СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ЛИЗОЦИМА СЛЮНЫ Российский патент 2001 года по МПК G01N33/52 

Изобретение относится к медицине, а именно к стоматологии, и может быть использовано для исследования функциональной деятельности слюнных желез и протективных свойств слюны при различных патологических процессах в ротовой полости, а также для изучения влияния гигиенических средств ротовой полости и пищевых продуктов на антимикробные свойства слюны с целью оценки качества употребляемой продукции.

В настоящее время широко применяют разнообразные гигиенические средства ротовой полости (зубные пасты, зубные порошки, зубные эликсиры, жевательные резинки и дезодорирующие таблетки). Однако до сих пор не было изучено их влияние на антибактериальные свойства слюны, в частности на активность лизоцима - фактора неспецифической защиты организма. Подобный тест может быть использован для определения влияния средств гигиены на состояние местного иммунитета ротовой полости.

В нашей стране для определения активности лизоцима слюны в последние годы используют нефелометрический метод, основанный на определении просветления тест - культуры Micrococcus lysodeikticus под влиянием лизоцима, содержащегося в секрете.

И. В. Марьянская, В.И.Ашкинази, Г.А.Савельева и соавт. (1995) предложили автоматизированный микрометод определения лизоцимной активности (Марьянская И. В. , Ашкинази В.И., Савельева Г.А., Аредаков Е.А. Автоматизированный микрометод определения лизоцимной активности. // Клиническая лабораторная диагностика, 1995, N 4, с. 31-33. Для проведения анализа готовили взвесь суточной агаровой культуры М. lysodeikticus на фосфатном буфере pH 7,2 - 7,4, соответствующий 20% светопропускания или 0,5 ед. оптической плотности (СФ, длина волны 650 нм). Лизоцим для построения калибровочного графика разводили на фосфатном буфере в двухкратных разведениях, начиная с 50 мкг на 1 мл до 0,25 мкг. Во все лунки 96-луночного полистиролового планшета, кроме 1-го вертикального ряда раскапывали по 196 мкл взвеси тест-культуры, затем во 2-й и 3-й вертикальные ряды - по 4 мкл раствора лизоцима в возрастающих двухкратных концентрациях, в остальные - по 4 мкл испытуемых образцов. 1-й вертикальный ряд, заполненный фосфатным буфером, служил бланком, показатели которого автоматически вычитались из показателей опытных образцов. После раскапывания всех компонентов планшет встряхивали и измеряли исходные показатели тест - культуры, после чего планшет закрывали крышкой и инкубировали при 37^oC, снимая показатели оптической плотности через 30 мин в течение 2 ч. Перед каждым измерением планшет встряхивали на шейкере в течение 3 мин. Активность лизоцима определяли, вычитая показатели оптической плотности опытных и контрольных образцов из показателей оптической плотности тест-культуры. К недостаткам метода относятся длительность определения, отсутствие системы расчета, необходимость использования программного обеспечения и полистироловых планшет.

Чаще всего для определения активности лизоцима слюны используют нефелометрический метод Дорофейчука (1968) (О.В.Бухарин, Н.В.Васильев. Лизоцим и его роль в биологии и медицине. Томск, 1974, с. 34), принятый нами за прототип. Взвесь культуры М. lysodeikticus готовят описанным выше способом. Затем помещают в пробирку 1,47 мл взвеси микрококка и 0,03 мл цельной слюны, получая разведение 1:50. Смесь встряхивают и выдерживают при 37^oC в течение 1 ч. После этого ее снова встряхивают и нефелометрируют. Об активности лизоцима судят, вычитая процент светопропускания исходной микробной взвеси (20%) из процента светопропускания испытуемой взвеси. Недостатком метода является длительность определения (что противоречит основным законам 1, кинетики ферментативных реакций) и отсутствие системы расчета.

Исходя из недостатков, имеющихся в перечисленных выше методах определения активности лизоцима слюны, мы поставили задачу разработать доступную для широкого использования методику определения активности лизоцима слюны в единицах фермента.

Сущность изобретения состоит в том, что определяют начальную оптическую плотность в растворе смеси слюны, разведенной в 15 раз, с микрококком, после чего смесь термостатируют в течение 10 минут и вновь измеряют оптическую плотность, а затем определяют активность лизоцима (АЛ) по формуле:
АЛ = (Д_о - Д_к)•200,
где: Д_о - начальная оптическая плотность смеси;
Д_к - конечная оптическая плотность смеси;
200 - коэффициент пересчета.

Способ осуществляют следующим образом. В качестве тест-культуры используют 24 ч агаровую культуру Micrococcus lysodeikticus [ML] (штамм N 2665 ГИСК им. Л. А. Тарасевича). Бактериальные клетки убивают хлороформом в течение 60 мин, смывают 0,067 М фосфатным буфером, фильтруют через крупнопористый фильтр, затем дважды отмывают 0,067 М фосфатным буфером с ЭДТА (KH₂PO₄ - 7,72 г; Na₂HPO₄•2H₂O - 1,78 г, ЭДТА - 0,372 г/л; H₂O дистиллированная - до 1000 мл, pH буфера 6,0 - 6,2) и один раз 0,067 М фосфатным буфером без ЭДТА. Культуру ML отделяют путем центрифугирования при 3500 об/мин 20 мин. После этого к осадку ML добавляют этот же буферный раствор и на спектрофотометре СФ-46 (λ = 540 нм) оптическую плотность суспензии микрококка доводят до 0,300. Исследуемые образцы слюны разводят 0,067 М фосфатным буфером в соотношении 1:9. К 2,0 мл субстрата (суспензии тест-штамма Micrococccus lysodeikticus) добавляют 0,5 мл раствора слюны. Измерения начинают непосредственно после внесения всех компонентов в смесь и через 10 мин инкубации при 37^oC. В контрольном опыте к 2,0 мл суспензии микрококка добавляют 0,5 мл 0,067 М фосфатного буфера. Расчет активности лизоцима производят по специальной, выведенной нами на основе математических расчетов, формуле.

Для выведения расчетной формулы определения удельной лизоцимной активности культуру микрококка готовят описанным выше способом. После чего полученную биомассу делят на 2 равные части. Одну часть доводят до оптической плотности 0,300, при λ = 540 нм. При этом объем буфера составляет 24 мл. В другой части путем минерализации по Кьельдалю, отгонки по Конвею и титрования определяют количество азота и рассчитывают содержание белка в пробе. Пятикратным исследованием установлено, что при оптической плотности 0,300 в пробе содержится 3,48 мг белка в микрококках. Столько же его содержится в 24 мл суспензии, а в 1 мл - 0,0148 мг. За единицу лизоцима условно принимают количество фермента, способного лизировать гликозаминогликаны (ГАГ) и протеогликаны (ПГ) Micrococcus Lysodeikticus, содержащие 0,001 мг белка.

На чертеже приводится калибровочный график активности лизоцима по мере гидролиза ГАГ и ПГ Micrococcus Lysodeikticus (см. приложение чертеж).

Активность лизоцима определяют по нижеприведенной формуле:

где : Д_о - начальная оптическая плотность;
Д_к - конечная оптическая плотность;
K - коэффициент пересчета = 100;
10 - разведение слюны;
2 - пересчет на 1 мл;
10 - время инкубации.

Данный способ апробирован при определении активности лизоцима секрета околоушных слюнных желез, изменяющейся под влиянием жевательных резинок "Dirol", "Orbit", "Stimorol", "Wrigleys spearmint" и "Love is". Исследовали 3 порции стимулированного секрета правой околоушной слюнной железы, который собирали при помощи специальной модифицированной нами капсулы в течение 15 мин. Первая порция - натощак без чистки зубов; вторая порция - после жевания изучаемой резинки в течение 15 мин; третья порция - через 45 мин после жевания. Контроль - 3 порции слюны, собранные без использования жевательной резинки: 1 - натощак, 2 - через 15 минут, 3 - через 45 минут после первой. В качестве стимулятора слюноотделения использовалась пшеничная булка массой 50 г.

Результаты исследований представлены в таблице
Данные, приведенные в таблице показывают, что одни жевательные резинки усиливают секрецию лизоцима, а другие, наоборот, ее снижают. Любые достоверные изменения активности лизоцима свидетельствуют о негативном влиянии исследуемого средства на секреторную функцию слюнных желез. Следовательно, их употребление может вызвать патологию верхних отделов пищеварения. Пример определения активности лизоцима у обследуемого Б. После сбора секрета правой околоушной слюнной железы по указанной схеме у обследуемого Б определяли активность лизоцима в контроле и эксперименте с жевательной резинкой "Dirol". Исследуемые образцы слюны разводили 0,067 М фосфатным буфером в соотношении 1: 9. К 2,0 мл субстрата (суспензии тест-штамма Micrococcus lysodeikticus) добавляли 0,5 мл раствора слюны. Измерения начинали непосредственно после внесения всех компонентов в смесь и через 10 мин инкубации при 37^oC. В контроле и эксперименте исследовали по 3 пробы слюны. Показатели начальной и конечной оптической плотности спектрофотометра вносились в лабораторный журнал и были следующими.

В контроле:
D₀₁ = 0,235; D_K1 = 0,17; D₀₂ = 0,234; D_K2 = 0,167; D₀₃ = 0,234; D_K3 = 0,169.

В эксперименте:
D₀₁ = 0,233; D_K1 = 0,166; D₀₂ = 0,237; D_K2 = 0,158; D₀₃ = 0,236; D_K3 = 0,169.

Расчет активности лизоцима производили по вышеприведенной формуле. Пример расчета активности лизоцима в первой пробе слюны, собранной в эксперименте:
АЛ=(0,233-0,166)•200 = 0,067•200 = 13,4 ед/мл/мин.

Исследованием установлено, что у обследуемого Б активность лизоцима слюны в контроле во всех пробах составила 13 ед/мл/мин, а в эксперименте в первой пробе 13,4, во второй - 15,8, в третьей -15 ед/мл/мин. Данные эксперимента показывают, что использование жевательной резинки "Dirol" изменяет активность лизоцима в секрете околоушных слюнных желез у обследуемого Б.

Способ рекомендуется для исследования функциональной деятельности слюнных желез и протективных свойств слюны при различных патологических процессах в ротовой целости, а также для изучения влияния гигиенических средств ротовой полости и пищевых продуктов на антимикробные свойства слюны с целью оценки качества употребляемой продукции.

Использование подобранных научнообоснованных гигиенических средств ротовой полости позволит предупредить патологию органов полости рта и снизить заболеваемость желудочно-кишечного тракта за счет отмены некоторых гигеинических средств, оказывающих негативное влияние на секреторную функцию слюнных желез.

Изобретение относится к области медицины, а именно к стоматологии, и может быть использовано для исследования функциональной деятельности слюнных желез и протективных свойств слюны при различных патологических процессах в ротовой полости, а также для изучения влияния гигиенических средств ротовой полости и пищевых продуктов на антимикробные свойства слюны с целью оценки качества употребляемой продукции. Определяют начальную оптическую плотность в растворе смеси слюны, разведенной в 15 раз, с микрококком, после чего смесь термостатируют в течение 10 мин и вновь измеряют оптическую плотность, а затем определяют активность лизоцима (АЛ) по формуле АЛ = (Д_О - Д_К) • 200, где Д_О - начальная оптическая плотность смеси; Д_К - конечная оптическая плотность смеси; 200 - коэффициент пересчета. Способ прост в исполнении и позволит предупредить патологию органов полости рта, снизить заболеваемость желудочно-кишечного тракта за счет отмены некоторых гигиенических средств, оказывающих негативное влияние на секреторную функцию слюнных желез. 1 табл. , 1 ил.

Способ определения активности лизоцима слюны, включающий выращивание микрококка на агаре и подготовку взвеси с применением фосфатного буфера, отличающийся тем, что определяют начальную оптическую плотность в растворе смеси слюны с микрококком в разведении 1 : 15, затем смесь термостатируют в течение 10 мин и вновь измеряют оптическую плотность, а затем определяют активность лизоцима (АЛ) по формуле
АЛ = (Д_о - Д_к) • 200,
где Д_о - начальная оптическая плотность смеси;
Д_к - конечная оптическая плотность смеси;
200 - коэффициент пересчета.