СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЦЕНТРИРОВАННОГО РАСТВОРА ДЕЗАЦЕТИЛ-7-ГЛУТАРИЛАМИНОЦЕФАЛОСПОРИНОВОЙ КИСЛОТЫ Российский патент 2001 года по МПК C07D501/12 C07D501/24 

Изобретение относится к усовершенствованному способу получения концентрированных водных растворов 3-гидроксиметилцефалоспорина из водных ферментационных бульонов. Более конкретно, оно относится к способу экстракции некоторых промежуточных соединений 3-гидроксиметилцефалоспорина циклогексаноном из водных ферментационных бульонов с последующей обратной экстракцией водным раствором с получением концентрированного водного раствора целевого продукта - 3-гидроксиметилцефалоспорина.

7-Аминоцефалоспориновая кислота (7-АСА) и ее различные производные являются ценными промежуточными продуктами при получении антибиотиков, относящихся к классу цефалоспоринов. 7-АСА и ее производные, имеющие различные заместители в положении 3, могут быть получены из продукта ферментации - цефалоспорина С известными способами. Например, конверсию цефалоспорина С в 7-АСА можно осуществить известными химическими и ферментативными способами.

В патенте США 4533632 описан способ получения дезацетилцефалоспорина C в водной ферментационной среде, сообщается, что этот продукт имеет значительные преимущества по сравнению с цефалоспорином C при получении производных цефалоспорина.

В других источниках, например, в патенте США 5424196, описаны ферментативные способы превращения дезацетилцефалоспорина C, полученного в водном ферментационном бульоне, в дезацетил-7-глутарил АСА, содержащей 3-гидроксиметильный заместитель.

В патентах США 4908444 и 5221739, а также в J.Antibiotics. 47(1): 64-71, 1994 описан способ ацетилирования дезацетил-7-глутарил АСА в водном растворе уксусным ангидридом с получением 7-глутарил АСА, которая затем может гидролизоваться ферментативно с получением 7-АСА с высоким выходом.

Несмотря на успехи в создании ферментативного способа, который предусматривает использование дезацетил-7-глутарил АСА, полученный из водного ферментативного бульона, такой способ еще не стал промышленным. Одна серьезная проблема заключается в том, что дезацетил-7-глутарил АСА получается в ферментационном бульоне с низкими концентрациями (≈ 1-3%) и не может ацетилироваться при этих концентрациях экономичным способом, известным из уровня техники. Сообщается, например, в вышеупомянутых патентах, что реакция ацетилирования протекает при высоких концентрациях дезацетил-7-глутарил, АСА, предпочтительно, выше 10%. До сих пор не удавалось получить концентрированный (≥ 10 вес.%/об.) водный раствор дезацетил-7-глутарил АСА из ферментативных бульонов дезацетилцефалоспорина С так, чтобы стадия водного ацетилирования была экономичной.

Для экстракции цефалоспоринов из водных ферментационных бульонов использовали различные органические растворители, например, н-бутилацетат, метиленхлорид, метилизо-бутилкетон, хлороформ и этилацетат. В патенте США 3835129 упоминается, что цикло-гексанон считается хорошим экстрагентом для N-ацилцефалоспорина C, но в случае крупномасштабного производства возникали проблемы, связанные с образованием эмульсии. В патенте США 4168375 в перечне возможных экстрагентов для сульфонамидных производных цефалоспорина C упоминается циклогексанон, но ничего не говорится об экстракции 3-гидроксиметилцефалоспоринов. В патенте США 3986644 указано, что циклогексанон используется для экстракции некоторых фосфорсодержащих амидных производных цефалоспорина C, но и в этом случае не упоминается о 3-гидроксиметилцефалоспоринах.

Было установлено, что трудно или невозможно осуществить экстракцию 3-гидрокси-метилцефалоспоринов, таких как дезацетил-7-глутарил АСА, обычными органическими растворителями, используемыми для других цефалоспоринов, таких как N-блокированный цефалоспорин C, но что применение циклогексанона в качестве экстрагента согласно данному изобретению позволяет получить из ферментативного бульона достаточно концентрированный водный раствор дезацетил-7-глутарил АСА для того, чтобы сделать экономичной вышеописанную стадию водного ацетилирования и получить 7-глутарил АСА, который затем можно превратить в 7-АСА известными методами.

Данное изобретение предусматривает способ получения концентрированного (10 вес. %/об.) водного раствора дезацетил-7- глутарил АСА из водного раствора, предпочтительно, из водного ферментативного бульона и, наиболее предпочтительно, обработанного ферментационного бульона, содержащего дезацетил-7-глутарил АСА в более низкой концентрации, который включает стадии:
(а) приготовление водного раствора, предпочтительно, ферментационного бульона и, наиболее предпочтительно, обработанного ферментационного бульона, содержащего дезацетил-7-глутарил АСА;
(б) концентрирование полученного раствора с циклогексаноном при pH от, примерно, 1,5 до, примерно, 3 для экстрагирования дезацетил-7-глутарил АСА в циклогексаноновую фазу;
(в) отделение циклогексаноновой фазы от водной фазы;
(г) контактирование циклогексаноновой фазы с водой при pH от, примерно, 5 до, примерно, 7,5 и
(д) отделение водной фазы, содержащей желаемый концентрированный раствор дезацетил-7-глутарил АСА.

Как указано выше, осуществление ферментативного способа получения 7-АСА из дезацетилцефалоспорина С в промышленном масштабе требует достаточных выходов на ключевой стадии ацетилирования, а именно ацетилирования дезацетил-7-глутарил АСА в водной среде уксусным ангидридом для получения 7-глутарил АСА. Достаточные выходы на этой стадии зависят от использования концентрированных (10 вес.%/об.) водных растворов исходного дезацетил-7-глутарил АСА. Однако, когда это вещество получают из ферментационного бульона, он содержится в бульоне в более низкой концентрации порядка ≈ 1-3 вес.%/об., поэтому необходимо осуществить экстракцию дезацетил-7-глутарил АСА из ферментационного бульона и концентрацию его, с тем чтобы стадия ацетилирования стала экономичной и могла конкурировать с методами химического синтеза 7-АСА.

Согласно предпочтительному варианту способа по изобретению в качестве исходного продукта используют обработанный ферментационный бульон, содержащий дезацетил-7-глутарил АСА. Используемый в данном описании термин "обработанный ферментационный бульон" означает ферментационный бульон дезацетилцефалоспорина C, который подвергли ферментационным процессам, например, описанным в патенте США 5424196, с превращением в бульон, содержащий дезацетил-7-глутарил АСА. Дезацетил-7-глутарил АСА должен содержаться в обработанном бульоне в количестве, которое можно выделить, обычно он содержится в довольно низкой концентрации, составляющей, примерно, 1-3% (вес./об.). Обработанный бульон может быть использован непосредственно после обработки или после очистки, например, регулировки pH и фильтрования. Обработанный бульон можно также подвергнуть обработке на одной или нескольких колонках, заполненных смолами для дальнейшей его очистки; эта последняя водная среда иногда называется "элюатом из смолы".

Водный раствор, предпочтительно, обработанный ферментационный бульон, подвергают контактированию с циклогексаноном в качестве экстрагента и перемешивают или энергично встряхивают, образуются две фазы растворителей. До или во время экстракции циклогексаноном pH раствора или смеси доводят до величины от, примерно, 1,5 до, примерно, 3, предпочтительно, примерно, 2, при помощи неорганической кислоты, например, серной, азотной или соляной. Температура стадии экстракции циклогексаноном не является решающей, но, предпочтительно, проводить экстракцию при температуре в интервале от, примерно, 0^oC до, примерно, комнатной температуры, наиболее предпочтительно, в интервале, примерно, 5-10^oC. После экстракции водная фаза может быть снова обработана циклогексаноном для получения дополнительных количеств дезацетил-7-глутарил АСА и циклогексаноновые слои соединяют. Экстракция циклогексаноном приводит к достижению высокой степени экстракции, обычно более 90%, дезацетил-7-глутарил АСА из бульона.

Поскольку стадия ацетилирования с получением дезацетил-7-глутарил АСА проводится в водной среде, необходимо осуществить обратную экстракцию циклогексанонового слоя, содержащего дезацетил-7-глутарил АСА, в воду для получения желаемого концентрированного водного раствора. Циклогексаноновую фазу отделяют от водной фазы и осуществляют ее контактирование с водой при pH в интервале от, примерно, 5 до, примерно, 7,5 вновь с получением двух фаз растворителей, причем в этот раз водная фаза содержит дезацетил-7-глутарил АСА. Эти фазы растворителей разделяют и получают желаемый водный раствор. Основание для установления pH на этой стадии не является определяющим, но предпочтительно использовать ацетатный буфер, такой как ацетат натрия или калия.

Температура на этой стадии экстракции может быть такой же, какая используется для экстракции циклогексаноном. Обратная экстракция водой приводит к достижению высоких выходов, опять-таки выше 90%, дезацетил-7-глутарил АСА, выделяемых в водной фазе.

Способ согласно данному изобретению обеспечивает получение водных растворов дезацетил-7-глутарил АСА с концентрациями 10%. Можно получить концентрации в интервале 10-20 вес.%/об., при этом легко достигается концентрация 15%, и она является предпочтительной на последующей стадии ацетилирования. Сочетание экстракции и обратной экстракции позволяет удалить соли, образовавшиеся в процессе ферментации, а также обеспечить требуемую концентрацию дезацетил-7-глутарил АСА.

Как указано выше, установлено, что циклогексанон является уникальным растворителем для экстракции 3-гидроксиметилцефалоспоринов, таких как дезацетил- 7-глутарил АСА. Обычные органические растворители, используемые для экстракции других промежуточных производных цефалоспорина, таких как N-блокированный цефалоспорин C, из ферментационных бульонов, не пригодны для 3-гидроксиметил-цефалоспоринов. Для иллюстрации этого факта в таблице в конце описания показана степень экстракции дезацетил-7-глутарил АСА при помощи различных промышленных растворителей.

Ясно, что циклогексанон является лучшим экстрагентом. Было также установлено, что лактонизация дезацетил-7-глутарил АСА значительно уменьшается при применении циклогексанона в качестве экстрагента. Осуществление полного процесса экстракция/обратная экстракция согласно данному изобретению обеспечивает более, чем 10-кратное увеличение концентрации дезацетил-7-глутарил АСА и полученный водный раствор совместим с водной средой на стадии ацетилирования, не требуя дальнейшей обработки.

Нижеследующие примеры приведены для иллюстрации изобретения.

Пример 1.

Превращение цефалоспорина С в глутарил-7-АСА под действием оксидазы D-аминокислот. иммобилизованной на Дуолите А 365.

Периодическая конверсия
66 г дигидрата натриевой соли цефалоспорина C (чистота 90.9%) растворяют в 2 л калийфосфатного буфера с концентрацией 25 мМ, содержащего 0,5 г метабисульфита натрия.

Раствор цефалоспорина C подают в 3-литровый реактор со 150 г сырой оксидазы D-аминокислот, иммобилизованной на Дуолите А 365.

Термостатирование проводят при 25^oC при слабом перемешивании в токе кислорода, поступающего через нижний диффузор со скоростью 1 об/об/мин.

Значение pH поддерживается 7,5 автоматическим добавлением 5% раствора аммиака.

Через 75 минут цефалоспорин C полностью трансформируется. Процентный состав продуктов трансформации цефалоспорина следующий:
Глутарил-7-АСА - 90,1%
Кетоадипил-7-АСА - 6,2%
Глутарил-7-АСА дезацетил - 1,1%
Глутарил-7-АСА дезацетокси - 0,9%
Глутарил-7-АСА судьфоксид - 0,8%
Другие β-лактамы - 0,9%
Чтобы трансформировать оставшийся кетоадипил-7-АСА в глутарил-7-АСА, раствор, полученный после термостатирования, отделяют от массы иммобилизованного фермента фильтрованием. На каждый литр фильтрата при слабом перемешивании добавляют 10 мл 3,5% раствора перекиси водорода. Смесь оставляют на 15 минут при 25^oC после чего добавляют 0,5 г пирувата натрия.

Процентный состав по окончании обработки следующий:
Глутарил-7-АСА - 95,5%
Кетоадипил-7-АСА - 0,1%
Глутарил-7-АСА дезацетил - 1,1%
Глутарил-7-АСА дезацетокси - 0,9%
Глутарил-7-АСА судьфоксид - 1,5%
Другие β-лактамы - 0,9%
Ферментную нагрузку испытывали для 100 циклов в течение 75-120 минут.

Общая продукция составляла 4760 г глутарил-7-АСА, что эквивалентно 31,7 г глутарил-7-АСА на г иммобилизованного фермента.

Пример 2.

Перемешивают 2,7%-ный водный раствор (1180 мл) дезацетил-7-глутарил АСА и цикло-гексанон (1180 мл), добавляют 6N HCl для доведения pH до 2,0. Смесь подают в разделительную воронку и осуществляют экстракцию. Слои разделяются, оставляют циклогексаноновый слой. Водный слой обрабатывают свежим циклогексаноном (2 x 1000 мл). Объединенные циклогексаноновые слои (3220 мл) анализируют, получается раствор с концентрацией 0,928%. Степень экстракции дезацетил-7-глутарил АСА равна 92%. Циклогексаноновый экстракт (3215 мл), содержащий дезацетил-7-глутарил АСА (0,928%), подвергают обратной экстракции 4,0 М раствором ацетата натрия (NaOAc) (90,0 мл). Величина pH смеси возрастает с 2,4 до 5,87. Разделение слоев приводит к получению водного слоя (151,5 мл) с концентрацией 18,1%. Обратная экстракция дезацетил-7-глутарил АСА обеспечивает степень экстракции, равную 92%. Общая степень экстракции дезацетил-7-глутарил АСА составляет 84%.

Пример 3.

Перемешивают 2,48%-ный водный раствор (910 мл) дезацетил-7-глутарил АСА и циклогексанон (910 мл), добавляют 6N HCl для доведения pH смеси, первоначально равного 7,2, до 2,0. Смесь подают в разделительную воронку и подвергают экстракции. Слои разделяют, оставляя циклогексаноновый слой. Водный слой обрабатывают свежим циклогексаноном (2 x 910 мл). Объединенные циклогексаноновые слои (2825 мл) анализировали, концентрация раствора равна 0,77%. Степень экстракции дезацетил-7-глутарил АСА равна 96%. Циклогексаноновый экстракт (2822 мл), содержащий дезацетил-7-глутарил АСА (0,77%), подвергают обратной экстракции 4,8 М ацетатом калия (KOAc) (60,0 мл). pH смеси увеличивается от 2,5 до 6,45. Полученный после разделения слоев водный слой (122,5 мл) (79%) имеет концентрацию 14,1 %. Обратная экстракция 1,0 М KOAc (2 х 7,0 мл) приводит к получению объединенных водных слоев (18,2 мл) (7,6%). Степень экстракции дезацетил-7-глутарил АСА после обратной экстракции составляет 87,6%. Общая степень экстракции дезацетил-7-глутарил АСА равна 84%.

Пример 4.

Лабораторный опыт с использованием окисленного UF (Ultrafilter), через который пропущен раствор дезацетил-7-глутарил АСА. Используя сепаратор ДеЛаваля, отфильтрованный ферментационный бульон (10,19 л), содержащий дезацетил-7-глутарил АСА (2,41%) экстрагируют при pH 2,0 циклогексаноном (10,19 л). Каждую экстракцию осуществляют при объеме 1,9 л. Свежая порция пропущенного через фильтр бульона экстрагируется обогащенным циклогексаноном с предыдущей экстракции, что имитирует непрерывный процесс. Порция обогащенного циклогексанона (3830 мл) из конечного раствора после последней стадии имеет концентрацию 1,18% и обрабатывается 4,0 М NaOAc (150 мл), получают водный раствор дезацетил-7-глутарил АСА (250 мл) (16,3%). Степень экстракции после обратной экстракции составляет 90%.

Изобретение относится к получению цефалоспоринового промежуточного соединения, в частности, к дезацетил-7-глутариламиноцефалоспориновой кислоте, которую получают в виде концентрированного водного раствора не менее 10 вес/%/об. из водного раствора, содержащего дезацетил-7-глутариламиноцефалоспориновую кислоту в менее концентрированном виде, путем экстракции растворителем - циклогексаноном, с последующей обратной экстракцией в водную фазу. Концентрированный водный раствор находится в форме, которую можно использовать для экономичного получения 7-аминоцефалоспориновой кислоты известными методами. 2 з.п. ф-лы, 1 табл.

1. Способ получения концентрированного не менее 10 вес.%/об. водного раствора дезацетил-7-глутариламиноцефалоспориновой кислоты из водного ферментационного бульона, содержащего дезацетил-7-глутариламиноцефалоспориновую кислоту в более низкой концентрации, включающий следующие стадии: (а) приготовление водного ферментационного бульона, содержащего дезацетил-7-глутариламиноцефалоспориновую кислоту концентрацией менее 10 вес.%/об., (б) перемешивание полученного бульона с циклогексаноном при pH примерно 1,5 - 3 для экстрагирования дезацетил-7-глутариламиноцефалоспориновой кислоты в циклогексаноновую фазу: (в) отделение циклогексаноновой фазы от водной фазы, (г) контактирование полученной циклогексаноновой фазы с водой при pH примерно 5 - 7,5 и (д) отделение водной фазы, содержащей желательный концентрированный раствор дезацетил-7-глутариламиноцефалоспориновой кислоты. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что водный ферментационный бульон на стадии (а) представляет собой обработанный ферментационный бульон. 3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что стадия (г) предусматривает использование ацетатного буфера.