Способ отбора индигенных штаммов бифидобактерий кишечника человека для их включения в состав пробиотических препаратов Российский патент 2023 года по МПК C12N1/20 C12Q1/00 A61K35/745 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в лабораториях биологического и медицинского профиля, решающих вопросы создания пробиотических препаратов медицинского назначения с заранее заданными свойствами.

Многоплановое позитивное воздействие на организм человека позволяет рассматривать бифидобактерии как эффективную основу для конструирования пробиотической продукции различного назначения на основе перспективных штаммов бифидобактерий. Кроме того, представителям рода Bifidobacterium присвоен статус безопасности GRAS (generally recognized as safe), что подтверждает возможность применения штаммов и метаболитов (продуцентов) штаммов бифидобактерий в производстве безопасных продуктов питания, медицинских препаратов и БАД.

Известно много пробиотических продуктов с высоким лечебно-профилактическим эффектом в которых использованы штаммы бифидобактерий [RU 2546251 С2, RU 2317089 С2, RU 2364623 С2, RU 2522282 С2].

Известны способы по отбору перспективных штаммов для их включения в состав пробиотических препаратов: RU 2146288 C1, RU 2315112 С1, RU 2458136 С2, RU 2472854 С2, RU 2780208 С2.

Недостатком предлагаемых способов является то, что при отборе штаммов учитывается только их биологические свойства, не позволяющие оценить особенности выживания (адаптации) штаммов в кишечнике человека, и не учитываются их персистентные характеристики [Бухарин О.В. Персистенция патогенных бактерий. М. 1999. 367 с.].

Аналогов изобретения в патентной и научно-технической литературе не обнаружено.

Технический результат, на достижение которого направлено изобретение заключается в повышении качества пробиотических штаммов бифидобактерий, включаемых в состав пробиотических препаратов, за счет отбора индигенных штаммов бифидобактерий кишечника человека по определению их активности персистентного (адаптивного) потенциала - антилизоцимной активности (АЛА) и биопленкообразования (БПО).

Указанный технический результат в предлагаемом способе отбора индигенных штаммов бифидобактерий кишечника человека для их включения в состав пробиотических препаратов достигается тем, что отбор предварительно полученных изолятов указанных бактерий проводят по оценке их персистентных свойств, а именно антилизоцимной активности и биопленкообразующей способности, причем отбирают бактерии, имеющие значение антилизоцимной активности свыше 1,5 мкг/мл*ОП₄₅₀ и биопленкообразования свыше 0,35 ед. ОП₆₃₀.

Авторами экспериментально установлена новая совокупность значимых характеристик для отбора перспективных индигенных штаммов бифидобактерий кишечника человека для их включения в состав пробиотических препаратов.

Были проведены клинико-микробиологические исследования, направленные на выявление вышеуказанной новой совокупности значимых характеристик, позволяющих отобрать перспективные штаммы бифидобактерий кишечника человека для их включения в состав пробиотических препаратов.

На первом этапе работы был проведен факторный анализ (программный комплекс STASICTICA10) биологических свойств у 260 индигенных штаммов бифидобактерий кишечника человека, имеющие различные показатели микробной обсемененности, отражающие уровень жизнеспособных клеток в кишечнике человека. Вся выборка согласно приказу (Отраслевой стандарт «Протокол ведения больных. Дисбактериоз кишечника» (ОСТ 91599.11.004-2003), утв. Приказом №231 Минздрава РФ от 09.06.03 г. - М.:2003.) была разделена на три группы: первая - штаммы с высоким ПМО (9,0-11,0 КОЕ lg), вторая - со средним ПМО (7,0-8,0 КОЕ lg) и третья - с низким ПМО (менее 7,0 КОЕ lg). Были определены 24 параметра биологической активности исследуемых штаммов бифидобактерий: уровень уксусной (УК), пропионовой (ПК), масляной (МК), изомасляной (изоМК), валериановой (ВК), капроновой (КК) и изокапроновой (изоКК) кислоты, продуцируемые штаммами; антилизоцимная (АЛА), антилактоферриновая (АЛфА), ан-тииммуноглобулиновая активность (AIgA), антипептидная активность (АПА) в отношении ФНО-α, ИНФ-γ, ИЛ-6, ИЛ-17, ИЛ-10, ИЛ-1Ra, антагонистическая активность и уровень иммунорегуляторной активности - способность штаммов влиять на продукцию (ПЦ) лимфоцитами ФНО-α, ИНФ-γ, ИЛ-6, ИЛ-17, ИЛ-10, ИЛ-1Ra. Результаты исследований представлены в таблице 1.

В результате факторного анализа было выявлено два стабильных параметра этих микросимбионтов, определяющих уровень жизнеспособных клеток в кишечнике: АЛА и БПО - значения нагрузок больше 0,8 по фактору 1 (44,5% общей дисперсии).

Для уточнения полученных данных, дополнительно был использован другой метод статистической обработки - системообразующий фактор [О.В. Бухарин, Н.Б. Перунова. Микросимбиоценоз. Екатеринбург, УрО РАН, 2014, с. 68-73], что дало возможность подтвердить информативность признаков. Это определило использование данных персистентных (адаптивных) параметров (АЛА и БПО) микроорганизмов для отбора индигенных штаммов бифидобактерий кишечника человека для их включения в состав пробиотических препаратов.

Для определения АЛА у исследуемых индигенных штаммов бифидобактерий использовали известный способ определения антилизоцимной активности микроорганизмов [RU 2126051 С1]. При оценки полученных данных использованы следующие критерии значений антилизоцимной активности штаммов: при значениях АЛА (мкг инактивированного лизоцима/ мл су-пернатанта штамма* ед. оптической плотности бульонной культуры, мкг/мл*ОП₄₅₀) 0,06<АЛА≤0,5 - низкая активность; 0,5<АЛА≤1,5 - средняя; АЛА>1,5 - высокая активность [Елагина, Н.Н. Факторы персистенции неспорообразующей анаэробной микрофлоры кишечника человека: дис… канд. мед. наук / Н.Н. Елагина. Оренбург, 2001. 128 с.].

Способность к биопленкообразованию (БПО) у исследуемых индигенных штаммов бифидобактерий определяли фотометрическим методом по интенсивности поглощения красителя (кристалл-виолета) микробной биопленкой, адгезированной к поверхности лунки полистиролового планшета [O, Toole G.A., Pratt L.A., Watnick P.I., Newman D.K., Weaver V.B., Kolter R. Genetic approaches to the study of biofilms. Methods Enzymol 1999, 310, P. 91-109].

Для оценки полученных данных использованы следующие критерии уровня БПО штаммов бактерий: при значениях ОП₆₃₀ (оптическая плотность красителя при длине волны 630 нм) 0,091<ОП₆₃₀≤0,18 - низкий уровень БПО; 0,18<ОП₆₃₀≤0,35 - средний уровень БПО и при ОП₆₃₀>0,35 - высокий уровень БПО. [Stepanović S., Vuković D., Jezek P. Influence of dynamic conditions on biofilm formation by staphylococci. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2001; 20 (7): 502].

Суммированные результаты на основании 3 кратного повторения опытов приведены в таблице 2.

Как видно из таблицы 2 высокая антилизоцимная активность (АЛА) и высокий уровень биопленкообразования (БПО) установлены у культур с высоким показателем микробной обсемененности в кишечнике (ПМО): Bifidobacterium longum 505, Bifidobacterium longum 500, Bifidobacterium bifidum 504 и Bifidobacterium bifidum 310, что свидетельствует об их выраженной способности выживать в кишечнике человека, реализуя свой персистентный (адаптивный) потенциал. Геномы штаммов были секвенированы, аннотированы, проведена оценка их безопасности и представлены в международных базах (таблица 3).

Таким образом, данные культуры перспективны для пробиотических целей и могут быть отобраны для их включения в состав пробиотических препаратов.

Способ осуществляется следующим образом.

1. Выделяют культуры индигенных штаммов бифидобактерий из фекалий условно-здоровых лиц, которые в течение 3 месяцев перед выделением культур не должны принимать антибиотические и пробиотические препараты.

2. Выращивают каждый из исследуемых штаммов бифидобактерий в отдельности в жидкой питательной среде при 37°С в течение 48 часов в CO2-инкубаторе.

3. Определяют антилизоцимную активность (АЛА) у исследуемых штаммов бифидобактерий. Для определения АЛА используют известный способ определения антилизоцимной активности микроорганизмов [RU 2126051 С1]. Согласно известному способу бульонные культуры исследуемых штаммов центрифугируют (3200 об/мин в течение 15 минут), суперна-танты отделяют от микробных клеток, пропускают через мембранные фильтры («Millipore», диаметр пор 0,2 мкм). Далее в качестве тест-культуры готовят суточную агаровую культуру Micrococcus lysodeikticus (штамм №2665 ГИСК им. Л.А. Тарасевича), которую растворяют в физиологическом растворе, доводят оптическую плотность (ОП) тест-штамма до 0,300 (0,28-0,32). Параллельно на 1/15М фосфатном буфере (рН=6,2) готовят раствор лизоцима с концентрацией 20 мкг/мл. Согласно способу супернатант бифидобактерий (опыт) и питательный бульон (контроль) объемом по 0,9 мл смешивают с 0,1 мл приготовленного раствора лизоцима и инкубируют 60-120 мин при 37°С. Затем смесь из опытных и контрольных пробирок помещают в полистеролловый планшет и вносят суспензию микрококка. Замер оптической плотности проводят через 30 с и 150 с после внесения в лунки микрококка. Антилизоцимную активность исследуемого штамма рассчитывают по формуле:

, где

А - антилизоцимная активность в микрограммах инактивированного лизоцима/мл супернатанта * ед. оптической плотности бульонной культуры, мкг/мл*ОП₄₅₀: V1 - объем (0,1 мл) раствора лизоцима исходной концентрации (20 мкг/мл); V2 - объем (0,9 мл) супернатанта бульонной культуры исследуемого штамма; С - исходная концентрация лизоцима (20 мкг/мл); Y - оптическая плотность бульонной культуры исследуемого штамма, ед. оптической плотности; ΔD0 - изменение оптической плотности суспензии тест-культуры в опыте между 30 и 150 секунд [D0 (30")-D0 (150")]; ΔDk - изменение оптической плотности суспензии тест-культуры в контроле между 30 и 150 секунд [Dk (30")-Dk (150")]. Антилизоцимную активность выражают в МКГ/МЛ* ОП₄₅₀.

4. Определяют уровень БПО у исследуемых штаммов бифидобактерий фотометрическим методом по интенсивности поглощения красителя (кристалл-виолета) микробной биопленкой, адгезированной к поверхности лунки полистиролового планшета [O, Toole G.A., Pratt L.A., Watnick P.I., Newman D.K., Weaver V.B., Kolter R. Genetic approaches to the study of bio-films. Methods Enzymol 1999, 310, P. 91-109]. В лунки 96-луночных стерильных плоскодонных планшетов одномоментно вносят по 200,0 мкл бульонной культуры бифидобактерий (опыт) или 200,0 мкл питательного бульона (контроль). Все пробы инкубируют в течение 48 часов при 37°С в анаэробных условиях. Для учета биопленкообразования после удаления планктонных (свободноплавающих) клеток микроорганизмов трехкратной промывкой лунок дистиллированной водой (200,0 мкл) и подсушивания планшетов на воздухе (30 мин), осуществляется окрашивание сформированных биопленок внесением в лунки 1,0% раствора красителя (45 мин при комнатной температуре). Отмывание свободного красителя выполняют трехкратной обработкой лунок дистиллированной водой, а экстракцию фиксированного в биопленках красителя проводят добавлением к пробам 200,0 мкл 96,0% этанола. Интенсивность окрашивания последнего, соответствует значению показателя биопленкообразования штаммов бифидобактерий, которое определяют на спектрофотометре (BioTek, США) при длине волны 630 нм. Показатель биоплен-кообразования выражают в условных единицах оптической плотности ОП₆₃₀ (оптическая плотность красителя при длине волны 630 нм).

5. Индигенные штаммы бифидобактерий, имеющие значение антилизоцимной активности свыше 1,5 мкг/мл*ОП₄₅₀ и значение биопленкообразования свыше 0,3 ед. ОП₆₃₀ отбирают как перспективные для их включения в состав пробиотических препаратов.

Пример конкретного выполнения способа.

Из фекалий взрослого субъекта Т., который в течение 3 месяцев не принимал ни антибиотические, ни пробиотические препараты, были выделены индигенные штаммы В. longum 500 (10.0 КОЕ lg), В. bifidum 643 (6.1 КОЕ lg) и В. breve 523 (8.6 КОЕ lg). Каждый из исследуемых штаммов бифидобактерий в отдельности выращивали в жидкой питательной среде при 37°С в течение 48 часов в CO2-инкубаторе. Далее у выделенных культур определили антилизоцимную активность и биопленкообразующую способность.

Характеристика штамма В. longum 500

Происхождение: человеческое

Возраст: 39.

Пол: М

Род: Bifidobacterium

Вид: longum

ПМО 10.0 КОЕ lg

Уровень АЛА 2.0±0.2 мкг/мл*ОП450 (высокая)

Уровень БПО 0.50±0.05 ед. ОП₆₃₀ (высокая)

Характеристика штамма В. bifidum 643

Происхождение: человеческое

Возраст: 39.

Пол: М

Род: Bifidobacterium

Вид: bifidum

ПМО 6.1 КОЕ lg

Уровень АЛА 0.40±0.05 мкг/мл*ОП450 (низкая)

Уровень БПО 0.15±0.02 ед. ОП₆₃₀ (низкая)

Характеристика штамма В. breve 523

Происхождение: человеческое

Возраст: 39.

Пол: М

Род: Bifidobacterium

Вид: breve

ПМО 8.6 КОЕ lg

Уровень АЛА 1.58±0.05 мкг/мл*ОП450 (высокая)

Уровень БПО 0,28±0.01ед. ОП₆₃₀ (средняя)

Согласно заявляемому способу был отобран индигенный штамм В. longum 500, характеризующийся высокими значениями антилизоцимной активности (АЛА) и биопленкообразования (БПО), который может быть использован в дальнейшей работе, направленной на разработку пробиотических препаратов.

Изобретение относится к биотехнологии и медицине. Предложен способ отбора индигенных штаммов бифидобактерий кишечника человека для их включения в состав пробиотических препаратов. Способ предусматривает предварительное получение изолятов указанных бактерий. Отбор бактерий проводят по оценке их персистентных свойств, а именно антилизоцимной активности и биопленкообразующей способности. Отбирают бактерии, имеющие значение антилизоцимной активности свыше 1,5 мкг/мл⋅ОП₄₅₀ и биопленкообразования свыше 0,35 ед. ОП₆₃₀. Индигенные штаммы бифидобактерий, отобранные предложенным способом, характеризуются высоким уровнем жизнеспособных клеток в кишечнике человека. 3 табл., 1 пр.

Способ отбора индигенных штаммов бифидобактерий кишечника человека для их включения в состав пробиотических препаратов, характеризующийся тем, что отбор предварительно полученных изолятов указанных бактерий проводят по оценке их персистентных свойств, а именно антилизоцимной активности и биопленкообразующей способности, причем отбирают бактерии, имеющие значение антилизоцимной активности свыше 1,5 мкг/мл⋅ОП₄₅₀ и биопленкообразования свыше 0,35 ед. ОП₆₃₀.