки насыщенных пальмитиновой (C₁₅H₃₁CO; 16:0) и стеариновой кислот (C₁₇H₃₅CO; 18:0); мононенасыщенной олеиновой кислоты (C₁₇H₃₃CO; 18: 1); и полиненасыщенных линолевой (C₁₇H₃₁CO; 18: 2) и линоленовой кислот (C₁₇H₂₉CO; 18: 3). Остатки жирных кислот могут также включать оксикислоты, соединенные с глицериновой частью через гидроксильные группы, этерифицированные другими жирными кислотами, так называемые эстолиды.

Другие полярные липиды, входящие в состав галактолипидного материала, представляют собой смесь различных глико- и фосфолипидов, таких, как МГДГ и фосфатидилхолины. Состав их зависит от исходного материала и способа производства галактолипидов.

Конкретное соотношение компонентов в галактолипидном материале не является существенным для настоящего изобретения, поскольку содержание ДГДГ составляет не менее 50%. Однако при использовании в различных целях максимальный эффект достигается при высоком содержании ДГДГ как наиболее важного компонента, формирующего бислой.

Галактолипидный материал может быть проэкстрагирован практически из любого вида растительного материала. Предпочтительным растительным материалом являются семена и зерна из зерновых и злаковых, например из пшеницы, ржи, овса, кукурузы, риса, проса и кунжута. Овсяная крупа и пшеничная клейковина характеризуются высокой концентрацией липида и поэтому они очень хорошо подходят для настоящего способа получения. Дигалактозилдиацилглицерины в галактолипидном материале также могут, если это применимо, иметь синтетическое происхождение.

Галактолипидный материал может использоваться как полярный липидный компонент в различных упорядоченных растворах, где липид образует упорядоченные частицы, диспергированные в разбавленном, смешанном случайным образом растворе, включающем такие полярные растворители, как вода, этанол, глицерин и другие полярные растворители и их смеси. Молекулярная геометрия ДГДГ напоминает усеченный конус, что делает возможным образование гибких бислоев, представляющих собой в водных растворах в физиологических условиях ламеллярные жидкие кристаллические фазы и липосомы или везикулы.

Галактолипиды могут включать большое количество полярного растворителя, такого как вода, что сопровождается набуханием. Добавление воды к галактолипидам приводит к спонтанному образованию прозрачного вязкого геля. Гель состоит из ламеллярной жидкой кристаллической фазы - L_a, в которой липидные бислои чередуются с водой в ламеллярной структуре. L_a-фаза, легко выявляемая в поляризационном световом микроскопе, термодинамически стабильна.

Процесс набухания происходит относительно медленно в связи с высокой вязкостью ламеллярной жидкой кристаллической структуры геля; в течение 24 ч медленной агрегации можно приготовить прозрачные гомогенные образцы, содержащие всего 10 вес.% водного раствора. Сразу после своего формирования гель обладает чрезвычайно высокой стабильностью к химической и микробной деградации, что позволяет поддерживать его физическую целостность в течение длительного периода времени.

Чередующиеся слои галактозилацилглицеринов и полярного растворителя делают структуру геля пригодной для включения в него как липофильных, так и гидрофильных биологически активных веществ. Ламеллярная структура обладает относительно низкой вязкостью при высоких скоростях перемещения, что позволяет инъецировать гель с помощью шприца и тонкой иглы. Препарат может быть использован для введения лекарств в различные участки организма животного и человека.

Среди полярных растворителей предпочтение отдается биологически совместимым разрешенным для использования в фармацевтических, косметических и пищевых продуктах, таким как вода, этанол, 1-пропанол, 1,2-пропандиол, глицерин и их смеси.

В своем предпочтительном варианте изобретение относится к гелевым препаратам, включающим 25-90 вес. % галактолипидного материала в полярном растворителе.

Гели могут быть легко приготовлены при добавлении полярного растворителя, такого как вода или водный раствор, к сухому галактолипидному материалу с достижением окончательной липидной концентрации в диапазоне 25-90 вес. %. Смеси оставляют для набухания в течение 1-24 ч при комнатной температуре при несильном перемешивании в соответствующем контейнере, т.е. либо в стеклянной колбе, либо в открытом химическом стакане. Гели могут быть приготовлены в стеклянных пробирках при перемешивании палочкой и дальнейшем центрифугировании при комнатной температуре.

Гели являются псевдопластиками и характеризуются замечательной стабильностью в отношении своего физического вида и устойчивостью к действию микробов. Вязкости таких гелей незначительно подвергаются влиянию умеренных изменений температуры, поэтому, они могут быть перенесены непосредственно из холодильника в шприц или другое устройство для введения препарата.

Далее показано, что гели настоящего изобретения могут действовать как среда, замедляющая высвобождение активного ингредиента, причем более эффективно, чем гели, полученные на основе фосфолипидов.

Показано, кроме того, что гели настоящего изобретения могут включать в себя широкий спектр терапевтически активных компонентов, в том числе липофильные компоненты, гидрохлориды, нитраты, амфифилы, белки и пептиды.

В соответствии с другим предпочтительным вариантом это изобретение относится к липосомальному препарату, содержащему 0.01-25 вес.% галактолипидного материала в полярном растворителе.

Выгодной особенностью, свойственной галактозилацилглицеринам, является наличие галактозных единиц, включающих полярную головную группу в каждой липидной молекуле, которая способна стерически стабилизировать липосомы, обеспечивая таким образом продолжительное время их жизни в кровяном русле.

Липосомы в виде многослойных везикул получают посредством прямой гидратации. К сухому галактолипидному материалу добавляют полярный растворитель, такой как вода или водный раствор, что приводит к достижению конечных концентраций липида в диапазоне 0.01-25 вес.%. Смеси оставляют для набухания и уравновешивания при комнатной температуре при несильном перемешивании в течение 1-24 ч, получая в результате липосомальную дисперсию. Липосомы могут быть также приготовлены при добавлении избытка полярного растворителя к гелю, полученному в соответствии с вышеизложенным, т.е. просто при разбавлении геля.

Однослойные везикулы получают дисперсией многослойных везикул, т.е. с помощью экструзии через мембраны или гомогенизации под высоким давлением.

Необычная и неожиданная способность галактолипидного материала к набуханию позволяет очень легко готовить на его основе липосомальные дисперсии и водные гели. Так, например, возможность спонтанного образования в воде липосом неожиданно оказалась весьма полезной для приготовления липосомальных дисперсий даже в крупных масштабах. Эта процедура заметно отличается от тех, которые необходимы для образования липосом из фосфолипидов, где используются органические растворители, такие как хлороформ, эфир, этанол или их комбинация. Хорошо известны проблемы, возникающие при перенесении обычной процедуры получения липосомальных препаратов в крупномасштабное производство, для решения которых разрабатывалось множество вариантов. Настоящее изобретение предлагает простой и воспроизводимый способ получения липосомальных дисперсий, важность которого особенно возрастает при практическом применении липосом, например в качестве носителей при изготовлении лекарственных средств.

Было показано, что липосомы настоящего изобретения характеризуются неожиданно высокой инкапсулирующей эффективностью.

Кроме того, было показано, что липосомы настоящего изобретения обладают удивительной ярко выраженной способностью увеличивать время жизни активного ингредиента даже в том случае, если везикулы создавались в растворе этих компонентов, и, таким образом, только часть упомянутых компонентов инкапсулируeтся в везикулы.

Было показано далее, что липосомы настоящего изобретения снижают токсичность мощного противоракового препарата без снижения его фармакологического эффекта.

Липосомы настоящего изобретения обладают биоадгезивным свойством и могут в этой связи быть полезными для решения проблемы адекватной доступности включенного активного компонента к определенным биологическим поверхностям, таким как роговица и слизистая оболочка.

Липосомы настоящего изобретения могут заключать в себя активные компоненты в очень широком диапазоне, в том числе липофильные компоненты, гидрохлориды, нитраты, амфифилы, белки, пептиды и др.

В соответствии с настоящим изобретением могут использоваться синтетические дигликозилдиацилглицерины, полученные на основе галактозы или любой другой моносахаридной единицы, такой как глюкоза, а также натуральные гликозилглицериды, которые могут быть выделены из любых источников и основаны на других углеводных единицах, отличных от галактозы, например на глюкозе.

Галактолипидный материал
Галактолипидный материал получают из различных злаковых культур по приведенному ниже способу и используют далее для приготовления препаратов и фармацевтических композиций настоящего изобретения, как это показано в примерах. В описании % обозначает весовой %, если особо не оговорено иное. Пропорция растворителей в смесях растворителей указывается в объемных частях.

Галактолипидный материал из овса
200 кг овсяного зерна (Kungsornen AB, Швеция) размалывают и экстрагируют с помощью 1000 л 95%-ного этанола при температуре 70^oC в течение 3 ч в экстракторе при перемешивании. Шлам центрифугируют в теплом состоянии и отделяют от твердых частиц. Жидкую фракцию выпаривают при температуре 60^oC, получая около 10 кг светло-коричневого масла.

Масло наносят на колонку из нержавеющей стали с 6.25 кг силикагеля [Матрекс Силика Si (Matrex Silica Si), размер частиц 20-45 мм, размер пор 60 , получен от Амикон Корп., США]. Температура колонки составляет 50^oC. Затем для удаления всех неполярных липидов колонку промывают 30 л смеси гексан: изопропанол, 90:10.

Галактолипидный материал элюируют с колонки с помощью 20 л смеси гексан: изопропанол, 60: 40 с получением дигалактозилдиацилглицериновой фракции. Выпаривание этой фракции дает примерно 700 г ДГДГ - основного класса липидов. Затем галактолипидный материал диспергируют в воде и подвергают лиофильной сушке, получая непылящий порошок.

Обогащение ДГДГ из галактолипидов
50 г галактолипидов, полученных из овса, как описано выше, которые имеют содержание ДГДГ около 70%, растворяют в 250 мл смеси гексана:изопропанола, 70: 30, до конечного объема 300 мл. Полученный раствор вносят на колонку с силикагелем (110 г) и элюируют менее полярные составляющие 1 л смеси гексана: изопропанола, 70: 30. Обогащенную ДГДГ фракцию элюируют 2 л ацетона. Ацетоновую фракцию выпаривают и высушивают при температуре ниже 0^oC. Получают 17 г практически чистого ДГДГ продукта.

Гидрогенизация галактолипидов
200 г галактолипидной смеси, полученной из овса описанным выше методом, растворяют в 2 л теплого изопропанола. На дно находящегося под давлением реактора [модель N 4552М; Парр Инструментc Ко., США (Parr Instruments Co.)], снабженного двумя ручками на лопастях мешалки, помещают 15 г катализатора палладия на угле [Pd 15%, влажность 53%, Энгельгардт, Рим, Италия (Engelhardt Rome s.r.i.)]. После этого раствор переносят в герметично закрытый реактор, в котором создана атмосфера азота, для снижения опасности возгорания. Реакционный сосуд герметично закрывают и вначале трижды пропускают под давлением азот для удаления остатков воздуха, а затем также трижды под давлением пропускают водород [Плас 4.5, от АГА Газ АБ, Швеция (Plus 4.5, AGA Gas AB)]. Давление водорода поддерживают на уровне 6 бар, мешалку ставят на отметку 600 об/мин и нагревают смесь до температуры 70^oC. Требуется 14 мин для того, чтобы реакционная смесь приняла нужную температуру. Процесс гидрогенизации проводят в течение 6 ч, после чего реакционный продукт фильтруют через фильтр с размером пор 0.45 мкм для удаления частиц угля и палладия. Растворитель выпаривают в роторном испарителе, остаточный материал диспергируют в 1600 мл деионизированной воды и лиофильно высушивают.

Выход гидрогенизированных галактолипидов после фильтрации и лиофильной сушки составляет 155 г. Процесс гидрогенизации отслеживают с помощью газовой хроматографии; в гидрогенизированном продукте обнаруживаются только насыщенные жирные кислоты.

Галактолипиды из клейковины пшеницы
1 кг порошка пшеничной клейковины [АБ Сканебраннерир Швеция] экстрагируют 4 л 95%-ного этанола в химическом стакане при температуре 70^oC в течение 3 ч. Затем под давлением 400-500 кПа отфильтровывают шламм, а отфильтрованный жмых промывают 1 л теплого 95%-ного этанола. Объединенные этанольные фракции выпаривают при температуре максимум 60^oC с получением 60 г масла желтого цвета.

Масло наносят на колонку из нержавеющей стали, содержащую 45 г силикагеля [Матрекс Силика Si (Matrex Silica Si), размер частиц 20-45 мкм, размер пор 60 , получен от Амикон Корп., США]. Затем колонку промывают 700 мл смеси гексан:изопропанол, 90:10, для удаления нейтральных липидов.

Для удаления МГДГ и ряда других полярных липидов колонку последовательно промывают 1000 мл смеси гексан:изопропанол, 70:30. Элюцию ДГДГ осуществляют с помощью 1000 мл чистого ацетона. После выпаривания получают примерно 4 г практически чистого продукта ДГДГ.

Галактолипиды из ржи
100 г ржаных хлопьев [Кунгсëрнен АБ (Kungsörnen AB), Швеция] перемешивают в течение 60 мин в смеси промышленного гексана и изопропанола, 90:10. Шламм отфильтровывают и выпаривают с получением 0.5 г полярных липидов. Остаток, растворенный в 10 мл смеси гексана и изопропанола, 70:30, вносят на серию трех колонок с силикагелем [Сеп-пак Силика плас (Seppak Silica plus) Миллипор Корп., США], промывают 20 мл той же смеси растворителей и элюируют 15 мл ацетона. Элюат выпаривают и лиофильно сушат, получая 47 мг галактолипидов.

Химические и физические характеристики различных галактолипидных материалов
Анализ на принадлежность к липидному классу
Анализ на принадлежность к липидному классу проводят с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии - ВЭЖХ, используя колонку, наполненную силикагелем, модифицированную с помощью диола (ЛИКросфер 100 ДИОЛ, 5 мкм, 250 х 4 мм - внутр. диам., Е. Мерк, Германия). Колонку помещают в водяную баню с температурой 75^oC. Аналитическая система состоит из насоса ВЭЖХ СМ 4000 [LDC/Милтон Рой (LDC/Milton Roy), США] и инжектора, модель 7125, снабженного инъекционной петлей размером 20 мкм [Реодин Инк. (Rheodyne Inc.), США] . Используют испарительный светорассеивающий детектор Седекс 45 (Sedex, S.E.D.E.R.E, Франция), снабженный камерой для распыления Седекс 55, установленной на показания температуры и давления воздуха на входе в пределах соответственно 97^oC и 2.0 бар.

В ходе анализа скорость протекания движущейся фазы составляет 1 мл/мин. Градиент бинарного растворителя поддерживается линейным в течение 25 мин, затем его меняют, начиная со 100% A и кончая 100% Б, где А = гексан:изопропанол: н-бутанол: тетрагидрофуран: изооктан: вода, 64:20:6:4.5:4.5:1, а Б = изопропанол: н-бутанол: тетрагидрофуран: изооктан:вода, 75:6:4.5:4.5:10. Все растворители содержат ацетат аммония, 180 мг/л.

Сбор и обработка данных были выполнены на системе ГинкоСофт Дата (GynkoSoft Data), версия 4.22 (Софтрон ГмбХ, Германия). В типичном случае инъецируемое количество составляет 100 мкг. Идентификация основана на сравнении времени удерживания исследуемого образца со стандартными препаратами [Карлсхамнс ЛипидТекник АБ (Karlshamns LipidTeknik АВ), Швеция]. Эта система не обнаруживает летучие компоненты. Количественное определение проводят на основании вычисления площади пика.

Зета-потенциалы определяют в разбавленных водных дисперсиях галактолипида с помощью прибора Зетасайзер 4, производимого Малверн Инструментc Лтд., Великобритания (Zetasizer 4, Malvern Instruments Ltd.).

В табл. 1, как и в табл. 2, использованы следующие сокращения:
о-ГЛ = галактолипиды из овса;
о-г-ГЛ = гидрогенизированные галактолипиды из овса;
о-ДГДГ = обогащенные галактолипиды из овса;
п-ГЛ = галактолипиды из пшеницы;
п-ДГДГ = обогащенные галактолипиды из пшеницы;
р-ГЛ = галактолипиды из ржи.

Анализ жирных кислот
Определение профиля жирных кислот было проведено с помощью газового хроматографа после переэтерификации липидов в метильные эфиры жирных кислот. Указанные эфиры отделяют и анализируют количественно на газовом хроматографе с капиллярной колонкой Вариан 3500 (Varian 3500 Capillary Gas Chromatograph) с использованием в данном случае капиллярной колонки 30 х 0.25 мм - внутр. диам. (DB-WAX, J& W Scientific, США), колоночного инжектора и пламенно-ионизационного детектора. В качестве газа-носителя использовался гелий. Вычисление проводят с помощью системы ГинкоСофт Дата, версия 4.22 (Софтрон ГмбХ, Германия). Переэтерификацию осуществляют при добавлении 1 мг липидного образца к 2 мл смеси диметиловый карбонат:изооктан, 1:1. Добавляют 1 мл раствора, содержащего 2.3 г натрия, растворенного в 200 мл этанола и энергично перемешивают тестируемые пробирки в течение 30 с, оставляя их затем при комнатной температуре на 15 мин для завершения реакции. Добавляют 3 мл воды, перемешивают пробирки с исследуемым соединением, после чего проводят центрифугирование при 2 х g. С соблюдением указанных ниже условий, необходимых для разделения, в хроматограф инъецируют 0.5 мкл органического слоя. Термостатирующее устройство колонки запрограммировано на следующий температурный режим: начальная температура 130^oC (2 мин), в течение следующих 10 мин повышение температуры до 150^oC (со скоростью 30^oC/мин) и до 220^oC (со скоростью 3.2^oC/мин). Температура инжектора составляет 130^oC, а температура детектора составляет 250^oC. Исходный поток газа имеет скорость 2.7 мл/мин. Полученные результаты выражают в виде нормализованных весовых процентов с использованием метода внешнего стандарта. Относительно минорных компонентов, для которых стандарты либо недоступны, либо недостаточно чисты, факторы коррекции отсутствуют.

ЯМР-спектроскопия дигалактозилдиацилглицеринов
На спектрометре Брукер АМ-400 (Bruker АМ-400, от Bruker Analytische Messtechnik GmbH, Германия) записывают одномерный спектр протонного расщепления методом ЯМР для определения естественного распространения ¹³C, при частоте ¹³C, равной 100.614 МГц. Угол подачи импульса составляет 36^o, интервал между повтором импульса равен 1.0 с, а разрешение составляет 1.526 Гц на данную точку. В ходе анализа применяют линию расширения в 3 Гц. Образцы (10-40 мг) разбавляют смесью 730 мкл ДМСО-d₆ [Олдрич Кемикал Корп. (Aldrich Chemical Corp., Inc.), США] и 20 мкл D₂O [Олдрич Кемикал Корп. (Aldrich Chemical Corp., Inc.), США] и переносят в пробирку (внутр. диам. 5 мм) для проведения анализа методом ЯМР (табл. 3).

Примеры
Пример 1
Получение водного геля
Галактолипидный материал, полученный из овса, смешивают с различными количествами воды для того, чтобы определить набухаемость в воде. Водно-липидные образцы готовят в весовых частях в стеклянных пробирках. Образцы попеременно перемешивают палочкой и центрифугируют при комнатной температуре до образования полностью гомогенных систем. После выдерживания при комнатной температуре в течение шести месяцев проводят физическое исследование образцов. Ламеллярную жидкую кристаллическую фазу определяют с помощью световой поляризационной микроскопии. Результаты представлены в табл. 4.

Приведенные данные показывают, что при содержании галактолипида около 25% и выше образуется однофазный гомогенный гель.

Пример 2
Вязкие свойства водного геля
По методике примера 1 готовят галактолипидный гель, содержащий 55% воды. Измерения вязкости проводят с помощью реометра Боглин ФОР (Bohlin VOR Reologi АВ, Швеция), снабженного концентрическим цилиндром (C14; вращающий элемент: 91 г/см) при различных скоростях сдвига и температурах. Вязкость измеряют через 24 ч после изготовления. Значения вязкости стационарного потока (в Па•с) приведены в табл. 5.

Был сделан вывод о том, что образец является разжижаемым под действием сдвига веществом (псевдопластиком), т.е. его вязкость зависит от скорости сдвига, что демонстрирует реологическое поведение, характерное для ламеллярных жидких кристаллических фаз. Кроме того, увеличение температуры приводит лишь к незначительному снижению вязкости, что указывает на отсутствие фазовых переходов в исследованном температурном диапазоне. После выдерживания геля при комнатной температуре в течение 18 месяцев провели его визуальное обследование. Не отмечался микробный рост. Физический вид при стоянии не претерпел изменений, что удивительно, поскольку не было предпринято каких-либо предосторожностей, связанных с температурой хранения, добавлением антиоксидантов, консервантов и т.д.

Приведенные данные демонстрируют превосходную стабильность галактолипидного материала даже в водном окружении, способном вызвать, например, гидролиз ацильных цепей или микробную деградацию.

Пример 3
Тестирование высвобождения
In vitro на галактолипидном и фосфолипидном гелях, содержащих в исходном состоянии 60% липида и 50 мМ водорастворимого красителя метиленового синего, определяют высвобождение упомянутого красителя. Галактолипидный материал получают из овса. Фосфолипидный материал представляет собой хроматографически очищенный фосфатидилхолин из соевых бобов (s-PC; Карлсхамнс ЛипидТекник АБ, Швеция). Диффузионная среда представляет собой профильтрованную через мембрану воду, уравновешенную при 37^oC. Диффузионная ячейка состоит из мембранной трубки, выполненной из регенерированной целлюлозы (Спектра/Пор; отрезки с молекулярным весом 6000 - 8000; ширина среза 1.0 см), которая содержит около 2.5 г геля. Трубки погружают в термостатируемый стакан (внутр. диам. 10 см), содержащий 250 г среды при фиксации его положения на расстоянии 3 см от дна. Стакан помещают на магнитную мешалку со скоростью вращения 200 об/мин. В определенные моменты времени отбирают аликвоты среды и исследуют их на спектрофотометре при длине волны 665 нм. В качестве стандарта промеряют также высвобождение метиленового синего из целлюлозной трубки, содержащей 50 мМ водного раствора метиленового синего.

По прошествии 2.5 ч не было отмечено заметного высвобождения красителя из галактолипидного геля, тогда как из s-PC геля высвободилось 1.3%. Через 5 ч галактолипидный гель высвободил только 0.13% содержащегося в нем красителя, что было примерно в 12 раз ниже, чем соответствующий показатель для s-PC геля.

Приведенные результаты показывают, что для галактолипидного препарата характерно медленное высвобождение биологически активного материала в случае введения его in vivo, и в этой связи он может использоваться как препарат, создающий в организме депо.

Пример 4
Тест на высвобождение
На галактолипидном геле, изначально содержащем 60% липидов, 15% ремоксиприда гидрохлорида и 25% воды in vitro проводят тест на высвобождение водорастворимого лекарственного средства - гидрохлорида ремоксиприда моногидрата (Астра АБ, Швеция).

Роль диффузной среды выполняет фосфатный буфер (pH 7.4; ионная сила 0.05 М), уравновешенный при температуре 37^oC. Диффузионная ячейка состоит из мембранной трубки, выполненной из регенерированной целлюлозы (Спектра/Пор 3; молекулярный вес отрезка 3.500; ширина среза 1.0 см; длина 4 см), которая содержит около 1 мл геля. Трубку закрывают с обоих концов зажимами и помещают на дно термостатируемой бани для растворения (Сотакс AT 6; внутр. диам. 10 см), содержащей 600 мл фосфатного буфера. Буферный раствор перемешивают с помощью лопастной мешалки со скоростью 50 об/мин. В заданное время отбирают образец для анализа объемом 1 мл. Отобранный образец замещают 1 мл буфера. Концентрацию ремоксиприда определяют посредством жидкостной хроматографии с обращением фаз с использованием колонки м-Бондапак C18 (m-Bondapak C18). Используемый элюент представляет собой смесь фосфатного буфера, pH 1.8 и ацетонитрила, 4: 1. Используют спектрофотометрический детектор, а измерение проводят при длине волны 254 нм.

Гель давал возможность поддерживать удивительно низкий уровень высвобождения включенного лекарственного средства. Через 2 ч из галактолипидного геля высвободилось менее 2% включенного лекарственного средства. И примерно около 3% высвободилось через 4 ч.

Полученные данные позволяют предположить, что галактолипидная формула пригодна для парентерального использования с целью создания в организме депо биологически активного материала с последующим длительным его высвобождением, как это было показано на примере ремоксиприда гидрохлорида.

Пример 5
Образование липосом
Липосомы в виде многослойных везикул получают и исследуют следующим образом. К галактолипидам из овса добавляют воду с получением конечной концентрации 1.0 и 10.0% липида. Образцы уравновешивают при комнатной температуре в течение 24 ч при несильном перемешивании с получением липосомальных дисперсий.

Для получения липосом в виде однослойных везикул часть дисперсии переносят в стеклянную пробирку и разрушают в атмосфере азота при температуре 0^oC с помощью ультразвукового дезинтегратора [XL-2020; Хит Системз Инк. (XL-2020; Heat Systems Inc.), США], снабженного устройством с наконечником для отбора микропроб. Применяют следующий режим работы: контроль выхода 3.5; время обработки 3 х 2 мин, импульсный режим 2 х 4 мин.

Распределение полученных липосомальных дисперсий по размерам частиц определяют с помощью динамического светорассеяния [Затасайзер 4, Малверн Инструментc (Zetasizer 4, Malvern Instruments), Великобритания] под углом 90^o и при комнатной температуре, с использованием калиброванной ячейки ZET5110 путем мультимодального анализа. Были получены следующие результаты, которые представлены в виде средних значений Z в табл. 6.

С помощью оптического микроскопа [40-100x, Олимпус CH-2 (40-100x, Olympus CH-2)] исследуют полученные дисперсии до и после озвучивания. Небольшое количество липосомальной дисперсии помещают на предметное стекло. Затем рассматривают образец между скрещивающимися поляризаторами. Обнаруживаются только неозвученные липосомы, которые имеют характерную форму мальтийских крестов. Способность галактолипидов образовывать везикулы была подтверждена также при просвечивающей электронной микроскопии замороженных изломов.

Приведенные данные демонстрируют превосходную способность галактолипидов образовывать многослойные везикулы с использованием простого метода направленной гидратации и без добавления летучих органических растворителей или сопутствующих поверхностно-активных веществ. Небольшие однослойные везикулы легко образуются затем при ультразвуковой дезинтеграции с соблюдением описанных выше условий или с применением традиционных методов, таких как экструзия через поликарбонатную мембрану.

Пример 6
Эффективность инкапсуляции
Изучается эффективность инкапсуляции красителя, включаемого в везикулы галактолипидного материала, полученного из овса. Галактолипидный материал подвергают направленной гидратации в 20 мМ водного раствора флуоресцеина при концентрации 4.8%. Дисперсию оставляют для набухания при комнатной температуре в течение 24 ч.

Нагруженные красителем везикулы отделяют от невключенного красителя гель-фильтрацией на колонке с Сефадексом G 50 (высота 60 см, внутр. диам. 1.5 см) при комнатной температуре. В качестве элюента используют ЭДТА-буфер (1 мМ ЭДТА, 5 мМ Трис, 150 мМ NaCl), доведенный до pH 7.4. Концентрированную липосомальную дисперсию, загруженную красителем, наносят на колонку, затем вносят забуференный раствор ЭДТА. Колоночный элюент постоянно отслеживают на поглощение при длине волны 240 нм с помощью УФ-спектрофотометра, снабженного микроячейкой и самописцем, и далее собирают фракции на автоматическом коллекторе. Две фракции - загруженные красителем везикулы и раствор непоглощенного красителя - собирают отдельно и доводят до определенного объема. Спектрофотометрически при длине волны 258.2 нм определяют концентрации красителя и вычисляют на основании этих данных величины поглощенного объема и эффективность инкапсуляции. Были получены следующие результаты: поглощенный объем составляет 2.1 мкл/мг липида, а эффективность инкапсуляции равна 11%. Размер частиц составляет на основании проведенного определения 509 нм (среднее значение Z).

Прямая гидратация галактолипидов приводит к образованию многослойных везикул, как это было показано в примере 5. Вышеприведенные данные указывают на то, что описываемые частицы характеризуются гораздо более высоким значением поглощенного объема и эффективности инкапсуляции, чем традиционные везикулы, основанные на фосфолипидах, которые, как следует из сообщений, имеют величину поглощенного объема около 0.5 мкл/мг липида.

Метод прямой гидратации, применяемый для получения многослойных везикул, технически прост и быстр и поэтому пригоден для применения в промышленности. При использовании в этом методе галактолипидного материала можно достигнуть еще больших значений поглощенного объема, что свидетельствует о значительно более высокой эффективности инкапсуляции, которая ранее при использовании фосфолипидов для получения многослойных везикул была низкой, что рассматривалось как основной недостаток метода.

Пример 7
Образование водных дисперсий
Для тестирования набухаемости в воде обогащенный галактолипидный материал ДГДГ из овса смешивают с водой. Водно-липидные образцы готовят по методу, приведенному в примере 1. Полученные результаты суммированы в табл. 7.

Как и в случае необогащенного материала, набухаемость в воде обогащенного материала была очень хорошей, при этом легко получались гомогенные дисперсии.

Пример 8
Образование водных дисперсий
Гидрогенизированный галактолипидный материал из овса смешивают с водой для определения набухаемости его в воде. Водно-липидные образцы получают по методу примера 1 (табл. 8).

Как и в случае негидрогенизированного материала, набухаемость в воде гидрогенизированного материала была чрезвычайно хорошей. Указанный материал содержит только остатки насыщенных жирных кислот, что определяет возможность создания высокоупорядоченной кристаллической структуры как в сухом состоянии, так и в присутствии воды. На основании данных дифференциальной сканирующей калориметрии показано, что точка плавления цепи в гидрогенизированном материале, имеющем вид дисперсии в воде, составляет около 55^oC. Соответствующее значение для негидрогенизированного материала находится достаточно ниже 0^oC.

Пример 9
Приготовление вязкой неводной дисперсии
Вязкие дисперсии получают в соответствии со следующими прописями
Ингредиент - %
Галактолипиды - 10.0
Глицерин, 99% - 90.0
Ингредиент - %
Галактолипиды - 20.0
Глицерин, 99% - 80.0
Галактолипиды, полученные из овса, и глицерин поочередно перемешивают палочкой и центрифугируют при комнатной температуре до образования очень вязких, гомогенных и явно изотропных жидкостей. Оба вида жидкостей состоят из дисперсии ламеллярной фазы в глицерине, т.е. многослойных везикул, как показывает исследование их строения в световом поляризационном микроскопе. После выдерживания образцов в течение одного года при комнатной температуре проводят их физическое исследование. Независимо от концентрации галактолипида не обнаруживается никакого осадка, что указывает на наличие стабилизирующего эффекта глицерина на дисперсию везикул.

Пример 10
Приготовление неводного препарата для использования с целью улучшения состояния слизистой
Агенты, содержащие сульфгидрильные группы, такие как DL-цистеин и N-ацетил-L-цистеин, могут стимулировать лечение и предупреждать возникновение рецидивов дуоденальных язв у людей. Язвы желудка могут быть вызваны ишемией и вредными веществами, такими как этанол и ацетилсалициловая кислота, которые поражают и удаляют слизистую двенадцатиперстной кишки.

Готовят препарат с использованием следующих ингредиентов:
Ингредиент - %
Галактолипиды из овса - 10.0
N-ацетил-L-цистеин - 10.0
Глицерин, 99% - 80.0
N-ацетил-L-цистеин растворяют в глицерине при несильном перемешивании и нагревании примерно до 60^oC в открытом химическом стакане. После этого добавляют галактолипидный материал, а полученную отчетливо прозрачную жидкость переносят в стеклянный контейнер с пластиковой крышкой. Препарат, представляющий собой, как показало его исследование в световом поляризационном микроскопе, дисперсию хранят в холодильнике в течение более 6 месяцев.

В качестве растворителя был выбран глицерин в связи с тем, что вещества, содержащие сульфгидрильные группы, такие как, например, N-ацетил-L-цистеин, нестабильны в водном растворе и могут быть трансформированы в вещества, которые не оказывают фармакологического воздействия на слизистую.

Галактолипидный материал полезен сам по себе, поскольку, как было показано в исследованиях in vivo на крысах, он оказывает защитное воздействие на слизистую желудка.

По методам, приведенным ниже в примерах 11-14, были приготовлены различные местные препараты с противовоспалительным средством - гидрокортизоном. Галактолипидный материал получают из овса. Все композиции оказываются стабильными при хранении более 2 месяцев при комнатной температуре.

Пример 11
Ингредиент - %
Галактолипиды - 10.3
Гидрокортизон - 1.0
Вода - 88.7
Гидрокортизон и галактолипиды тщательно перемешивают с помощью вихревого миксера. После добавления воды препарат подвергают вихревому перемешиванию, центрифугируют и осторожно нагревают до получения тонкой молочной дисперсии.

Пример 12
Ингредиент - %
Галактолипиды - 22.1
Гидрокортизон - 1.2
1-пропанол - 16.1
Вода - 60.6
Гидрокортизон растворяют в 1-пропаноле при слабом нагревании и перемешивании. После добавления воды и галактолипидов смесь подвергают вихревому перемешиванию, центрифугируют и осторожно нагревают до получения непрозрачного очень вязкого геля.

Пример 13
Ингредиент - %
Галактолипиды - 18.9
Гидрокортизон - 0.8
1,2-пропандиол - 26.3
Вода - 54.0
Гидрокортизон растворяют в 1,2-пропандиоле при несильном нагревании и перемешивании. После добавления воды и галактолипидного материала смесь подвергают вихревому перемешиванию, центрифугируют и слегка нагревают до получения желтоватого почти прозрачного геля.

Пример 14
Ингредиент - %
Галактолипиды - 26.8
Гидрокортизон - 1.2
Этанол - 20.7
Вода - 51.3
Гидрокортизон растворяют в этаноле при несильном нагревании и перемешивании. После добавления воды и галактолипидов смесь подвергают вихревому перемешиванию, центрифугируют и слегка нагревают до получения светло-коричневого прозрачного геля.

В примерах 15-17 описаны различные безводные местные препараты. Здесь так же, как и раньше, в качестве модели лекарственного средства выбран гидрокортизон. Галактолипиды получают из овса. Все препараты стабильны при хранении более 2 месяцев при комнатной температуре.

Пример 15
Ингредиент - %
Галактолипиды - 7.0
Гидрокортизон - 0.8
Глицерин, 99 об.% - 92.2
Галактолипиды диспергируют в глицерине. После получения гомогенной гелевой фазы добавляют гидрокортизон. Смесь слегка нагревают и затем перемешивают с помощью вихревого миксера. Полученный препарат-суспензия представляет собой желтоватый вязкий гель, содержащий мелкодиспергированные твердые частицы гидрокортизона.

Пример 16
Ингредиент - %
Галактолипиды - 13.5
Гидрокортизон - 1.1
Глицерин, 99 об.% - 85.4
Препарат готовят по методу примера 15. Полученная композиция представляет собой непрозрачный очень вязкий гель светло-желтого цвета.

Пример 17
Ингредиент - %
Галактолипиды - 21.8
Гидрокортизон - 1.1
Пропанол - 14.5
Глицерин, 99 об.% - 62.6
Гидрокортизон частично растворяют в пропаноле при несильном нагревании и перемешивании. После добавления галактолипидов с последующим энергичным перемешиванием вносят глицерин. Затем композицию подвергают вихревому перемешиванию, центрифугируют и нагревают до получения желтоватой гелевой фазы. Гель содержит мелкодисперсные частицы гидрокортизона.

Пример 18
Противогрибковый препарат для вагинального введения
Ингредиент - %
Галактолипиды - 45.6
Миконазола нитрат - 1.8
Вода - 52.6
Миконазола нитрат и галактолипиды, полученные из овса, хорошо перемешивают в вихревом миксере. После добавления воды композицию подвергают вихревому перемешиванию и встряхивают до получения коричневатого гомогенного очень вязкого геля.

Пример 19
Антибактериальный препарат в виде повязки на рану
Ингредиент - %
Галактолипиды - 42.8
Доксоциклина гидрохлорид - 1.7
Вода - 55.5
Доксоциклина гидрохлорид растворяют в воде с получением желтого раствора. После добавления галактолипидов, полученных из овса, смесь перемешивают в вихревом миксере и встряхивают до получения светло-коричневого очень вязкого геля.

Пример 20
Антибактериальный препарат для введения в наружный слуховой проход
Ингредиент - %
Галактолипиды - 2.0
Доксоциклина гидрохлорид - 2.0
Вода - 96.0
Доксоциклина гидрохлорид растворяют в воде с получением желтого раствора. После добавления галактолипидов, полученных из овса, смесь перемешивают в вихревом миксере до получения желтой молочной дисперсии везикул, нагруженных доксоциклином.

Пример 21
Антидиабетическая композиция для назального введения
Ингредиент - %
Галактолипиды - 3.5
Раствор инсулина, 100 Ед/мл [Актрапид Хьюман, Ново Нордиск AS (Actrapid Human, Novo Nordisk AS), Швеция] - 96.5
Галактолипиды, полученные из овса, гидратируют в растворе коммерческого инсулина при несильном перемешивании в течение 24 ч. Полученную дисперсию переносят в обычный флакон с насосом для интраназального введения, из которого может быть получена тонкая аэрозольная струя.

Пример 22
Сперматоцидная композиция
Ингредиент - %
Галактолипиды - 22.5
Ноноксинол - 5.0
Вода - 72.5
Смесь трех компонентов подвергают поочередно вихревому перемешиванию, центрифугированию и несильному перемешиванию до получения коричневатого прозрачного геля.

Пример 23
Анальгезирующая композиция для ректального введения
Ингредиент - %
Галактолипиды - 43.4
Парацетамол - 2.9
Вода - 53.7
Полученные из овса галактолипиды и парацетамол хорошо перемешивают. После добавления воды препарат поочередно перемешивают палочкой, слегка нагревают и затем центрифугируют при комнатной температуре до получения желто-коричневого очень вязкого геля.

На вязкость галактолипидных композиций оказывают лишь незначительное воздействие умеренные изменения температур. Композицию, хранящуюся в холодильнике, можно легко сразу перенести в шприц или аналогичное устройство и затем ввести ректально, при этом композиция, нагреваясь до температуры тела, не теряет свойственные ей вязкость и консистенцию.

Пример 24
Антиглаукомная композиция для глазного введения
Ингредиент - %
Галактолипиды - 1.00
Тимола малеат - 0.34
Вода - 98.66
Полученные из овса галактолипиды диспергируют в одной части воды и оставляют на ночь для набухания при несильном перемешивании при комнатной температуре. Затем добавляют растворенный в оставшемся количестве воды тимола малеат, переносят полученную липосомальную дисперсию в стеклянную пробирку и проводят разрушение в течение 10 мин в атмосфере азота при температуре 0^oC с помощью ультразвукового дезинтегратора [XL-2020, Хит Системз Инк., США (XL-2020; Heat Systems Inc.), контроль выхода 4], снабженного устройством с наконечником для отбора микропроб.

Получают в результате прозрачную дисперсию, содержащую небольшие однослойные везикулы и лекарственное средство в фармакологически эффективном количестве, которая может использоваться как глазные капли. При этом галактолипиды увеличивают вязкость полученной композиции, а также улучшают ее биоадгезивность, что может привести к улучшению биологической доступности лекарственного средства в связи с увеличением периода нахождения в роговице.

Пример 25
Включение литиевой соли гамма-линоленовой кислоты в галактолипидные липосомы
Липосомальную галактолипидную композицию, включающую литиевую соль гамма-линоленовой кислоты, которая применяется как антираковое средство, готовят следующим образом:
Ингредиент - %
Ли-ГЛК - 1.5
Обогащенный галактолипид - 10.0
Глицерин в воде 2,3% - До 100.0
Ли-ГЛК с содержанием гамма-линоленовой кислоты в 75% получают от Калланиш Лтд., Шотландия (Callanish Ltd.). Обогащенный галактолипидный материал, полученный из овса, и Ли-ГЛК смешивают друг с другом, после чего добавляют 2.3%-ный раствор глицерина. Смесь оставляют на 8 ч для гидратации (или набухания). После очень сильного перемешивания при 12000 об/мин в течение 30 с липосомальную дисперсию гомогенизируют под давлением 86 МПа в течение 3 мин [ЭмульсиФлекс-C30, Авестин Инк. , Канада (EmulsiFlex-C30, Avestin Inc.)]; 1.5%-ная концентрация Ли-ГЛК соответствует 53 мМ.

Гемолитический эффект липосомальной дисперсии определяют in vitro по методу, приведенному ниже в тесте 6.

Пример 26
Получение дисперсии, содержащей 10% L-тирозина
Дисперсию готовят следующим образом:
Ингредиент - %
Галактолипиды из овса - 6.4
L-тирозин - 10.0
Вода - 83.6
Все ингредиенты смешивают и подвергают усиленному перемешиванию при 15000 об/мин в течение 4 мин до образования гомогенной дисперсии. Образовавшаяся дисперсия стабильна в течение нескольких недель после приготовления.

На фиг. 1 приведена микрофотография в поляризованном свете липосом, полученных в примере 9 из 10 об.% галактолипидов в глицерине при увеличении х100. Для липосом характерна сферическая форма с мальтийскими крестами.

На фиг. 2 показано нервно-блокирующее действие локального анестетика на модели крыс с длительным внутриоболочечным имплантатом в соответствии с данными теста 3.

Биологические тесты
Тест 1
Кожное раздражение in vivo
С целью оценки кожной токсичности галактолипидов настоящего изобретения были проведены следующие тесты.

Галактолипиды из овса смешивают с водой для инъекции с получением 10% геля и наносят его в виде дозы, соответствующей 0.5 мл на животное, на интактную кожу самцов 6 новозеландских белых кроликов (New Zealand White rabbits) и держат его под полугерметичной повязкой в течение 4 ч. Обследование кожи на наличие эритемы и отека проводят через 1, 24, 48 и 72 ч после удаления повязки. Затем вычисляют средние значения на основе оценки повреждений кожи через 24, 48 и 72 ч. Результаты приведены в табл. 9.

На основании приведенных данных можно сделать вывод о том, что нанесение галактолипидного геля не вызывает заметного раздражения кожи.

Тест 2
Оценка клиренса галактолипидных липосом in vivo
Получение ДГДГ с меченой ³H-жирной кислотой
500 мг галактолипидов из овса метят тритием при каталитическом восстановлении двойных связей в жирных кислотах с помощью газообразного трития [Амершам Тритиум Лэбеллинг Сервис (Amersham Tritium Labelling Service), Великобритания] . Удельная активность его составляет 30-60 Ci/ммоль в расчете на восстановленную двойную связь. ³H-ДГДГ чистят с помощью двумерной тонкослойной хроматографии на пластинах с силикагелем 60. Движущиеся фазы в первом направлении представлены смесью хлороформ:метанол:вода, 65:25:4 (объем/объем), а во втором направлении - хлороформ:метанол:уксусная кислота: вода, 85: 15:10:3.5 (объем/объем). Пятно ДГДГ элюируют последовательно смесями хлороформ:метанол:вода, 65:25:4 (объем/объем) и 50:50:10 (объем/объем), чистым метанолом и, наконец, смесью метанол:вода, 1:1 (объем/объем). Пропорция ³H в липофильной части галактолипидного материала была определена следующим образом: 18 nCi ³H-меченого ДГДГ и 2 мг немеченого материала подвергают щелочному гидролизу в 1 мл 1 М КОН при температуре 60^oC в течение 4 ч. После нейтрализации с помощью 0.2 мл 5 М HCl добавляют 5 мл хлороформа, 1.5 мл этанола и 2.5 мл воды. В указанной двухфазной распределительной системе 97% радиоактивности регенерируется в нижней (хлороформной) фазе.

Немеченый галактолипид и ³H-ДГДГ при общей концентрации в 2.0 об.% диспергируют в 2.5 об.% глицерина в воде. Липосомальную дисперсию уравновешивают в течение 36 ч при температуре 4^oC. После этого ее озвучивают при температуре 0^oC в атмосфере азота с применением устройства с наконечником для отбора микропроб в течение 3 х 2 мин, в режиме 4 мин импульса.

Тесты на крысах
Голодающие самцы крыс Спрэг Доли (Sprague Dawley) с весом около 250 г подвергаются анестезии диэтиловым эфиром. 0.5 мл озвученной дисперсии с уровнем радиоактивности 1.8-2.7 мкCi вводят во внешнюю яремную вену. Через 2 мин, 15 мин, 60 мин, 4 ч и 20 ч животных умерщвляют через прокол аорты. Липиды из образцов печени и плазмы крови экстрагируют смесью хлороформ:метанол, 1: 1 (объем/объем). Экстракты высушивают в атмосфере азота, перерастворяют в хлороформе и подвергают хроматографированию в тонком слое на пластинках с силикагелем 60, осуществляемому в системе хлороформ:метанол:вода: уксусная кислота, 65:25:4:4 (объем/объем). Пятно ДГДГ счищают в ампулы для счета; затем добавляют 1 мл смеси метанол:вода, 1:1 (объем/объем), после чего добавляют 10 мл смеси толуол: Инстагель [Паккард Инструментс В.V. (Instagel, Packard Instruments В.V.), Нидерланды], 1:1 (объем/объем), подвергают полученную смесь вихревому перемешиванию. Радиоактивность определяют в жидком сцинтилляционном счетчике Паккард ТриКарб (Packard TriCarb). Данные выражают в виде % от инъецированной дозы ³H-ДГДГ в 10 мл плазмы (4% от общего веса тела) и всей печени в разное время, которые суммированы в табл. 10.

Полученные результаты позволяют предположить, что везикулы, включающие ДГДГ, при внутривенной инъекции крысам имеют период полужизни около 30 мин. Кроме того, очевидно, что галактолипидные везикулы выводятся из кровяного русла и подвергаются эффективной деградации, главным образом в печени.

Тест 3
Композиции с локальным анестезирующим лекарственным средством и исследование in vivo спинно-мозговой анестезии у крыс
Различные композиции с бупивакаина гидрохлоридом готовят следующим образом (табл. 11).

Способность композиций увеличивать длительность действия локального анестетика на спинной мозг и нервные корешки исследовали в контролируемом эксперименте на крысах с длительно имплантированными внутриоболочечно катетерами.

Четыре группы самцов крыс Спрэг Доли (Sprague Dawley) (вес 235-300 г) обследовали через неделю после имплантации внутриоболочечного катетера по методу Якша и Руди (T.L. Yaksh and Т.A. Rudy, Physiol. Behav., 1976, vol. 17, 1031-1036). При этом двум группам крыс вводили бупивакаин в галактолипидной формуле (композиция А), третьей группе давали бупивакаин в виде водного раствора (композиция Б), а четвертой группе давали галактолипидную формулу без какого-либо местного анестетика (композиция В), в соответствии с режимом, представленным в табл. 12.

Крысы были помещены случайным образом в одну из четырех групп. Тестируемое вещество вводят в нижний поясничный участок в дуральный мешочек через имплантированный катетер. Действие исследуемого вещества на двигательную функцию отслеживают через регулярные интервалы времени и распределяют по шкале 0, 1, 2, 3 и 4, где 0 - отсутствие моторных нарушений, а 4 - паралич обеих задних и обеих передних конечностей. Крыс наблюдали в течение не менее 90 мин.

Результаты представлены на фиг. 2. Все животные, получавшие активный локальный анестетик, демонстрируют выраженное нарушение двигательных функций достаточно быстро после введения дозы. Однако продолжительность этого действия заметно отличается для трех разных групп, при этом наибольшая продолжительность отмечается в группе, получающей высокую дозу, и наименьшая продолжительность паралича - в контрольной группе. К 90-й мин все животные полностью восстановились. При 20 мин различия относительно контроля были статистически значимыми для групп, принимавших соответственно высокую дозу и низкую дозу [ранжирование по Вилькоксону (Wilcoxon signed rank test)]. Группа, принимавшая высокую дозу, отличалась от контрольной группы также на 30-й мин. Группа, принимавшая плацебо, не демонстрировала какого-либо эффекта ни в какое время. Не отмечалось неожиданных или токсических эффектов, а все наблюдавшиеся эффекты были обратимыми.

Заключение. Галактолипидная композиция с бупивакаином может значительно увеличить продолжительность действия бупивакаина по блокированию нервов на модели крыс с внутриоболочечным хроническим имплантатом. Кроме того, приведенные данные подтверждают полезность применения галактолипидной композиции для продления времени взаимодействия биологически активных компонентов.

Тест 4
Тест на гемолиз in vitro липосом, содержащих Ли-ГЛК
По приведенной ниже процедуре исследовали гемолитическое действие липосомальной Ли-ГЛК композиции, полученной по методу примера 25, сравнивая ее с тремя другими Ли-ГЛК с использованием цельной крови.

Кровь от здоровых волонтеров отбирали в 10-мл пробирки Вакутейнера [Бектон Диккинсон, Канада (Vakutainer, Becton Dickinson, Canada)], содержащие 143 ед. натрий-гепарина (Американская фармакопея, USP).

Образцы крови по 2 мл переносят в 25-мл колбы Эрленмейера, каждый из них перемешивают с 1.0 мл исследуемой композиции, разбавленной 0.9%-ным солевым раствором до нужной концентрации. Затем образцы инкубируют при температуре 37^oC в обогащенной атмосфере кислорода:двуокиси углерода, 95:5, 3 л/мин, в течение 1 ч при постоянном несильном перемешивании. К концу инкубации 10 мкл смеси крови переносят к 500 мкл солевого раствора в 1.5-мл эппендорфовской пробирке. Демонстрирующие 100%-ный гемолиз стандарты готовят добавлением 10 мкл крови к 500 мкл чистой воды в 1.5-мл эппендорфовской пробирке. Затем все образцы откручивают в течение 2 мин в микроцентрифуге Эппендорфа [Бринкман Инструментc Лтд. (Brinkman Instruments Ltd.), Канада] и окончательно исследуют на центрифужном анализаторе [Кобал Биоэнелайзер; Хоффман-Ла Роше Лтд. (Cobal Bioanalyzer; Hoffman-La Roche Ltd.), Канада] в УФ-области при длине волны 540 нм. В табл. 13 представлены полученные результаты.

Ли-ГЛК, растворенный в 0.9%-ном солевом растворе, вызывает 100%-ный гемолиз при концентрации около 4-5 мМ. Таким образом, гемолитическая активность Ли-ГЛК в липосомальной форме значительно снижается. Сниженная гемолитическая активность липосомальной Ли-ГЛК была подтверждена предварительными исследованиями in vivo на крысах: гемолиз снижается на 50-80%, если вместо свободной Ли-ГЛК используется липосомальная композиция. Липосомальная композиция в отличие от свободной Ли-ГЛК не приводит к образованию у крыс "красной мочи". Было, кроме того, показано, что антираковая активность in vitro у свободной Ли-ГЛК и липосомальной Ли-ГЛК практически идентичны. Описанные тесты позволяют предположить, что липосомальная галактолипидная композиция снижает гемолиз, тяжелую побочную реакцию лекарственного средства без воздействия на его фармакологическую эффективность.

В заключение следует отметить, что в настоящем изобретении приведены данные, свидетельствующие о том, что липидные препараты в полярном растворителе, основанные на галактолипидном материале, обладают улучшенными в сравнении с фосфолипидными препаратами свойствами по всем аспектам, таким как физическая стабильность препаратов, эффективность включения лекарственных средств, а также способность замедлять высвобождение включенных лекарств.

Изобретение относится к фармакологии, конкретно к двуслойному липидному препарату в полярном растворителе, который включает 0,01-90 вес.%, предпочтительно 0,1-50 вес.%, материала, формирующего бислой, при этом упомянутый материал, формирующий бислой, представляет собой галактолипидный материал из злаковых, состоящий по меньшей мере на 50% из дигалактозилдиацилглицеринов, а оставшаяся часть включает другие полярные липиды. Изобретение относится также к фармацевтической композиции, включающей терапевтически активное вещество в смеси с упомянутым двуслойным препаратом. Препараты обладают повышенной устойчивостью и химической стабильностью. 3 с. и 9 з.п. ф-лы, 13 табл., 2 ил.

1. Применение двуслойного липидного препарата, содержащего полярный растворитель и 0,01 - 90 вес.%, предпочтительно 0,1 - 50 вес.% галактолипидов из злаковых, содержащих, по меньшей мере, 50% дигалактозилдиацилглицеринов и остальное - другие полярные липиды, в качестве носителя активного вещества в фармацевтических, косметических или пищевых продуктах. 2. Применение по п.1, где галактолипиды из злаковых содержат 70 - 80% дигалактозилдиацилглицеринов и 20 - 30% других полярных липидов. 3. Применение по п.1, где галактолипиды из злаковых состоят вплоть до 100% из дигалактозилдиацилглицеринов. 4. Применение по п.1, где препарат находится в форме геля, содержащего 25 - 90 вес.% галактолипидов из злаковых и остальное - полярный растворитель. 5. Применение по любому из пп.1 - 3, где препарат находится в форме липосом, содержащих 0,01 - 25 вес.% галактолипидов из злаковых и остальное - полярный растворитель. 6. Фармацевтическая композиция, включающая терапевтически активное вещество и двуслойный липидный препарат, содержащий полярный растворитель и 0,01 - 90 вес.%, предпочтительно 0,1 - 50 вес.% материала, формирующего двойной слой, отличающаяся тем, что материал, формирующий двойной слой, представляет собой галактолипиды из злаковых, содержащие, по меньшей мере, 50% дигалактозилдиацилглицеринов и остальное - другие полярные липиды. 7. Фармацевтическая композиция по п.6, отличающаяся тем, что галактолипиды из злаковых содержат 70 - 80% диалактозилдиацилглицеринов и 20 - 30% других полярных липидов. 8. Фармацевтическая композиция по п.6, отличающаяся тем, что галактолипиды из злаковых состоят вплоть до 100% из дигалактозилдиацилглицеринов. 9. Фармацевтическая композиция по любому из пп.6 - 8, включающая терапевтически эффективное количество терапевтически активного вещества, 1 - 50 вес.% от всей композиции галактолипидов из злаковых, полярный растворитель и изотонически эффективное количество изотонического агента. 10. Фармацевтическая композиция по любому из пп.6 - 9, предназначенная для перорального, энтерального, парентерального, ректального, вагинального, местного, глазного, назального или ушного введения. 11. Фармацевтическая композиция по любому из пп.6 - 9, отличающаяся тем, что терапевтически активное вещество представляет собой соль или эфир γ- линолевой кислоты и количество галактолипидов из злаковых составляет меньше 25 вес.% от общей композиции. 12. Способ получения фармацевтической композиции по любому из пп.6 - 8, отличающийся тем, что 0,01 - 25 вес.% от всей композиции галактолипидов из злаковых, содержащих, по меньшей мере, 50 вес.% дигалактозилдиацилглицеринов, остальное - другие полярные липиды, смешивают с активным веществом в полярном растворителе в количестве, достигающем вплоть до 100 вес.%.